Name: Hipoksik İnsan Plasentalarından Küçük Hücre Dışı Veziküller Tarafından Fare Kan-Beyin Bariyerinin Bozulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Keşfedin, hipoksik insan plasentasından izole edilen küçük hücre dışı veziküllerin fare kan-beyin bariyerini nasıl bozduğunu. Bu yöntem, preeklampsi ile ilişkili vasküler komplikasyonların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, değerli katkıları için GRIVAS Health'e ait araştırmacılara teşekkür eder. Ayrıca, Kadın Hastalıkları ve Doğum Servisi'nden ebeler ve klinik personel, Şili'deki Hospital de Chillan'a aittir. Fondecyt Regular 1200250 tarafından kuruldu.

Araştırma, Helsinki Bildirgesi'nde ifade edilen ilkelere uygun olarak ve ilgili Etik İnceleme Kurullarının yetkisi altında gerçekleştirilmiştir. Tüm insan katılımcılar, daha önce bildirildiği gibi, numune alınmadan önce bilgilendirilmiş onamlarını verdiler25. Ek olarak, Bío-Bío Üniversitesi Biyoetik ve Biyogüvenlik Komitesi bu projeyi onayladı (Fondecyt hibe 1200250). Hayvan çalışması, deneylerde hayvanların kullanımında üç R'nin temel ilkelerine uygun olarakve ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kılavuzlarının tavsiyelerine göre yürütülmüştür. Hayvanlar, Bío-Bío Üniversitesi'nin Vivarium'unda uygun ortamlarda tutuldu. Taze plasentalar (n=4), elektif sezaryen sonrası 1 saat içinde, term gebelikleri normal olan annelerden (28-31 yaş) (38-41 gebelik haftası) elde edildi. Sezaryen, daha önce bildirildiği gibi Şili'nin Chillan kentindeki Herminda Martin Klinik Hastanesi'nde gerçekleştirildi25. İn vivo modeli uygulamak için 4-6 aylık dişi gebe olmayan fareler (suş C57BLACK/6) kullanıldı. Üç deney grubuna ayrıldılar: (1) kontrol (tedavi olmadan), (2) normoksiden sEV'lerle tedavi edildi (sEVs-Nor) ve (3) hipoksik kültürlenmiş plasentalardan (sEVs-Hyp) sEV'lerle tedavi edildi, BBB'nin bozulmasını değerlendirmek için kullanıldı in vivo25. Enjekte edilen tüm çözeltiler sterildi. Ayrıca, sEV'lerin hazırlanması, kontaminasyonu önlemek için aseptik koşullarda ve sınıf II biyogüvenlik başlığı altında gerçekleştirildi.
1. Plasental kültür eksplantları
<ol><li>Normal gebelik plasentalarının eksplantlarını çıkarmak için, Miller ve ark. 200536.</li>
	<li>Sterilize edilmiş forseps kullanarak pıhtıları insan plasentasının bazal plakasından dikkatlice çıkarın. 10 g'lık bir nihai doku ekstraksiyonu elde etmek için küçük eksplantları ekstrakte edin.</li>
	<li>Plasenta eksplantlarının plasentanın maternal kısmının dört çeyreğinden çıkarıldığından emin olun. Devitalize doku ve kalsifiye alanların dışlandığından emin olun.</li>
	<li>Plasenta dokusunu manipüle etmek için, bunu buz üzerinde, steril koşullar altında ve bir biyogüvenlik kabini içinde yapın.</li>
	<li>Mümkün olduğunca fazla kanı çıkarmak için eksplantları (en az üç kez) bol miktarda (beş hacim eksplant) soğuk (4 °C) fosfat tampon çözeltisi (PBS 1x, pH 7.4) ile yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında santrifüjleyin (10 dakika boyunca 252 x g ).</li>
	<li>% 2 fetal sığır serumu, 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş 20 mL kültür ortamında 10 g yıkanmış eksplantı yeniden süspanse edin (bkz.</li>
	<li>Süspansiyonu 100 mm'lik bir kültür kabına koyun. Eksplantları 37 °C'de %21 oksijen ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde 2 saat bekletin.</li>
	<li>Bundan sonra, eksplantları 1x PBS ile 37 ° C'de (üç kez) tekrar yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında santrifüjleyin (10 dakika boyunca 252 x g ).</li>
	<li>Ayrıca, dokuyu daha önce nanopartiküllerden arındırılmış 20 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. NOT: Nanopartikül tükenmesi için ultrasantrifüjleme (oda sıcaklığında 18 saat boyunca 120.000 x g ) ve mikrofiltrasyon (0.22 μm filtre) gerçekleştirin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş eksplantları iki kültür kabına (100 mm) bölün. Her kültür kabı 10 mL resüspanse eksplant içermelidir.</li>
