Name: İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglianın İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Keşfedin, yetişkin fare omuriliğinden astrosit ve mikroglia izolasyonunu. Bu yöntem enzimatik parçalama ve hücre sıralama ile omurilik patolojilerini hücresel düzeyde incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RNA analizleri için George Washington Üniversitesi Genomik Çekirdeği'nden Castle Raley'e ve RNA dizileme analizleri için Q2 Lab Solutions'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü [hibe numarası F31NS117085] ve Dr. Robert H. Miller'a Vivian Gill Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, George Washington Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi'nde (Washington, D.C., ABD; IACUC#2021-004). Çalışmada, ticari bir tedarikçiden temin edilen ve George Washington Üniversitesi'nde bulunan 10 haftadan 5 aya kadar erkek ve dişi C57BL / 6J vahşi tip (WT) fareler kullanıldı. Protokol iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur.
1. Omuriliğin hazırlanması
<ol><li>Hayvanları Avertin (steril suda 12.5 mg/mL 2,2,2-Tribromoetanol ve %2,5 2-metil-2-bütanol) kullanarak uyuşturun (bkz. Farelerde ayak parmağı ve kuyruk tutamlarına yanıt verilmediğini onaylayın.</li>
	<li>Periferik kan mononükleer hücrelerini çıkarmak için soğuk 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.<ol><li>Hayvanı sığ bir tepsiye yerleştirin ve plevral boşluğu ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Peristaltik bir pompaya bağlı 23 G'lik bir perfüzyon iğnesini (Malzeme Tablosuna bakınız) sol ventriküle yerleştirin ve pompayı etkinleştirin. Soğuk DPBS kalpten aktıktan sonra, sağ atriyumda küçük bir kesi oluşturun. NOT: Hücre canlılığını artırmak için bu adımda daha hızlı bir perfüzyon hızı tercih edilir. Kan 1 dakikadan kısa sürede boşaltılmalıdır. Karaciğerin temizlenmesi başarılı perfüzyonu gösterir.</li>
	</ol></li>
	<li>Büyük makas kullanarak hayvanın başını kesin ve omurgayıçıkarın 14. Doku durulaması için buz üzerinde bir Petri kabında Ca2+/Mg2+/%0.2 glikoz ile soğuk 1x DPBS'ye daldırın.</li>
	<li>Şu andan itibaren, tüm adımların steril bir ortamda gerçekleştirildiğinden emin olun. Tüm omuriliği izole etmek için hidrolik ekstrüzyon14 kullanın. 18 G'lik bir iğne veCa2 +/Mg2 +/% 0.2 glikozlu soğuk 1x DPBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Omuriliği, tüm dokuyu batırmak için Ca2 + / Mg2 +/% 0.2 glikoz ile yeterli soğuk 1x DPBS içeren buz paketleri üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Meninksleri laminer akış başlığı içinde mikroskop altında dikkatlice çıkarın. Omuriliği buz paketleri üzerinde boş bir Petri kabına aktarın ve 10 numaralı bıçaklı cerrahi neşter kullanarak tüm omuriliği 2-3 mm'lik bölümlere ayırın.</li>
</ol>2. Enzimatik hücre ayrışması
<ol><li>Üreticinin protokolünü izleyerek piyasada bulunan Yetişkin Beyin Ayrışma Kitinden Enzim karışımı 1 ve Enzim karışımı 2'yi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Omuriliğin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için enzimleri çanakta birkaç kez döndürün, ardından 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 5 dakikada bir, doku topaklanmasını önlemek ve reaktiflerin eşit dağılımını kolaylaştırmak için kabı hafifçe döndürün.</li>
