Dorsal lateral genikülat çekirdeğin nöronlarında içsel nöronal uyarılabilirliğin uzun süreli plastisitesinin indüklenmesi
20 Eylül 2024
Burada, ex vivo beyin dilimlerinde tutulan dorsal lateral genikülat çekirdekten röle nöronlarında nöronal içsel uyarılabilirliğin uzun vadeli plastisitesini indüklemek için bir protokol açıklıyoruz.
Araştırmamız, iyon kanallarının beyin bozuklukları üzerindeki fonksiyonel plastisitedeki rolüne odaklanmaktadır. Özellikle, burada görsel talamustan gelen nöronların içsel nöronal uyarılabilirliğin plastisitesine maruz kalıp kalamayacağını inceliyoruz. İlk kez, lateral genikülat çekirdekten gelen nöronların, monoküler yoksunluğu takiben veya bölgesel girdilerin uyarılmasını takiben içsel nöral uyarılabilirliğin plastisitesini ifade ettiğini belirledik.
Sıçanın in vitro görsel talamik nöronlarında nöronal uyarılabilirliğin uzun süreli plastisitesini indüklemek için basit bir yol sunuyoruz. Bu amaçla ex vivo beyin dokusu üzerinde yama-klemp elektrofiziksel kayıtlar ve farmakolojik aletler kullanıyoruz. Sonuçlarımız, beynin diğer subkortikal görsel çekirdeklerinin içsel plastisitesini keşfetme olasılığını artırmaktadır.
Başlamak için, diseksiyon aletlerini ve iki buz platformunu hazırlayın. Dış tanka buz koyun ve vibratomun dilimleme haznesini buz gibi soğuk bir kesme solüsyonu ile doldurun. Ötenazi yapılan farenin başını ilk buzlu platforma yerleştirin ve küçük bir makas kullanarak kafa derisini kaudal yönde kesin, ardından kafatasını iki taraflı olarak kesin.
Künt forseps ve spatula ile kafatasını açın, beyni kafatasından hızla çıkarın ve ikinci buz platformuna yerleştirin. Ön korteksi ve koku soğancıklarını çıkarmak için ön düzlemde bir kesi yapın, ardından arka korteks ve beyinciği çıkarmak için alt kollikulus seviyesinde ikinci bir kesi yapın. Beyin bloğunu, rostral tarafı yukarı bakacak şekilde vibratom plakasına sabitleyin.
İşlem sırasında beyni, dilimleme odasına tamamen daldırılana kadar düzenli olarak sulayın. Vibratomu kullanarak, dorsal lateral genikülat çekirdeği içeren 350 mikrometrelik dilimler kesin. Ardından, bir kalemle korteksi ve hipokampusu orta beyinden nazikçe çıkarın.
Başlamak için, dorsal lateral genikülat çekirdeği veya dLGN'yi içeren sıçan beyin dilimini elde edin ve dik bir mikroskop üzerinde batık bir odaya monte edin. U şeklindeki platin teli dilimin üzerine yerleştirin. Diferansiyel girişim kontrast kızılötesi video mikroskobu kullanarak, yama kelepçesi kaydı için dLGN'de sağlıklı bir nöron tanımlayın.
Mikro manipülatörü kullanarak, yama pipetini sabit pozitif basınçla seçilen nöronun üzerine yerleştirin. Amplifikatörü VC moduna ayarlayın ve 10 milivoltluk bir voltaj adımı enjekte edin. Voltajı eksi 65 milivolt olarak ayarlayın.
Ardından, amplifikatörü CC moduna ayarlayın, erişim direncini telafi etmek için köprüyü dengeleyin ve nöronu eksi 65 milivoltta tutun. Veri toplama için, 0.1 hertz frekansında pozitif bir akım darbesi ile yaklaşık 10 dakikalık bir kontrol periyodu ayarlayın ve nöronal uyarılabilirliği izleyin. Ardından, kısa bir negatif akım darbesi ile nöronun giriş direncini gözlemleyin.