	<li>Bundan sonra, plasental eksplantlar içeren tabaklardan birini standart kültür koşullarında (% 8 oksijen ve% 5 CO2 ile 37 ° C), diğerini ise% 1O2 ile hipoksik bir odaya yerleştirin. NOT: (İSTEĞE BAĞLI) Doku canlılığının analizi, başka bir yerde tarif edildiği gibi aynı doku ekstraksiyonları ve 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür testi (MTT testi) kullanılarak gerçekleştirilebilir37,38. MTT değerlerini normalleştirmek için eksplant homojenatlarında ölçülen toplam protein konsantrasyonunu kullanın.</li>
	<li>Kültürde 18 saat sonra, eksplantların şartlandırılmış ortamını yeni bir 15 mL'lik tüpe hasat edin. NOT: Bu adımda, şartlandırılmış ortam uzun bir süre (haftalar) boyunca dondurulabilir (-80 °C).</li>
</ol>2. Plasental kaynaklı sEV izolasyonu
<ol><li>Daha önce yayınlanmış raporları25,39 izleyerek diferansiyel santrifüjleme ve mikrofiltrasyon protokolünü kullanarak sEV'leri şartlandırılmış ortamdan izole edin.</li>
	<li>Hasat edilen şartlandırılmış ortam için sıralı santrifüjleme gerçekleştirin. Santrifüjlerin sıralı adımları (1) 10 dakika boyunca 300 x g , (2) 10 dakika boyunca 2000 x g , (3) 30 dakika boyunca 10.000 x g ve (4) 2 saat boyunca 120.000 x g'dir . Santrifüj oda sıcaklığında gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm bu santrifüjlerde, 20-100 μL'lik bir pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice toplayın ve peleti atın.</li>
	<li>Bittiğinde, son toplanan süpernatanı 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, oda sıcaklığında 18 saat boyunca 120.000 x g'da bir ek santrifüjleme gerçekleştirin.</li>
	<li>Bundan sonra, peleti (plasental sEV'ler içeren) 500 μL PBS'de (pH 7.4) yeniden süspanse ederken süpernatanı atın ve tekrar 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. Son olarak, oda sıcaklığında 3 saat boyunca 120.000 x g'da son bir santrifüjleme gerçekleştirin.</li>
	<li>Daha sonra, peleti (plasental sEV'ler içeren) 500 μL PBS'de (pH 7.4, daha önce sEV'lerden tükenmiş) yeniden süspanse edin ve 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin.</li>
	<li>Numuneleri sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) veya sEVs-Hipoksi (sEVs-Hyp) stoğu olarak etiketleyin. NOT: Daha fazla deney için izole edilmiş sEV'lerin 50-100 μL'lik alikotlarını hazırlayın. Küçük EV'ler -80 °C'de uzun bir süre (aylar) saklanabilir.</li>
	<li>Plasental sEV'leri daha önce bildirildiği gibi boyut, sayı ve sEV protein belirteci ile karakterize edin25. sEV'lerin ideal ortalama partikül çapı 50-150 nm'dir. NOT: sEV karakterizasyonu, CD63, Tsg101, Alix ve HSP70'in pozitif tespitini içerir (yani, eksozomlarla zenginleştirilmiş sEV popülasyonunu karakterize etmek için). Ayrıca, PLAP'ı plasental kökenli bir belirteç olarak kullanın25.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek BCA protein tahlil kitini kullanarak sEVs çözeltisindeki toplam protein miktarını ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Şekil 1 , plasental eksplant kültürüne ve hücre dışı vezikül izolasyonuna genel bir bakış göstermektedir.</li>
</ol>3. Fare enjeksiyonu
<ol><li>Hayvanı% 5 izofluran dağılımına sahip bir anestezik indüksiyon odasında uyuşturun (Malzeme Tablosuna bakınız). Anestezi seviyesini bir ayak parmağı tutamıyla doğrulayın.</li>
	<li>~40 saniye sonra, fareyi bir yüz maskesi kullanarak anestezi sistemine koyun ve% 2 izofluran anestezi seviyesini koruyun.</li>
	<li>Ardından, hayvanı 28 °C oda sıcaklığında bir ısıtma platformuna (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin. Gözleri yapay gözyaşlarıyla yağlayın.</li>
	<li>Enjekte etmeden önce, plasental sEV'leri (200 μg toplam protein) fosfat tamponu (pH, 7.4) ile 70 μL'lik bir nihai hacme ulaşana kadar seyreltin.</li>
	<li>Enjeksiyon alanını% 70 etanol ve pamuklu çubuklar kullanarak dezenfekte edin. sEV solüsyonunu enjekte etmek için 30 G iğneli bir insülin şırıngası kullandığınızdan emin olun. NOT: Şırınga, fizyolojik bir sıcaklık elde etmek için 5 dakika boyunca ısıtma platformuna yerleştirilebilir.</li>