	<li>Çanağı inkübatörden çıkarın ve Minimal Esansiyel Ortama (MEM) 350 μL 0.46 mg/mL DNAse I ekleyin (bkz. Hafifçe döndürerek karıştırın.</li>
	<li>1 mL soğuk DMEM/%0.5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ekleyin ve hafifçe döndürerek karıştırın. Tüm içeriği hemen 5 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
</ol>3. Mekanik hücre ayrışması
<ol><li>Bir P1000 pipeti kullanarak, dokuyu üç kez nazikçe ezin ve dokuyu daha da ayrıştırmak için her seferinde doku parçalarının çekildiğinden emin olun. Ardından, tıkalı bir 9" cam Pasteur pipeti kullanarak, işlem sırasında kabarcık oluşmadığından emin olmak için beş kez daha hafifçe ezin.</li>
	<li>5 mL'lik tüpü dik olarak yerleştirin ve dokunun 30 saniye boyunca dibe çökmesine izin verin. Doku yerleştikten sonra, bir P1000 pipeti kullanarak süpernatanı çekin ve 30 μm'lik bir filtreden 15 mL'lik bir konik tüpe geçirin.</li>
	<li>Kalan doku ile aynı 5 mL'lik tüpe 1 mL soğuk DMEM /% 0.5 FBS ekleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak üç kez hafifçe ezin.</li>
	<li>Dokunun 30 saniye boyunca dibe çökmesine izin verin, ardından süpernatanı 30 μm'lik bir filtreden geçirin ve daha önce olduğu gibi aynı 15 mL'lik tüpe toplayın. Adım 3.3 ve adım 3.4'ü bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı bir vakum aspiratörü kullanarak dikkatlice çıkarın ve atın.</li>
</ol>4. Miyelin giderimi
<ol><li>Kalıntı temizleme solüsyonunu kullanarak miyelini çıkarın (DRS) üreticinin protokolünü izleyerek Yetişkin Beyin Ayrışma Kitinde sağlanır. Enkaz çıkarıldıktan sonra, hücre peletine 5 mL soğuk DMEM /% 0.5 FBS ekleyin ve tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. NOT: Hücreler in vitro çalışmalar için kullanılacaksa ve kültürde kalacaksa, bunun yerine önceden ısıtılmış DMEM/%0.5 FBS kullanılmalıdır.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL DPBS /% 0.5 FBS (RNA çalışmaları için soğuk ve in vitro deneyler için sıcak) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve Trypan Blue kullanarak canlılığı değerlendirin. NOT: Hücre konsantrasyonunu artırmak için birden fazla hayvandan alınan hücre süspansiyonları birleştirilebilir.</li>
	<li>Toplam 5 mL hacme kadar DPBS /% 0.5 FBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.</li>
</ol>5. Mikroglia ve astrosit izolasyonu
<ol><li>Hücreleri, üreticinin protokolünü izleyerek anti-CD11b veya anti-ACSA-2 mikro boncuklarla etiketleyin (bkz.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre MS sütunlarını kullanarak hücreleri pozitif seçime göre sıralayın (bkz. Malzeme Tablosu). Sıralamadan sonra, sıralanan hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
</ol>6. İn vitro tahliller için kaplama hücreleri
NOT: Hücreler kaplanmayacaksa ve hemen RNA analizi için kullanılacaksa, 8. adıma geçin.
