Name: Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 15 s
Description: Öğrenin, fare omurilik mikrogliasını yüksek saflıkta izole etme yöntemini. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile %99 saflık elde ederek nöroinflamatuvar araştırmalarda hassasiyeti artırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT) (702361) tarafından verilen bursla desteklenmiştir. Yazarlar Ph.D. Ulusal Politeknik Enstitüsü Ulusal Biyolojik Bilimler Okulu'nun Biyolojik Kimya Bilimleri programı.

Çalışma, resmi Meksika standardı NOM-062-ZOO-1999'a ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuza uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma için onay, Meksika Çocuk Hastanesi Araştırma, Etik ve Biyogüvenlik Komitelerinden (HIM/2023/006) ve Meksika Eduardo Liceaga Genel Hastanesi Araştırma ve Biyoetik Komitesinden (DI/21/501/04/62) alınmıştır. Yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişen üç C57BL/6 faresi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak havalandırmalı raflarda izole koşullar altında yetiştirildikleri Meksika Çocuk Hastanesi'nden elde edildi.
1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Ca 2+ ve Mg2+ içermeyen PBS'nin yanı sıra Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.</li>
	<li>HBSS çözeltisini 100 μg / mL Liferaz ve 4 μg / mL DNaz (HBSS-LD) ile destekleyin. Çözeltinin fizyolojik pH'ını 7.4 olduğundan emin olun. NOT: Omurilik başına 1 mL çalışma solüsyonu gerekli olacaktır.</li>
	<li>Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için izotonik %90'lık bir çözelti hazırlayın (ticari olarak temin edilebilir, Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>% 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS) PBS ile birleştirerek boyama tamponunu hazırlayın ve karışımı buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozunu (1 g / L) (DMEM) 37 ° C'ye önceden ısıtın.</li>
	<li>DMEM-S'yi hazırlamak için DMEM ortamını %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 200 U/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin ve 500 pg/mL amfoterisin B ile destekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
</ol>2. Omuriliğin diseksiyonu ve hazırlanması
<ol><li>Fareyi 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital ile ötenazi yapın. Farenin göğsünü ve sırtını %70 etanol kullanarak sterilize edin. NOT: Fare diseksiyonuna devam etmeden önce ötenazinin başarılı olduğunu onaylayın.</li>
	<li>Torakolomber bölgeyi tıraş edin ve ekstremiteleri yapışkan bant kullanarak diseksiyon tahtasına sabitleyin.</li>
	<li>Bir neşter kullanarak, oksipitalden sakral bölgeye dorsal orta hat boyunca dikkatli bir kesi yapın (Şekil 2).</li>
	<li>Stereoskopik cerrahi mikroskop yardımıyla, lomber omurgaya ulaşana ve son kostal kemeri belirleyene kadar katmanlar halinde inceleyin. NOT: 13 kostal kemer torasik omurlarda eklemlidir; diseke edildiklerinde, L1 omuru2'den daha üstün görünür hale gelirler.</li>
	<li>Son servikal vertebrayı ve sakrumu belirleyin, ardından omurgayı ayırmak için bir kesi yapın (Şekil 2).</li>
	<li>Diseksiyon forsepslerini kullanarak, omuriliği çıkarmak için omurların dorsal laminektomisini gerçekleştirin (Şekil 3A-D). NOT: İlk iki servikal omur (atlas ve axis) hariç, tüm hareketli omurlar çeşitli bölgelerde (servikal, torasik veya lomber) ortak bir morfolojik tasarımı paylaşır. Her tipik hareketli omurun ön ucunda silindirik bir omur gövdesi bulunur. Vücudun arkasına tutturulmuş, vertebral ark (nöral ark) olarak bilinen, lamina ve dikenli süreçlerden oluşan kemikli bir kemerdir. Bu yapılar arasında vertebral foramenbulunur 15.</li>
	<li>Periferik sinir sistemini oluşturan ve infiltre makrofajlar içerebilen foramina (dorsal ve ventral kökler) yoluyla çıkan sinirleri çıkarın (Şekil 3D). NOT: Yoğunluk gradyan ortamı kirletici astrositleri etkili bir şekilde ortadan kaldırdığı için pia mater veya meninkslerin çıkarılması gereksizdir. Ek olarak, meninkslerin tutulması saflaştırma süresini azaltır ve canlılığı artırır.</li>
</ol>3. Doku sindirimi ve mikroglia izolasyonu
<ol><li>Omuriliği diseksiyon tahtasına yerleştirin ve Vannas makası kullanarak omuriliği 2 mm'lik parçalar halinde kesin ve ortalama 10 parça elde edin.</li>