	<li>Ardından, çözeltiyi dış juguler damara enjekte edin. Bu adım özel eğitim gerektirir. NOT: Prosedür dikkatli bir şekilde yapılmalı, iğne yavaşça geri çekilmeli ve kan reflü kanıtına nazikçe aspire edilmelidir.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen bölgeye kuru bir pamuklu çubukla ~15 saniye boyunca hafif basınç uygulayın. Bundan sonra, hayvanları kendi kafeslerine geri koyun.</li>
	<li>15 dakika boyunca bilinç ve davranışı değerlendirdiğinizden emin olun. Bilinç başarısının bir göstergesi, toplam motor aktivitenin hayvan iyileşmesidir. NOT: Hayvan kafeslerinde sıcaklığın sıcak tutulduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Hızlı murin koma ve davranış ölçeği (RMCBS)
<ol><li>Hayvanların nörolojik ve refah parametrelerini değerlendirmek için RMCBS'yi kullanın40. NOT: RMCBS, operatör müdahalesi nedeniyle minimum hayvan stresi ile hızlı bir değerlendirmeye (~ 3 dakika) izin verir. RMCBS'nin on parametresi vardır (her puan 0-2'dir).</li>
	<li>RMCBS ölçeği ile 0 saatte (sEV'leri enjekte etmeden önce) ve enjeksiyondan 3 saat, 6 saat, 12 saat ve 24 saat sonra fare sağlığını değerlendirin. NOT: BBB'nin bozulmasını değerlendirmek için claudin-5 (sEV enjeksiyonundan 6 saat sonra) ve Evan mavi ekstravazasyonu (sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra) analizi yapın (Şekil 2).</li>
</ol>5. Evan'ın mavi ekstravazasyonunun analizi
<ol><li>Plasental sEV enjeksiyonundan sonra (24 saat), fareleri adım 3.1'de tarif edildiği gibi uyuşturun.</li>
	<li>Evan'ın Mavi çözeltisini hazırlayın (% 2, fosfat tampon çözeltisinde seyreltilmiş, 1x) (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Retro-orbital erişim25'i kullanarak, Evan'ın Mavi çözeltisini 2 mL / kg'da enjekte edin.</li>
	<li>Evan'ın mavi solüsyonunun anestezi bakımı altında 20 dakika dolaşmasına izin verin.</li>
	<li>Daha sonra, Evan'ın mavi boyasını dolaşımdan çıkarmak için salin solüsyonu (~ 3 mL,% 0.9, w / v) ile daha önce tarif edilen protokol41'i izleyerek intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin. Bu adım zorunludur. NOT: Bu prosedür için anesteziyi %5'e yükseltin ve derin bir anestezi düzlemini doğrulayın (yani, solunum hızında ciddi azalma).</li>
	<li>Kalbi medial torakotomi ile ortayaçıkarın 41 (Şekil 3).</li>
	<li>Bundan sonra, tüm hayvanı intrakardiyal bir paraformaldehit çözeltisi infüzyonu ile sabitleyin (PBS'de% 4, v / v). NOT: Uygun sabitlemeyi izlemek için kuyruğun sertliğini kontrol edin.</li>
	<li>Ayrıca, fiksasyon tamamlandıktan sonra beyni dikkatlice çıkarın, tartın ve fotoğrafını çekin41. Tüm beyin bir cetvele yakın olacak şekilde fotoğraf çekin42.</li>
	<li>Sonra, beyni bir beyin faresi dilimleyicisine koyun (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Beyni, beyincik de dahil olmak üzere (her bölüm 100 μm) dokuz bölüme ayırın.</li>
	<li>Diseksiyondan sonra, beyin dilimlerinin görüntülerini stereo zoom mikroskobunda görselleştirin ve yakalayın (bkz.</li>
	<li>ImageJ yazılımını kullanarak Evan'ın mavi ekstravazasyonunu ölçmek için yakalanan görüntüleri kullanın (bkz. NOT: Evan'ın mavi boyasının varlığını analiz etmek için, beyin bölümünün pozitif kontrolünü kullanarak Evan'ın mavi değerlerini ayarlayın (boya enjekte edilmiş ancak intrakardiyal perfüzyon olmayan bir hayvan kontrol hayvanından). Pozitif kontrolden ulaşılan Evan mavisi değerleri, mavi kanalın yoğunluk histogramında genellikle 75 ile 110 arasındadır (Şekil 4).</li>
	<li>Gözlemci yanlılığını önlemek için beyin görüntülerinin ilgili deney grubu tarafından körü körüne analiz edildiğinden emin olun. Alternatif olarak, Evan'ın mavi ekstravazasyonunu beyin homojenizasyonu ve ardından spektroskopi43 ile ölçün. NOT: Ayrı deneylerde, sEV'lerin enjekte edildiği farelerden (6 saat) yeni izole edilmiş beyinleri kullanarak, BBB44'ün sıkılığında yer alan kritik bir sıkı bağlantı olan claudin 5'in (CLND-5) protein seviyelerini analiz edin (bkz.</li>
</ol>