<ol><li>Hücreleri 1 mL sıcak DMEM /% 0.5 FBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve bir hemasitometre kullanarak canlılıklarını değerlendirin (bkz.</li>
	<li>Hücre konsantrasyonunu 50 μL başına 75.000 hücreye ayarlayın. 24 oyuklu bir plakada her bir Poli-L-lizin kaplı lamel11'e 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
	<li>Hücrelerin lamel üzerine yapışmasını sağlamak için 37 °C'de 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>Her bir oyuğa dikkatlice 450 μL ılık DMEM /% 5 FBS / Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	<li>3 gün sonra, ortamın yarısını 250 μL sıcak DMEM/%5 FBS/Pen-Strep ile değiştirin. Bakım için, ortamı her 4-5 günde bir 500 μL sıcak DMEM/%5 FBS/Pen-Strep ile tamamen değiştirin.</li>
</ol>7. İmmünohistokimya
NOT: İmmünohistokimya analizlerinin, ortam en az bir kez değiştirildikten en az 3 gün sonra yapılması en iyisidir. Bu, döküntülerin çıkarılmasını ve hücrelerin lamel üzerine tamamen yapışmasını sağlar.
<ol><li>Ortamı çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) veya 37 °C'de 15 dakika boyunca ılık DMEM/%5 FBS/%10 normal keçi serumu (NGS) içinde fare önleyici mAb O4 (1:100) ( Malzeme Tablosuna bakın) ile etiketleyin. NOT: Bu adımı atlayın ve hücreler O4 ile etiketlenmeyecekse 7.3 adımına geçin.</li>
	<li>Lamelleri üç kez ılık DMEM/%5 FBS'ye batırarak nazikçe durulayın. Keçi anti-fare 594 IgM (1: 300) ( Malzeme Tablosuna bakın) ılık DMEM/%5 FBS/%10 NGS'ye ekleyin ve karanlıkta 15 dakika RT'de inkübe edin. Ilık DMEM/%5 FBS'de üç kez nazikçe durulayın.</li>
	<li>Hücreleri soğuk %5 asetik asit/metanol ile 4 °C'de 15 dakika sabitleyin. 1x PBS ile üç kez yıkayın, ardından uygun antikorla etiketleyin: anti-tavşan GFAP (1: 500), anti-fare GFAP (1: 500) veya anti-tavşan Iba1 (1: 500) içinde %1 Triton-X100/1x DPBS'de %10 NGS (bkz. RT'de 1 saat inkübe edin. NOT: Lameller zaten O4 ile lekelenmişse karanlıkta saklayın.</li>
	<li>PBS ile üç kez nazikçe durulayın. Uygun ikincil antikorla etiketleyin: anti-fare 594 IgG (1: 500), anti-tavşan 488 IgG (1: 500) (bkz. Karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>PBS ile üç kez nazikçe durulayın. RT'de 1 dakika boyunca DAPI (1: 1000) ile karşı boyayın. PBS ile üç kez durulayın, montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve lamellerin slaytlara monte edilmesi.</li>
</ol>8. RNA ekstraksiyonu
NOT: İdeal olarak, analiz için yeterli RNA'yı çıkarmak için en az 100.000 hücre olmalıdır. Gerekirse, 2-3 omurilikten hücreler birleştirilebilir.
<ol><li>Üreticinin protokolünü izleyerek piyasada bulunan bir RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı çıkarın (bkz. Kitte verilen RW1 yıkama tamponu ile her yıkama adımı için, hücreleri 2 dakika daha yıkama tamponunda bırakın.</li>
	<li>Kalan genomik DNA'yı, üreticinin talimatlarına göre DNaz I kullanarak çıkarın (bkz. RT'de DNaz ile 15 dakika inkübe edin, ardından RW1 tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>RNA verimini artırmak için, elüsyondan önce, numuneleri RT'de RNAse içermeyen suda 10 dakika inkübe edin. Bir biyoanalizör15 kullanarak RNA bütünlüğünü ve miktarını değerlendirin (bkz.</li>
</ol>