	<li>Omuriliğin bölümlerini 2 mL düz tabanlı bir mikrotüpe aktarın (Şekil 3E, F).</li>
	<li>1 mL HBSS-LD çalışma solüsyonu ekleyin (adım 1.2). 37 °C'de 25 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir kuvvetlice girdap yapın.</li>
	<li>Her sindirimin içeriğini 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve ardından sindirimi nötralize etmek için% 2 FBS ile 7 mL HBSS ekleyin.</li>
	<li>Kalan dokuyu 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak ezin. Süspansiyonu 50 mL'lik konik bir tüpte 5 x g, 220 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak atın ve peleti 15 mL'lik bir konik tüpte% 2 FBS ile 2 mL HBSS'de yeniden süspanse edin. 2 mL% 90 izotonik yoğunluk gradyan ortamı ile birleştirin. 160 x g, 18 °C'de 25 dakika santrifüjleyin. NOT: Yavaş hızlanmayı kullanın ve freni kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Arayüzü almak ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 220 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>DMEM-S'deki hücreleri yeniden süspanse edin (adım 1.6) ve buz üzerinde saklayın.</li>
</ol>4. Saflığın/canlılığın belirlenmesi
<ol><li>Bir hemositometre odası kullanarak canlı hücreleri ölçmek için,% 0.4 Tripan mavisi lekesi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Ortalama olarak, tek bir fare 4-6 milyon hücre sağlar.</li>
	<li>Canlı hücreleri bir akış sitometresi aracılığıyla ölçmek için, ticari olarak temin edilebilen amin-reaktif floresan boya boyası kullanın (bkz.<ol><li>1 milyon hücreyi 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı (FACS) bir tüpe aktarın. Floresan boyayı PBS ile 1:1000 oranında seyreltin (canlılık çalışma solüsyonunu oluşturur).</li>
		<li>Numuneleri canlılık çözeltisi ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin (adım 1.4).</li>
		<li>Hücreleri 2.4G2 anti-FcRIII/I ile bloke edin (Malzeme Tablosuna bakınız) buz gibi soğuk boyama tamponunda 4 ° C'de 15 dakika boyunca.</li>
		<li>Floresan etiketli monoklonal antikorlar CD45-PerCP ve CD11b-eFluor 450'yi boyama tamponuna (1:300 seyreltmede) ekleyerek antikor boyama kokteylini formüle edin (bkz. NOT: Her iki teknik de mevcut olsa da, sonraki protokole en uygun olanı seçin.</li>
		<li>Numuneleri antikor boyama kokteyli ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Adım 6'daki geçit stratejisinde belirtildiği gibi bir akış sitometresinde 250.000 olay elde edin (Şekil 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. İmmünofloresan boyama
<ol><li>Ön işlemden geçirilmiş bir lamel 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin. NOT: Lamelleri tedavi etmek için, bunları 500 μL L-polilisin (0.01 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi içeren bir Petri kabına koyun ve 1 saat inkübe edin. Daha sonra üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve kurumasını bekleyin.</li>
	<li>500 μL DMEM-S çözeltisi kullanarak 200.000 hücreyi işlenmiş lamel üzerine tohumlayın. 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit (PFA) kullanarak hücreleri sabitleyin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri% 0.2 Triton X-100 ile PBS'de oda sıcaklığında 15 dakika geçirgenleştirin. Daha sonra, lamelleri soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 0.2 BSA ile bloke edin.</li>
	<li>Floresan etiketli monoklonal antikorları (1:300 seyreltmede, Malzeme Tablosuna bakınız) bloke edici çözelti içinde seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kızağa DAPI içeren montaj ortamı uygulayın ve ardından bir lamel ile kapatın. NOT: Slaytlar bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak hemen analiz edilebilir veya -20°C'de 3 aya kadar saklanabilir.</li>
</ol>6. Omurilik mikrogliası için geçit stratejisi
<ol><li>Bir nokta grafiği oluşturun ve canlılık boyamaya ve boş bir floresan kanalına dayalı olarak canlı hücreleri izole etmek için bir kapı oluşturun16. Canlı olmayan hücreleri hariç tutun.</li>
	<li>Enkazı ortadan kaldırmak için ileri ve yan saçılma parametrelerini kullanarak başka bir çizim oluşturun16.</li>
	<li>Ek bir nokta grafiği geliştirin ve mikroglia'yı ayırt etmek için CD11b ve CD45'in ekspresyonunu analiz edin.</li>
</ol>