Hipoksik İnsan Plasenta Kaynaklı sEV'lerin Neden Olduğu Murin BBB Bozulmasının Değerlendirilmesi

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, hipoksik koşullarda kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV'lerin kemirgen kan-beyin bariyerinin bozulması üzerine ortaya çıkan potansiyel zararlara ilişkin yeni bilgiler ortaya koymaktadır. Patolojik mekanizma, arka beyin bölgesinde CLND-5'te bir azalmayı içerir25.
Önceki araştırmalar, preeklampsili bireylerden alınan plazma-sEV'lerin in vitro modeller kullanılarak çeşitli organlarda endotel disfonksiyonuna neden olduğunu ortaya koymuştur46,47. Bu araştırma özellikle kan-beyin bariyerini inceledi ve hipoksi ile kültürlenmiş plasentadan izole edilen ve bu hayati bariyeri bozan sEV'lere yeni bir bakış açısı sundu. Bu keşifler, sEV'lerin preeklampsi gibi hem normal hem de patolojik senaryolarda plasenta ve beyin arasında bir iletişim kanalı olarak hizmet edebileceği yeni bir araştırma alanı sunmaktadır.
Sunulan protokol basittir, ancak birkaç kritik adımdan bahsetmek gerekir. Bu protokol, doğumdan sonraki 1 saat içinde taze plasentalar gerektirir. Ayrıca doku bozulmasını önlemek için kültür periyodunun 24 saatten fazla uzatılmamasını tavsiye ediyoruz. Bu protokol, fare plasentaları tarafından üretilen sEV'lerden kaynaklanan potansiyel kontaminasyonu azaltır. Evan'ın mavi ekstravazasyonunun dijital analizi zaman alıcıdır. Ayrıca, Evan'ın mavi lekesi beyin kesitinden sonra daha az belirgindir. Bu nedenle, pozitif bir kontrol kullanarak mavi aralığı tanımlamak için bir ilk kurulum önerilir. Evan'ın mavi enjeksiyonuna maruz kalmayan bir farenin beyni gibi negatif bir kontrol de kullanılabilir. Potansiyel gözlemci yanlılığını önlemek için deney gruplarının kör analizi zorunludur.
Bu protokol sırasında çeşitli zorluklar ortaya çıkabilir. Önemli bir sınırlama, hem insan plasentalarından hem de enjekte edilen farelerden kaynaklanan biyolojik değişkenlikte yatmaktadır. Evan'ın mavi ekstravazasyon deneylerinin tekrarlanabilirliğini sağlamak için, insan plasentalarından izole edilen sEV dozlarının oluşturulması önerilmektedir. 200 μg'lık bir toplam protein dozu seçtik; bununla birlikte, bu miktar vezikül saflığına, juguler enjeksiyonun etkinliğine, Evan'ın mavi uygulamasına, dolaşım sisteminden temizlenmesine ve en azından içerikleri göz önüne alındığında sEV'lerin biyolojik etkisine bağlı olarak dalgalanabilir.
İnsan plasentasından gelen sEV'lerin kan-beyin bariyerini bozabileceği hücresel mekanizmalar, ek deneyler gerektirir. Bununla birlikte, bu yöntem, plasenta ve beyin arasındaki potansiyel iletişime işaret ederek daha fazla araştırmayı garanti eden alaka düzeyine sahiptir. Bu nedenle, sEV'lere ve bunların kan-beyin bariyeri ile etkileşimlerine ve kargolarının nöronal dokular üzerindeki etkisine odaklanan gelecekteki araştırmalar teşvik edilmektedir. Kan-beyin bariyeri bozukluğunun anne beyni için kalıcı sonuçlara yol açıp açmadığı daha fazla incelemeyi gerektirir.