Yetişkin Fare Omuriliğinden Astrositlerin ve Mikroglia'nın Verimli Ekstraksiyonu

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li>
<li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons%3A+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic%2C+infectious%2C+inflammatory%2C+and+autoimmune+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712(2019).</li>
<li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia%3A+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).</li>
<li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration%2C+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).</li>
<li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).</li>
<li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li>
<li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175(2022).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226(2017).</li>
<li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li>
<li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

Hiç kimse

Saf, canlı birincil hücrelerin izolasyonu, belirli hücre tiplerinin yapısını ve işlevini araştırmak için çok önemlidir. Yetişkin farede, özellikle omurilikte, mevcut protokoller genellikle yetişkin omuriliğe göre uyarlanmadığından, bu görev önemli zorluklar doğurur10,17. Bu protokol, hücre kültürü, akış sitometrisi, histoloji ve transkriptomik çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarına uygulanabilen verimli ve uygun maliyetli bir yöntem sunar....

Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sisteminde (MSS) hayati roller oynayan, nöronal fonksiyonu düzenlemek, CNS gelişimine katkıda bulunmak, kan-beyin bariyerini korumak ve diğer kritik süreçlere katılmak gibi sorumlulukları kapsayan çok yönlü glial hücrelerdir 1,2,3,4 . Homeostazın korunmasındaki rollerinin yanı sıra, bu glial hücreler ayrıca yaralanma ve onarım mekanizmalarında da önemli bir rol oynar. Mikroglia, hakaret veya yaralanmaları takiben fagositik, inflamatuar ve göç etme yetenekleriyle bilinir 5,6,7. Hastalıktaki astrosit yanıtları eşit derecede çeşitlidir, iltihaplanmaya, glial skarların oluşumuna ve kan-beyin bariyerinin tehlikeye atılmasınakatkıları kapsar 8,9. CNS'deki mikroglia ve astrositlerin zararlı ve onarıcı rolleri hakkındaki anlayışımız artmış olsa da, hem yapılarında hem de işlevlerinde doğal heterojenlik, onları çeşitli bağlamlarda incelemek için sağlam araçlar gerektirmektedir.
Mikroglia ve astrositlerin sağlık ve hastalıktaki rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek, in vivo ve in vitro araştırmaların birleşik bir yaklaşımını gerektirir. İn vivo teknikler, CNS içindeki glial hücreler ve nöronlar arasındaki karmaşık karışmadan yararlanırken, in vitro metodolojiler, tek hücreli fonksiyonları veya spesifik uyaranlar altındaki yanıtları değerlendirirken değerli olduğunu kanıtlamaktadır. Her yöntem benzersiz avantajlar sunar; İn vitro çalışmalar, komşu hücrelerden doğrudan veya dolaylı girdi olmadan bu hücre tiplerinin spesifik rollerini anlamak için gereklidir. Ek olarak, ölümsüz hücre hatlarını kullanan in vitro tahliller, süresiz olarak çoğalma yeteneği, maliyet verimliliği ve bakım kolaylığı dahil olmak üzere belirli faydalar sunar. Bununla birlikte, birincil hücrelerin, hücre hatlarına kıyasla normal fizyolojik tepkileri daha yakından taklit ettiğine dikkat etmek önemlidir. Bu fizyolojik alaka, fonksiyonel testlerde ve transkriptomik analizlerde çok önemlidir.
Özellikle yetişkin fare omuriliğinden birincil hücrelerin elde edilmesindeki zorluklardan biri, örneklerin miktarı ve canlılığında yatmaktadır. Beyinden daha küçük olan ve önemli miktarda miyelin içeren yetişkin omuriliği, benzersiz zorluklar doğurur. Yenidoğan hayvanlardan veya yetişkin fare beyninden saf, canlı glial hücrelerin izolasyonunu detaylandıran birkaç yayınlanmış protokol olsa da 10,11,12,13, bu metodolojiler omuriliğe özgü hastalıkları ve yaralanmaları incelemek için uygun olmayabilir. Bu protokolde, yetişkin fare omuriliğinden saf, canlı mikroglia ve astrositleri verimli bir şekilde izole etmek için kapsamlı bir prosedür sunuyoruz, hücre kültürü ve transkriptomik analizlerde aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırıyoruz. Bu protokol, bu hücreleri 10 haftadan 5 aya kadar olan yetişkin farelerden izole etmek için başarıyla kullanılmış ve koşullu nakavt fareleri, ilaç tepkileri, gelişimsel araştırmalar ve yaşa bağlı modelleri içeren çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda faydasını göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu doku kültürü plakası</td><td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-bütanol, %98</td> <td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür</td><td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>%45 glikoz çözeltisi</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td></td></tr><tr><td>5 mL kapaklı tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Yetişkin Beyin Ayrışma Kiti</td><td>Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA2 Mikroboncuk Kiti</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent </td> C57BL/6J vahşi tip (WT<td>) fareler G2939BA</td><td></td>teknolojiler</tr><tr><td>;</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 & m filtre</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Sayma Odası (Hemasitometre)</td> <td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz</td><td>I Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td></td> RNA saflaştırması için<td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td> 11320074 <td></td></tr><tr><td>DNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antikoru (fare)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>GFAP antikoru (tavşan)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan 488 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Iba1 antikoru (tavşan)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>MACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L Pompa Sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>MS Sütunları</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>O4 Antikoru</td><td>R& D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Tıkalı 9" cam pastör pipeti</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mikro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Royal-tek Cerrahi neşter bıçağı no. 10</td><td>Fisher scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Damar İnfüzyon Seti, 23 G x 19 mm</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vitro tahliller ve transkriptomik Çalışmalar için yetişkin fare omuriliğinden saf astrositlerin ve mikroglia'nın İzolasyonu