Fare Omuriliğinden Mikroglia'nın Ekstraksiyonu ve Enzimatik Saflaştırılması

<ol><li>Schröder,, Moser,, Huggenberger, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchr%C3%B6der%2C+H+%22Neuroanatomy+of+the+Mouse%22">Neuroanatomy of the Mouse</a>. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).</li>
<li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+%28P4%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li>
<li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBab%2C+I+%22Microtomographic+atlas+of+the+mouse+skeleton%22">Microtomographic atlas of the mouse skeleton</a>. VIII, First ed, Springer. 205(2007).</li>
<li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+biology%3A+one+century+of+evolving+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li>
<li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li>
<li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).</li>
<li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+IL-36%CE%B3%2FIL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li>
<li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li>
<li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mo.+Sci%22%5BJournal%5D)">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li>
<li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+vertebral+column%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li>
<li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme%3A+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+%CE%B1-+and+%CE%B2-cells%2C+cellular+survival%2C+and+intrainsular+cross+talk%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Beyin homeostazındaki önemi nedeniyle mikroglia çalışması için çok sayıda protokol geliştirilmiştir. Bu yöntemlerde, mikroglia tipik olarak embriyonik veya yenidoğan sıçanların ve farelerin serebral hemisferlerindenkaynaklanır 17. Sınırlı sayıda çalışma, yetişkin farelerin omuriliklerinden mikroglia'nın saflaştırılmasını ele almıştır13,14. Bu teknikler, genellikle Percoll veya OptiPrep kullanılarak gradyan ayırma ile birleştirilen DNAse il...

Omurgalıların tanımlayıcı özelliği, notokordun yerini, omurlar arası disklere bölünmüş, omur adı verilen bir dizi parçalı kemik ile değiştirdiği vertebral kolon veya omurgadır. Bu kemik materyalinin art arda gelmesi, omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilikkanalını şekillendirir 1. Rodentia cinsinde, omurga genellikle yedi servikal omur, on üç torasik omur, altı lomber omur ve değişken sayıda kaudal vertebradanoluşur 2,3. Omuriliğin uzunluğu omurganınkine benzer ve terminal filum, omuriliği sakruma bağlayan sinirsel olmayan bir yapıdır. Ek olarak, sinir lifleri intervertebral foramen1'den çıkar.
Memelilerde merkezi sinir sisteminin gelişimi ve düzgün işlevi, kritik olarak sinir sisteminin mikroglia4 adı verilen yerleşik makrofajlarının aktivitesine bağlıdır. Mikroglia başlangıçta beyinde yerleşik fagositler olarak tanımlansa da, son araştırmalar bu hücrelere birçok dinamik fonksiyon atfetmiştir 5,6. Mikroglia'nın boyutu homeostazda 7 ila 10 μm arasında değişir; Vücuttaki en çok yönlü hücreler arasında kabul edilirler ve sürekli değişen çevrelerine morfolojik ve işlevsel olarak uyum sağlayabilirler7. Bu hücreler hem embriyonik hem de yetişkin aşamalarda yüksek heterojenlik sergilerler8,9, yetişkin aşamasında ise uzay-zamansal bağlamlarına göre karmaşık fonksiyonel heterojenlik sergilerler10. Mikroglia'nın heterojenliği ve çoklu işlevleri, omurilik ve beyinde diferansiyel gen ekspresyonu ve davranışına izin verir. Omurilikte CD11b, CD45, CD86 ve CCR9 ekspresyonunun beyne göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir 8,9.
Serebral mikroglia izolasyonu için çoklu protokoller mevcuttur11,12; Bununla birlikte, omurilik mikroglia13,14 için sadece birkaçı mevcuttur. Mikroglia'yı omurilikten arındırmak için bir yöntemin optimize edilmesi, mikroglia fizyolojisini keşfetmeye odaklanan çok sayıda çalışmanın geliştirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol, fare omuriliğinin basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu ve mikroglia'nın saflaştırılmasını tanımlamayı amaçlamaktadır (Şekil 1).