Preeklampsiye bağlı maternal ölümlerin yaklaşık% 70'i, bozulmuş plasentasyon süreçleri, maternal sistemik endotel disfonksiyonu ve ciddi vakalarda çoklu organ yetmezliği 1,2 ile karakterize hipertansif bir gebelik sendromu, akut serebrovasküler komplikasyonlarla ilişkilidir 3,4. Anne ölümlerinin çoğu düşük ve orta gelirli ülkelerde meydana gelmektedir5. Bununla birlikte, preeklampsi ile ilişkili serebrovasküler komplikasyonların klinik ve epidemiyolojik önemine rağmen altta yatan mekanizmalar hala belirsizdir.
Öte yandan, hücre dışı veziküller (EV'ler) (çap ~ 30-400 nm), maternal-plasental etkileşim de dahil olmak üzere dokular ve organlar arasındaki hücreler arası iletişimin temel aracılarıdır6. Dış yüzeydeki proteinlere ve lipitlere ek olarak, EV'ler içinde kargo taşır (proteinler, RNA ve lipitler). EV'ler (1) eksozomlar (çap ~50-150 nm, küçük EV'ler (sEV'ler) olarak da adlandırılır), (2) orta/büyük EV'ler ve (3) boyut, biyogenez, içerik ve potansiyel sinyal fonksiyonuna göre farklılık gösteren apoptotik cisimler olarak kategorize edilebilir. EV'lerin bileşimi, kaynaklandıkları hücreler ve hastalık tipi7 tarafından belirlenir. Sinsityotrofoblasttan türetilen EV'ler, gebelikte plasenta kaynaklı dolaşımdaki küçük EV'leri (PDsEV'ler) tespit eden plasental alkalen fosfataz (PLAP)8,9 eksprese eder. Ayrıca, PLAP, PDsEVs kargosundaki değişiklikleri ve bunların preeklampsi ile normotansif gebeliklerdeki etkilerini ayırt etmeye yardımcı olur 10,11,12,13,14,15.
Plasenta, preeklampsi16 patofizyolojisinde veya bu hastalıkla ilişkili serebral komplikasyonlarda gerekli bileşen olarak kabul edilmiştir 17,18,19. Bununla birlikte, bu uzak organın beyin dolaşımında değişikliklere nasıl neden olabileceği bilinmemektedir. sEV'ler, biyoaktif bileşenleri donörden alıcı hücrelere aktarma kapasiteleri nedeniyle hücreden hücreye iletişimde çok önemli roller oynadığından 6,20,21, giderek artan sayıda çalışma, plasental sEV'leri beyin endotel hücreleri21,22,23,24 dahil olmak üzere maternal endotel disfonksiyonunun oluşumu ile ilişkilendirmiştir25,26preeklampsili kadınlarda. Bu nedenle, beyin endotel fonksiyonunun tehlikeye girmesi, preeklampsi ile ilişkili serebrovasküler komplikasyonlarda kritik bir bileşen olan kan-beyin bariyerinin (BBB) bozulmasına yol açabilir 3,27.
Bununla birlikte, preeklampsi28 olan kadınların serumuna maruz kalan sıçan serebral damarları veya preeklampsi29 olan kadınların plazmasına maruz kalan insan beyni endotel hücreleri kullanılarak yapılan klinik öncesi bulgular, dolaşımdaki faktör(ler)in BBB'nin bozulmasına neden olduğunu bildirmiştir. Yüksek seviyelerde proinflamatuar sitokinler (yani tümör nekroz faktörü)18,28 veya vasküler düzenleyiciler (yani vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF))29,30,31 veya oksidize lipoproteinler (okso-LDL)32,33 gibi oksidatif moleküller gibi preeklampsi sırasında maternal dolaşımda bulunan BBB'ye zarar verme potansiyeline sahip birkaç adaya rağmen, diğerleri arasında34, hiçbiri plasenta ve BBB arasında doğrudan bir bağlantı kurmaz. Son zamanlarda, hipoksik plasentalardan izole edilen sEV'ler, gebe olmayan dişi farelerde BBB'yi bozma kapasitesini göstermiştir25. Plasental sEV'ler, BBB'yi bozma kapasitesi ile listelenen dolaşım faktörlerinin çoğunu taşıyabileceğinden, sEV'ler yaralı plasentayı bağlamak, zararlı dolaşım faktörlerinin taşıyıcısı olmak ve preeklampside BBB'yi bozmak için uygun adaylar olarak kabul edilir.
Bu protokol, hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV'lerin, preeklampsi sırasında serebral komplikasyonların patofizyolojisini anlamak için bir vekil olarak gebe olmayan dişi farelerde BBB'yi bozup bozamayacağını araştırmamızı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Yetişkin fareler beyin kızağı matrisi 3D baskılı</td><td>Açık erişimli dosya</td><td>Yetişkin fareler</td><td>Yetişkin fareler beyin dilimleyici. PLA filamentinde basılmıştır.</td></tr><tr><td>Anti ve beta;-Aktin birincil antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Clon AC-74</td><td>Yükleme kontrolü için antikor (Western blot)</td></tr><tr><td>Anti-Claudin5 birincil antikoru</td><td>Santa cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-374221</td><td>Farelerin sıkı bağlantı proteini CLDN5 için birincil antikor BBB (Western blot)</td></tr><tr><td>BCA protein kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Protein konsantrasyonunu ölçmek için kit</td></tr><tr><td>Kültür ortamı # 200 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>m200500</td><td>Plasental eksplantlar için kültür ortamı</td></tr><tr><td>D180 CO2 inkübatör</td><td>RWD Yaşam bilimleri</td><td>D180</td><td>Eksplantları ve kültürü stabilize etmek için standart inkübatör sEVs-Nor</td></tr><tr><td>Evans mavi boya&nbsp; > %75 10 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129.10G</td><td>Kan beyin bariyeri bozulmasını analiz etmek için boya IN VIVO</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu 500 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Kültür ortamı için katkı büyüme faktörü 200</td></tr><tr><td>Himac Ultrasantrifüj CP100NX</td><td>Himac eppendorf grubu</td><td>5720410101</td><td>1,20.000 x g</td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>> Isofluran için Ultrasantrifüj NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Isofluran x 100 mL</td><td>USP Baxter</td><td>212-094</td><td>Fareler için uçucu inhale anestezi ajanı</td></tr><tr><td>Kit CellTiter 96 Radyoaktif Olmayan&nbsp;</td><td>Promega</td><td>0000105232</td><td> in vitro plasental eksplantların canlılığı için</td></tr> test <tr><td>Fare IgG İkincil antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MO 63103</td><td>CLDN5 için ikincil antikor (western blot)</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalitik</td><td>90278090</td><td>Plasental eksplantlardan konstrüksiyonlu ortamlardan partiküllerin nanoizleme analizi</td></tr><tr><td>Paraformaldehide E %97 çözelti 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11313.22</td><td>Beyin dokusu dilimleri ve intrakardiyal perfüzyon için fiksatif çözelti (bir kez seyreltildiğinde)</td></tr><tr><td>PBS 1 X pH 7.4 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Plasenta eksplantları için yıkama solüsyonu</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin 100x 20 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>Plasental ekzplantlar için antibiyotikler, kültür ortamı</td></tr><tr><td>ProOX C21 Sitosentrik O2 ve CO2 Alt Bölmeli Kontrol Cihazı</td><td>BioSpherix</td><td>SCR_021131</td><td>CO2 regülatör, sEVs-Hyp Sodyum Tiyopental için kapalı odada Hipoksiyi indüklemek için</td></tr> 1 <tr><td>g</td><td>Chemie</td><td>7061</td><td>insani ötenazi ajanı</td></tr><tr><td>Somnosuite düşük akışlı anestezi sistemi</td><td>Kent Scientifics</td><td>SS-01</td><td>Küçük kemirgenler için izofluran buharlaştırıcı</td></tr><tr><td>Cerrahi Isınma platformu</td><td>Kent Scientifics</td><td>A41166</td><td>Farelerde bakım anestezisi için ısıtma platformu</td></tr><tr><td>Şırınga Filtreleri, Politetrafloroetilen (PTFE), Hidrofobik, 0.22 ve mikro; m, Steril, 25 mm</td><td>Güney laboratuvar gereçleri</td><td>10026</td><td>Plasental eksplantlardan hasat edilen konsisyonlu ortamın filtrasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Masaüstü Yüksek Hızlı Mikro Santrifüjler&nbsp; HITACHI himac CT15E/CT15RE</td><td>Hitachi tıbbi sistemler</td><td>6020</td><td>Konsisyonlu ortamın seri santrifüjleri < 1,20, 000 x g</td></tr><tr><td>Trinoküler stereomikroskop transmided ve yansıtıcı ışık 10x-160x&nbsp;</td><td>Beyin dilimlerini kaydetmek için</td> <td>Center Medical</td><td>2597</td> Stereomikroskop</tr></tbody></table>