Kontrol periyodundan sonra, 10 dakika boyunca 40 hertz'de iletilen, iki ila beş milisaniye depolarize edici akımın 15 kısa adımıyla uyandırılan 15 sivri uçlu trenler ortaya çıkarır. Her seferinde tek bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için mevcut darbenin genliğini seçin. Son olarak, indüksiyon protokolünden sonra nöronal uyarılabilirliği test edin.
dLGN nöronları tüm hücre konfigürasyonunda kaydedildi ve LTP-IE, iyonotropik glutamat ve GABA reseptör antagonistlerinin varlığında 10 dakika boyunca 40 hertz'de aksiyon potansiyeli ateşlemesi ile indüklendi. Giriş direncinde herhangi bir değişiklik olmaksızın LTP-IE'nin indüksiyonundan 20 ila 30 dakika sonra aksiyon potansiyellerinin sayısında üç kat artış gözlendi.
Genel Bakış
Bu çalışma, ex vivo beyin dilimleri kullanarak dorsal lateral genikulat çekirdekten (dLGN) gelen röle nöronlarının intrinsik nöronal eksitabilitesinin uzun süreli plastisiteyle indüklenmesine yönelik bir protokol tanımlamaktadır. Temel soru, dLGN nöronlarının stimülasyon veya deprivasyon sonrası intrinsik eksitabilitelerinde değişiklikler gösterip gösteremeyeceklerini araştırmaktadır. Sonuçlar, indüksiyon sonrası nöronal eksitabilitede anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Nöronal plastisite
Arka Plan
- İçsel plastisiteyi anlamak, beyin fonksiyonları ve bozukluklarına dair içgörüler edinmek için gereklidir.
- Visual thalamustaki aktarıcı nöronlar, duyusal işleme ve plastisitede rol oynayabilir.
- Önceki çalışmalar, nöronal eksitabilitenin çevresel faktörler tarafından modifiye edilebileceğini göstermiştir.
- dLGN, görsel bilgi aktarımı için kritik bir öneme sahiptir ve bu durum onu plastisite çalışmaları için uygun bir odak noktası haline getirir.
Çalışmanın Amacı
- Görsel talamik nöronlarda intrinsik nöronal eksitabilite plastisitesini araştırmak.
- Bu plastisiteyi indüklemek ve ölçmek için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- İlgili subkortikal görsel çekirdeklerin daha ayrıntılı incelenmesine olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Sıçanın ex vivo beyin kesitleri kullanılmış ve özellikle dLGN hedeflenmiştir.
- Nöronal özellikleri değerlendirmek için patch-clamp elektrofizyolojisi uygulanmıştır.
- Uzun süreli plastisitenin indüklenmesi için yüksek frekanslı aksiyon potansiyelleri kullanılmıştır.
- Kritik adımlar arasında, kontrollü koşullar altında doku hazırlama ve elektrofizyolojik kayıtlar yer almıştır.
Temel Sonuçlar
- İndüksiyon protokolünü takiben aksiyon potansiyellerinde üç katlık bir artış gösterilmiştir.
- Giriş direncinde herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiş olup, bu durum eksitabilitede spesifik bir değişikliğe işaret etmektedir.
- Bulgular, dLGN nöronlarının intrinsik plastisite yeteneğine sahip olduğu hipotezini desteklemektedir.
- Elektrofizyolojik modifikasyonlar, daha ileri araştırmalar için potansiyel yolaklar önermektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, dLGN nöronlarında intrinsik eksitabilite değişikliklerini indüklemek ve ölçmek için bir yöntemi doğrulamaktadır.
- Bulgular, görsel işlemenin anlaşılması ve potansiyel terapötik hedefler açısından önemli çıkarımlar sağlayarak nöronal plastisite mekanizmalarına anlamlı katkılar sunmaktadır.