<table><tbody><tr><td>15 mL toplama tüpleri</td><td>Corning, ABD</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 mL mikrotüpler</td><td>Axygen, ABD</td><td>MCT-200-G</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 anti-FcR</td><td>BioLegend, ABD</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>50 mL toplama tüpleri</td><td>Corning, ABD</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (penisilin, streptomisin, amfoterisin b)</td> <td>Gibco, ABD</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antikor CD11b eFluor 450 anti-fare</td><td>eBioscience, ABD</td><td>48-0112</td><td></td></tr><tr><td>Antikor CD45 PerCP anti-fare&nbsp; &nbsp;</td><td>BioLegend, ABD</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>Dengeli tuz çözeltisi (PBS) kalsiyum- magnezyum içermeyen</td><td>Corning, ABD</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Hücre Süzgeci 40 & mu; m</td><td>Corning, ABD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 kuyulu Şeffaf Tedavi Edilmedi&nbsp;</td><td>Corning, ABD</td><td>CLS3736</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dijital Isıtma Sallama Kuru Banyosu&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, ABD</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DUMONT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche, ABD</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ve akut; s Modifiye Kartal ve akut; s Orta-yüksek glukoz (DMEM)&nbsp;</td><td>Merck, ABD</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli tıraş makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS tüp</td><td>Thermo, ABD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>PAN Biotech, Alemania</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi Cytoflex ve nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' S Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Merck, ABD</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Corning, ABD&nbsp;</td><td></td><td></td>15393631</tr><tr><td>Liberase TM&nbsp;</td><td>Roche, ABD</td><td>5401119001</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer odası Sayım Odaları</td><td>Çin</td><td>1103</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Merck, ABD</td><td>17089101</td><td>yoğunluk gradyan santrifüjü&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin çözeltisi&nbsp;</td><td>Merck, ABD</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Neşter No. 25&nbsp;</td><td>HERGOM, Meksika</td><td>H23</td><td></td></tr><tr><td>Snaplock Mikrosantrifüj Tüpleri 2 mL</td><td>Axygen, ABD</td><td>10011-680</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopik mikroskop</td><td>Velab, Meksika</td><td>HG927831</td><td></td></tr><tr><td>Düz cerrahi makas (10 cm)</td><td>HERGOM, Meksika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düz Vannas makası</td><td>HERGOM, Meksika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Merck, ABD</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi Leke% 0.4 & nbsp;</td><td>Merck, ABD</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>DLAB, Çin</td><td>8031102000</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık Kiti</td><td>BioLegend, ABD</td><td>423102</td><td>amin-reaktif floresan boya boyama&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