hipoksik İnsan plasentalarından küçük hücre dışı veziküller tarafından fare kan-beyin bariyerinin bozulması

Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas

Serebral ödem, iskemik ve hemorajik inme gibi serebrovasküler komplikasyonlar, preeklampsi ile ilişkili maternal mortalitenin önde gelen nedenini oluşturur. Bu serebrovasküler komplikasyonların altında yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, plasental disfonksiyon ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması ile bağlantılıdırlar. Bununla birlikte, bu iki uzak organ arasındaki bağlantı hala belirlenmektedir. Artan kanıtlar, plasentanın hücre dışı veziküller de dahil olmak üzere sinyal moleküllerini maternal dolaşıma saldığını göstermektedir. Hücre dışı veziküller, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda kritik sinyal parçacıkları olarak kabul edilen küçük hücre dışı veziküller (çapı 200 nm'den küçük sEV'ler) ile boyutlarına göre kategorize edilir. Preeklampside, maternal dolaşımda, sinyal fonksiyonu iyi anlaşılmamış olan dolaşımdaki sEV'lerin sayısında artış vardır. Preeklampside veya hipoksiye maruz kalan normal gebelik plasentalarından salınan plasental sEV'ler beyin endotel disfonksiyonuna ve BBB'nin bozulmasına neden olur. Bu protokolde, hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV'lerin (preeklampsinin bir yönünü modelleme) BBB'yi in vivo bozup bozmadığını değerlendiriyoruz.