- Gelecekteki araştırmalar, plastisiteyi incelemek için bu yöntemleri diğer subkortikal bölgelere genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Dorsal lateral geniculate nucleus'taki (dLGN) intrinsik nöronal eksitabilite plastisitesi, duyusal işlemeyi ve adaptif nöral devreleri anlamak için kritik bir kırılma noktasını temsil eder. dLGN röle nöronlarında intrinsik eksitabilitenin uzun süreli potansiyasyonunun (LTP-IE) güvenilir şekilde indüklenmesi ve kantifikasyonu, erken evre MSS ilaç keşfi için mekanistik risk azaltma ve hedef doğrulamaya olanak tanır. Bu yetenek, görsel ve talamik yolak modülasyonuna odaklanan translasyonel nörobilim portföylerindeki öngörüsel güveni destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Talamik röle nöronlarında nöronal iyon kanalı fonksiyonunun ve plastisite mekanizmalarının sorgulanmasını sağlar.
- Sinaptik girdiden bağımsız olan intrinsik eksitabilite değişikliklerini izole ederek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Duyusal adaptasyon ve plastisite ile ilişkili MSS yolakları için fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Patch-clamp elektrofizyolojisi kullanarak nöronal uyarılabilirlik değişimlerini nicelleştirmek için valide edilmiş bir ex vivo sistem sağlar.
- Deney standardizasyonunu ve laboratuvarlar arası karşılaştırılabilirliği destekleyerek, LTP-IE için tekrarlanabilir indüksiyon protokolleri oluşturur.
- İntrinsik plastisite modülatörleri için bir tarama uç noktası olarak aksiyon potansiyeli çıktısının nicel ölçümüne olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Duyusal işleme ve talamik disfonksiyonun hastalıkla ilgili modelleriyle uyumludur.
- Nöronal eksitabiliteyi etkileyen MSS hedeflerinin mekanistik keşfinden preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Görsel yollardaki intrinsik plastisitenin translasyonel biyobelirteçlerini değerlendirmek için bir platform sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, intrinsek eksitabilite plastisite çalışmalarını, erken dönem keşif ile preklinik MSS araştırmalarının kesişme noktasına yerleştirerek, mekanistik hedef doğrulaması ile translasyonel model geliştirme arasında bir köprü kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Talamik röle hücrelerindeki iyon kanalı ve nöronal plastisite mekanizmalarının hipotez testlerini mümkün kılar.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesine uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif eksitabilite okumaları sunar.
- Analitikler: Durum değerlendirmesi için sağlam ve karşılaştırılabilir çıktılar olarak aksiyon potansiyeli frekansı ve giriş direnci sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Intrinsik plastisite bulgularını hastalıkla ilgili duyusal ve talamik modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: MSS hedef ve yol sorgulamaları için yeniden kullanılabilir bir ex vivo analiz platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: MSS hedef doğrulaması ve mekanistik risk azaltmada öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilir Ar-Ge iş akışları için nöronal eksitabilite plastisitesinin indüksiyonunu ve ölçümünü standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Talamik ve duyusal yolları hedefleyen MSS programları için devam/durdur kararlarına bilgi sağlar.
- Portföy Etkisi: Keşif ve preklinik MSS varlıklarının riskle ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Patch-clamp elektrofizyolojisi ve ex vivo beyin dilimi hazırlama konusunda uzmanlık gerektirir.
- Gelişmiş mikroskopi ve elektrofizyolojik kayıt altyapısına erişim gerektirir.
- İndüksiyon protokollerinin ve veri analizinin ekipler arası sıkı bir şekilde standardize edilmesini gerektirir.
- Diğer beyin bölgelerine veya türlere adaptasyon, protokol optimizasyonu gerektirebilir.
- Yorumlamalar ex vivo koşullarla sınırlıdır ve in vivo karmaşıklığı tam olarak yansıtmayabilir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
Obtaining Acute Slices of Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus for Intrinsic Plasticity Studies
2:34
Whole-Cell Patch-Clamp Electrophysiology for Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability Induction in Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus
4:25
Representative Results