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sistemi gelişiminde, yaralanma yanıtlarında ve nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Bu son derece dinamik hücreler, çevresel değişikliklere hızlı tepkiler sergiler ve morfoloji, transkripsiyonel profiller ve işlevler açısından önemli heterojenlik gösterir. Glial hücrelerin sağlık ve hastalıktaki işlevlerine ilişkin anlayışımız önemli ölçüde ilerlemiş olsa da, farklı hücre popülasyonlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için hakaret veya yaralanmalar bağlamında yürütülen in vitro, hücreye özgü analizlere ihtiyaç duyulmaktadır. Yetişkin fareden hücrelerin izole edilmesi, hücrelerin patolojik koşullar altında ve belirli zaman noktalarında analizine izin verdiği için hücre hatlarına veya yenidoğan hayvanlara göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, beyin tutulumu hariç omuriliğe özgü izolasyona odaklanmak, deneysel otoimmün ensefalomiyelit, omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz dahil olmak üzere omurilik patolojilerinin araştırılmasını sağlar. Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için etkili bir yöntem sunarak, fonksiyonel, moleküler veya proteomik aşağı akış çalışmalarında potansiyel uygulamalarla acil veya gelecekteki analizleri kolaylaştırır.

Bu protokolde özetlenen yöntemler, yetişkin fare omuriliğinden saf ve canlı mikroglia ve astrositlerin izolasyonunu sağlayarak, in vitro fonksiyonel veya histolojik testler ve RNA analizi dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırır.
İn vitro çalışmalar için başarılı bir izolasyon, birkaç gün boyunca sürekli hücre proliferasyonuna neden olacaktır. Yetişkin hücreler, yenidoğan hayvanlardan izole edilen hücrelere kıyasla daha yavaş bir proliferasyon hızı se...

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Araştırmamız, klinik öncesi hastalık modellerini kullanarak merkezi sinir sistemindeki, özellikle omurilikteki spesifik hücre popülasyonlarını karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Ve bu hücrelerin patolojik koşullar altında ve farklı zaman noktalarında nasıl etkilendiğini belirlemeye çalışıyoruz. Özellikle merkezi sinir sistemindeki hücreleri analiz etmek zor olabilir, çünkü beyin ve omurilikteki hücreler oldukça karmaşık bir matris oluşturur ve her şey çok sıkı bir şekilde birbirine bağlıdır, bu nedenle bu hücreleri sisteme zarar vermeden izole etmek zor olabilir.Protokolümüz, küçük miyelin açısından zengin yetişkin fare omuriliğinden canlı mikroglia astrositlerini verimli bir şekilde izole ederek omurilik hastalıklarını incelemek için mevcut yöntemlerdeki sınırlamaları ele almaktadır. Bu, aşağı akış analizinde omurilikle ilgili hastalıklar üzerine in vitro araştırmalara olanak tanıyarak çok önemli bir araştırma boşluğunu doldurur. Bu protokol, astrositleri ve mikrogliaları patolojik koşullar altında ve belirli zaman noktalarında analiz etmek gibi çeşitli avantajlar sunar.Aynı zamanda, beyin tutulumu hariç, yalnızca bu yetişkin omurilikten glial hücreleri izole etmeye odaklanır. Bu, araştırmacıların omurilik patolojilerini hücresel düzeyde incelemelerine olanak tanır.

isolation-pure-astrocytes-microglia-from-adult-mouse-spinal-cord-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, yeni doğmuş farelerden saf bir astrosit preparatı elde etme yöntemini açıklıyoruz.

Astrosit İzolasyonu: Fare Kortikal Astrositlerinin Saf Preparatını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Video, yetişkin bir fare beyninin korteksinden mikroglia'yı izole etmek için bir tekniği göstermektedir. İlk olarak, korteks, mikroglia'yı koruyarak nöronları ve diğer glial hücreleri uzaklaştırmak için segmentasyon ve homojenizasyona uğrar. Bunu takiben, hücre süspansiyonu, anti-miyelin manyetik mikro boncuklara ve bir manyetik alana maruz bırakılır, bu da mikroglia ve miyeloid hücreleri miyelin kalıntılarından ve miyelin içeren hücrelerden etkili bir şekilde ayırır.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Keşfedin, yetişkin fare omuriliğinden astrosit ve mikroglia izolasyonunu. Bu yöntem enzimatik parçalama ve hücre sıralama ile omurilik patolojilerini hücresel düzeyde incelemeyi sağlar.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Daha fazla video keşfet