Bu protokol, hipokside kültürlenen plasentalardan türetilen sEV'lerin gebe olmayan farelerde BBB'yi bozma kapasitesini değerlendirir. Bu yöntem, normal ve patolojik koşullarda plasenta ve beyin arasındaki potansiyel bağlantının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Özellikle, bu yöntem preeklampside serebral komplikasyonların başlangıcında plasental sEV'lerin katılımını analiz etmek için bir vekil oluşturabilir.
sEVs-Nor enjekte edilen farelerin aksine, sEVs-Hyp enjekte edilen fareler, 24 saate kadar nörolojik skorda ilerleyici bir düşüş gösterir (Tablo 1), bu da sEVs-Hyp'nin beyin fonksiyonunu bozma kapasitesini gösterir.
Ayrıca, sEVs-Hyp enjekte edilen grubun fare beyinleri, sEVs-Nor enjekte edilen farelerden veya kontrol farelerinden izole edilenlerden daha yüksek taze ağırlığa sahiptir (sırasıyla 0.51 ± 0.008; 0.46 ± 0.008; 0.47 ± 0.01 g), bu da beyin ödeminin brüt bir göstergesini oluşturabilir45.
Bu bulgu ile uyumlu olarak, bu protokol, Evan'ın mavi ekstravazasyonunu BBB'nin bozulmasının bir göstergesi olarak tanımlamaya izin verir. Bu bağlamda, sEVs-Hyp enjekte edilen farelerden alınan beyinler, sEVs-Nor grubundaki beyinlerden daha yüksek Evan'ın mavi ekstravazasyonuna sahiptir (Şekil 5A).
Her ne kadar sEVs-Hyp tarafından indüklenen BBB'nin altında yatan bozulma mekanizması bu protokolle analiz edilmemiş olsa da, sonuçlar ayrıca sEVs-Hyp enjekte edilen farelerin, BBB'nin en çok etkilendiği alanlarda (yani, arka alanlar) CLND-5'in protein miktarlarında azalma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 5B). Bu nedenle, sEVs-hyp'nin bu kritik endotelyal sıkı bağlantı proteininin fonksiyonunun ekspresyonunu bozması mümkündür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig01v4.jpg"> Şekil 1: Plasental eksplant kültürü ve hücre dışı vezikül izolasyon protokolü. (A) Normal plasenta eksplant kültürleri. (B) Eksplantlar, plasentalı küçük hücre dışı veziküllerin (sEV'ler) biyogenezi için iki koşula dağıtılır. 18 saat boyunca Normoksi (sEVs-Nor,% 8 O2) veya hipoksi (sEVs-Hyp,% 1 O2) (C) Hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için şartlandırılmış ortam hasat edilir, filtrelenir ve santrifüjlenir. (D) sEV'ler ultra santrifüjlerle izole edilir. (E) sEV'ler, nano-izleme analizi ve western blot kullanılarak karakterize edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig01largev3.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig02.jpg"> Şekil 2: Kan-beyin bariyeri bozulma protokolünün in vivo değerlendirmesi. 4-6 aylık gebe olmayan C57BL6/J fareler kullanılır. (A) Dış juguler ven yoluyla, hayvanlara Normoksik (sEVs-Nor,% 8 O2) veya hipoksik (sEVs-Hyp,% 1 O2) plasental kültürlerden izole edilen sEV'ler (200 μg toplam protein) verildi. RMCBS, enjeksiyondan 0-24 saat sonra izlenir. (B) sEV enjeksiyonundan 6 saat sonra, beyinler ekstrakte edilir ve protein ekstraksiyonu için dokuz bölüme ayrılır. Claudin 5 (CLDN5) bu dokuz bölümün homojenatlarında analiz edilir. (C) Evan'ın mavi ekstravazasyon analizi (sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra), dokuz segmentin her birinde retro-orbital ponksiyon enjeksiyonundan sonra analiz edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig03.jpg"> Şekil 3: Evan'ın mavi boyası ve intrakardiyal perfüzyon protokolünün fotoğraf belgeselleri. (A) Fare, Evan'ın mavisini retro-orbital enjeksiyon yoluyla aldı. (Solda) Evan mavisi enjeksiyonundan önce ve (Sağda) hayvan (15 s) enjeksiyondan sonra. (B) Fosfat tampon çözeltisi (1x PBS) ve paraformaldehitin (% 4 PFA) intrakardiyal perfüzyonunu gerçekleştirmek için torakotomi. Sol ventrikül iğnenin ucu ile işaretlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig04.jpg"> Şekil 4: sEV'lerin enjeksiyonundan sonra Evan'ın mavi ekstravazasyonunun analizi. (A) Evan'ın mavi ekstravazasyonunu gösteren tüm beynin temsili görüntüsü. Kesikli çizgi, tüm beyinden elde edilen dokuz bölümü temsil eder. (B) Beyin faresi dilimleyici kullanılarak incelenen beyin. (C) sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra beyin dilimlerinin temsili görüntüleri. Kontrol (CTL), normoksik (sEVs-Nor) veya hipoksik koşullarda (sEVs-Hyp) plasenta. Ölçek çubuğu = 0,4 cm. (D) ImageJ kullanılarak beyin diliminin dijital taslağı. (E) Mavi kanaldaki histogram. 75-110 arasındaki değerler Evan'ın mavi ekstravazasyonu ile ilişkilidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig05.jpg"> Şekil 5: Plasental eksplantlardan izole edilen sEV'ler enjekte edilen farelerde Evan'ın mavi ekstravazasyonu ve claudin-5 seviyeleri. (A) Tüm beyin bölümleri dikkate alınarak Evan'ın mavi (EB) ekstravazasyon yüzdesi. Kontrol (CTL, mavi), normoksik (sEVs-Nor, kırmızı) veya hipoksik koşullarda (sEVs-Hyp, yeşil) plasenta. (B) Dokuz beyin bölümündeki nispi claudin 5 (CLDN5) seviyeleri üç deney grubundan elde edildi. β-aktin yükleme kontrolü olarak kullanılır. Değerler ortalama ± çeyrekler arası aralıktır. Her nokta ayrı bir deney konusunu temsil eder. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.005. p &lt; 0.0001. p &lt; 0.001; ANOVA testi ve ardından Bonferroni son testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Zaman (h)</td>
			<td>Kontrol</td>
			<td>sEVs-Normoksia</td>
			<td>sEV'ler-Hipoksi</td>
			<td>ANOVA</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>18,75 ± 0,250</td>
			<td>18.5 ± 0.288</td>
			<td>18,75 ± 0,250</td>
			<td>Ns</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>18.5 ± 0.866</td>
			<td>17 ± 0,707</td>
			<td>13.25 ± 1.750*α</td>
			<td>0.006</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>19,25 ± 0,750</td>
			<td>17 ± 0,577</td>
			<td>11.75 ± 1.250*α</td>
			<td>0.002</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>18.5 ± 0.645</td>
			<td>16.75 ± 1.109</td>
			<td>13 ± 0.816*α</td>
			<td>0.001</td>
		</tr><tr><td>24</td>
			<td>19.5 ± 0.288</td>
			<td>17,75 ± 0,250</td>
			<td>10.25 ± 0.853*α</td>
			<td>&lt;0.0001</td>
		</tr><tr><td colspan="5">*P &lt; 0.01'e karşı kontrol. αp &lt; 0.01'e karşı sEVs-Normoxia</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra hızlı murin koma ve davranış ölçeği (RMCBS). ±Hayvanların 20'ye en yakın puanları standart iken, puan ne kadar düşükse, CNS'nin işlev bozukluğu o kadar yüksek olur.

Hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen küçük EV'lerin (sEV'ler) (preeklampsinin bir yönünü modelleme) hamile olmayan yetişkin dişi farelerde kan-beyin bariyerini bozup bozmadığını değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.