Vertebral kolon bir omurgalıyı tanımlar ve omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik kanalını şekillendirir. Memeli merkezi sinir sisteminin uygun gelişimi ve işlevi, önemli ölçüde mikroglia olarak bilinen yerleşik makrofajların aktivitesine dayanır. Mikroglia, omurilik ve beyinde farklı gen ekspresyonu ve davranışı sağlayan heterojenlik ve çok işlevlilik gösterir. Çok sayıda çalışma, saflaştırma yöntemlerini kapsamlı bir şekilde detaylandıran serebral mikroglia fonksiyonunu araştırmıştır. Bununla birlikte, farelerde mikroglia'nın omurilikten saflaştırılması kapsamlı bir açıklamadan yoksundur. Buna karşılık, rafine edilmemiş bir ekstraktın aksine, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenazın kullanılması, merkezi sinir sistemi dokularında raporlamadan yoksundur. Bu çalışmada, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden vertebral kolon ve omurilik eksize edildi. Sonraki sindirim, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz kullandı ve mikroglia saflaştırması, bir yoğunluk gradyanı kullandı. Hücreler, CD11b ve CD45 boyama yoluyla canlılık ve saflığı değerlendiren akış sitometrisi için boyandı. Sonuçlar ortalama %80 canlılık ve ortalama %95 saflık verdi. Sonuç olarak, fare mikrogliasının manipülasyonu, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz ve ardından bir yoğunluk gradyanı ile sindirimi içeriyordu. Bu yaklaşım, önemli miktarda omurilik mikroglia popülasyonunu etkili bir şekilde üretti.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65961/65961fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65961/65961fig01large.jpg" target="_blank"...

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

Araştırmamız, beyin ve omurilik gibi farklı patolojiler ve bölgelerde hem pro-enflamatuar davranışlar sergileyebilen mikroglia'nın heterojenliğine odaklanmaktadır. Çeşitli senaryolarda omurilik mikroglia davranışının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamayı amaçlıyoruz. Mikroglia'nın heterojenliği, onları sınıflandırmayı zorlaştırmıştır.Bu yıl, sadece bir pro veya anti-enflamatuar durumun ötesine geçen yeni ve geniş bir sınıflandırma önerildi. Şu anda, nörolojik patolojilerin hayvan modellerinden omurilik mikrogliasını izole etmede yüksek saflık ve jel elde etmek önemli bir deney ve zorluktur. Kronik ağrı sırasında omurilik mikrogliasında yeni bir sitokin sinyal yolu tanımladık.Protokolümüz daha kontrollü ve somatik bir sindirime ve ardından bir yoğunluk gradyanına izin verir. Her ikisi de, mikroglia'nın omurilik, beyin veya embriyolardan saflaştırılması için şu anda kullanılan tekniklere kıyasla astrositler tarafından daha az kontaminasyona neden olur.

rapid-and-efficient-enrichment-of-mouse-spinal-cord-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak fare yavrusu beyinlerinden mikroglia da dahil olmak üzere CD11b hücrelerini izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin dokuları, anti-CD11b antikor kaplı mikro boncuklarla inkübe edilen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için homojenize edilir, ardından CD11b+ hücre popülasyonunu saflaştırmak için manyetik sütun bazlı bir ayırma yapılır.

Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Bu videoda, yetişkin fare omurilik dokusundan birincil karışık glial hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Protokol, dokunun enzimatik sindirimini ve ardından tek hücreli bir popülasyon elde etmek için kırık hücre zarlarının ve miyelin kalıntılarının çıkarılmasını içerir. Hücreler daha sonra karışık glial hücre büyümesi için optimize edilmiş ortamda kültürlenir.

Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Yaralı omuriliklerde mikroglia (MG) ve periferik infiltre makrofajları (Mø) tanımlamak zordur. Bu protokolde, sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø'yu tanımlamak için akış sitometrisi (FCM) kullanıldı. Bu teknoloji, MG ve Mø'nun rolünü anlamak için diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarına da uygulanabilir.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Yaralı Omurilikteki Mikroglia ve Periferik İnfiltre Makrofajların Belirlenmesi

Öğrenin, fare omurilik mikrogliasını yüksek saflıkta izole etme yöntemini. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile %99 saflık elde ederek nöroinflamatuvar araştırmalarda hassasiyeti artırın.

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Daha fazla video keşfet