Hipoksik İnsan Plasentalarından Küçük Hücre Dışı Veziküller Tarafından Fare Kan-Beyin Bariyerinin Bozulması

Cerebrovascular complications, including cerebral edema and ischemic and hemorrhagic stroke, constitute the leading cause of maternal mortality associated ...

Araştırmamız plasenta / beyin iletişimine odaklanmıştır. Küçük hücre dışı veziküllerin kan-beyin bariyerini bozup bozamayacağını ve preeklampsili kadınlarda gözlenen serebrovasküler komplikasyonla ilişkili potansiyel altta yatan mekanizma olup olmadığını araştırıyoruz. Preeklampsili kadınların plazmasının kan-beyin bariyerini bozabileceğini daha önce göstermiştik.Bununla birlikte, plazmada bulunan bu potansiyel zararlı faktörün doğası bilinmemektedir. Laboratuvarımızdan elde edilen sonuçlar, preeklampsili kadınların plazmasından veya hipokside kültürlenen plasentalardan elde edilen hücre dışı veziküllerin kan-beyin bariyerini bozduğunu göstermektedir. Plasental hücre dışı veziküllerin kan-beyin bariyerini nasıl bozduğunun altında yatan mekanizmanın daha fazla araştırılması gerekir.Bu, beyin endotel hücrelerinde sindirim proteinlerinin ekspresyonunu kontrol eden spesifik mikroRNA'lar gibi hücre dışı veziküllerin içeriğinin analizini içerir.

disruption-mouse-blood-brain-barrier-small-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz periventriküler lökomalazi (PVL), prematüre bebeklerde periventriküler beyaz cevher lezyonları ile karakterize baskın beyin hasarı fare modelleri kurdu. Hipoksi / iskemi / sistemik enfeksiyon olmadan PVL birincil nedenleri. Tek taraflı karotis ligasyonu ve / lipopolisakkarid enjeksiyon olmadan hipoksi maruz P6 fareler PVL benzeri lezyonlar oluşturur.

Periventriküler lökomalazi Fare Modelleri

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Prematüre ensefalopatisi, erken doğumdan kaynaklanan yaralanma ile ilişkili merkezi sinir sistemi anormalliklerini kapsar. Bu rapor, koryoamniyoniti taklit eden in utero geçici sistemik hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik lipopolisakkarit uygulamasının (LPS) klinik olarak anlamlı bir sıçan modelini ve enfeksiyöz uyaranların ve plasental underperfüzyonun CNS gelişimi üzerindeki ilişkili etkisini açıklamaktadır.

Prematüre Modelleme Ensefalopati Sıçanlarda İçi amniyotik Lipopolisakkarid ile Prenatal Hipoksi-iskemi kullanma

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Yüksek frekanslı ultrason görüntüleme fetal fare görüntüleme çözümü geliştirdi ve hassas bir non-invaziv kalp geliştirme ve yapısal kusur karakterizasyonu sağlar. Burada özetlenen Protokolü gerçek zamanlı fetal fareler Ekokardiyografi vivo içindegerçekleştirmek için tasarlanmıştır.

Fetal fare bir yüksek frekans ultrason (30/45 MHZ) sistemi kullanarak Imaging kardiyovasküler

Burada açıklanan protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı beyin benzeri endotel hücrelerinin ayırt edilmesinde, enfeksiyon için Neisseria meningitidis'in hazırlanmasında ve diğer moleküler analizler için numune toplanmasında ana adımları vurgulamaktadır.

Neisseria meningitidis İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Endotel Hücrelerinin Enfeksiyonu

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin ayırt edilmesiyle elde edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini türetmek, genişletmek ve kriyoprezerserve etmek ve bir ex vivo modelde kan beyin bariyeri özelliklerini incelemek için uyarlanmış bir yöntemi detaylandırmaktadır.

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5'te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

İşte sabit akış koşulları altında plasental eksplantların kültürlenmesi için bir protokol. Bu yaklaşım, dinamik fizyolojik ortamların replikasyonunu sağlayarak geleneksel statik villöz kültür sistemlerini geliştirir.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Farelere farklı zaman noktalarında iki floresan boya uygulanarak kan-beyin bariyeri (BBB) bozulmasına bağlı boya ekstravazasyonunu görselleştirmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Gliserolün kriyoprotektan olarak kullanılması, aynı numune üzerinde immünohistokimyayı kolaylaştırdı.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Burada, yenidoğan farelerde hipoksiyi indüklemek için değişen oksijen konsantrasyonlarına sahip kontrollü ortamlarda vererek bir protokol sunuyoruz. Doğumda oksijen varyasyonlarına maruz kalan fare modelleri, otizm gibi davranışsal fenotipik değişikliklerin indüksiyonunda yer alan miRNA'ların ekspresyonunu kalıcı olarak değiştirmiştir.

Hipoksi, farelerde otizm spektrum bozukluğunun mendel dışı kalıtımında yer alan miRNA seviyelerini değiştirir

Keşfedin, hipoksik insan plasentasından izole edilen küçük hücre dışı veziküllerin fare kan-beyin bariyerini nasıl bozduğunu. Bu yöntem, preeklampsi ile ilişkili vasküler komplikasyonların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Hipoksik İnsan Plasentalarından Küçük Hücre Dışı Veziküller Tarafından Fare Kan-Beyin Bariyerinin Bozulması

Daha fazla video keşfet