Name: In vivo (İn canlı) Dorsal Kök Gangliyon Nöronlarının Somatik ve Viseral Uyaranlara Yanıtının Kalsiyum Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Keşfedin, farelerde lumbar-6 dorsal kök gangliyon nöronlarının somatik ve viseral uyaranlara yanıtını in vivo kalsiyum görüntüleme ile nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, akupunkturun analjezik etkilerini anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (No. 2022YFC3500702), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82230123, 82174281) tarafından finanse edilmiştir.

Bu hayvan protokolü, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Yakı Enstitüsü'nün Hayvan Bakımı ve Kullanımı Etik Kurulları tarafından onaylanmıştır ve minimum hayvan kullanımı ve rahatsızlığı sağlamak için Ulusal Sağlık Enstitüleri Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ile uyumludur. Pirt-cre fareleri, Johns Hopkins Üniversitesi'nden (Baltimore, MD) Dr. Xinzhong Dong tarafından nazikçe bağışlandı. Rosa26-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s fareleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Aşağıdaki prosedür, 20-35 g ağırlığındaki farelerin her iki cinsiyeti için optimize edilmiştir. Operasyon geçiren fareler için önerilen yaş 8 ila 14 hafta arasındaydı. DRG nöronlarının ana popülasyonlarını göstermek için ya Pirt-GCaMP6s fareleri gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ya da intratekal olarak viral GECI'ler enjekte edilen normal C57 fareleri benimsenmiştir. Genetik olarak tasarlanmış fareler, intratekal olarak viral GECI'lerle enjekte edildi veya Rosa26-GCaMP fareleri ile çaprazlandı, DRG nöronlarının spesifik popülasyonunu gösterecektir. Protokol boyunca laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske takıldı. Deneyden sonra, farelere CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapıldı.
1. Ameliyat öncesi kurulum
<ol>
	<li>Anestezi ventilasyon cihazının (bkz. Malzeme Tablosu) doğru şekilde kurulduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Görüntüleme sisteminin (bkz. Malzeme Tablosu) önceden açıldığından ve doğru çalıştığından emin olun. 
	NOT: Operasyon ve görüntüleme prosedürleri sırayla gerçekleştirilmiştir, analiz işlemi daha sonra çevrimdışı olarak tamamlanabilir.</li>
</ol>
2. Anestezi
<ol>
	<li>Fareye intraperitoneal olarak bir tribromoetanol çözeltisi enjekte edin (%1,25, 250 mg/kg, bkz. Malzeme Tablosu)13,14,15. Devam etmeden önce anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak değerlendirin.</li>
	<li>Alt sırt bölgesindeki ve ventral servikal kısımdaki saçları tıraş edin.</li>
	<li>Fareyi ısıtma yastığının üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine merhem sürün. 
	NOT: Fare, tüm cerrahi ve kayıt prosedürleri sırasında arka pençe çimdiklenmesine yanıt vermediği sürece anestezi derinliği korunmuştur. Hayvan herhangi bir ağrı belirtisi gösterirse, kas seğirmesini önlemek ve anestezi derinliğini sağlamak için ventilatör uygulandıktan sonra intraperitoneal olarak ek bir 0.2 mL tribromoetanol çözeltisi uygulandı veya intratrakeal olarak %0.5 izofluran verildi.</li>
</ol>
3. Trakeotomi
<ol>
	Göğüs kemiğinden <li>çeneye kadar cerrahi bir bıçak kullanarak boğaz cildinde yaklaşık 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın.</li>
	<li>Kesiği uzatın ve sub-maksiller bezleri nazikçe bir kenara itin, bezlerin altında bulunan digastrik kasların tam olarak açığa çıkmasını sağlayın ve trakeanın ortası boyunca uzunlamasına uzanın.</li>
	<li>Kasların ortasındaki paratrakeal kas sisteminin dikişi görüldüğünde, kas sistemini nazikçe ayırarak ve geri çekerek trakeayı ortaya çıkarın.</li>
	<li>Trakea üzerinde, akciğere doğru yönlendirilmiş trakea kanülünü (dış çap 1.3 mm, uzunluk 13 mm, bir Y-adaptörü ile, bkz. Malzeme Tablosu) barındıracak kadar büyük enine bir kesi oluşturun (Şekil 1A).</li>
	<li>Trakeayı paratrakeal kaslar ve sub-maksiller bezler ile örtün, ardından 5-0 cerrahi dikişler kullanarak çevre dokuları cilde katman katman dikin.</li>
</ol>
4. Bel omurlarının açığa çıkması
<ol>
	<li>Hayvanı ısıtma yastığının üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin.</li>
	<li>Alt sırtta, lomber-5'ten sakral-1 omurlara uzanan yaklaşık 7 cm'lik bir orta hat kesisi oluşturun.</li>
	<li>Longissimus lumborum kaslarını bir kenara bırakarak üç omurun dikenli süreçlerini dikkatlice ortaya çıkarın.</li>
	<li>Bilateral longissimus lumborum, dorsal servikal omurga kasları ve dorsal servikal yarı omurga kaslarının iç kısımlarını bir kenara iterek, omurların ortasındaki kayıt segmenti ile ardışık üç eklem sürecini ve mamillary süreci ortaya çıkarın (Şekil 1B). 
	NOT: Üç omurun eklem süreçleri ve meme süreçleri, omurilik kelepçesinin kayıt sırasında yer değiştirmeden hayvanı sabitlemesine izin vermek için maruz bırakıldı.</li>
</ol>
5. Dorsal kök ganglionunun açığa çıkması
<ol>
	<li>Hayvanı, komşu omurların iki taraflı eklem süreçleri üzerinde dişli bir forseps ile güvenli bir şekilde hareketsiz hale getirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, lomber-6 omurlarının sol veya sağ eklem ve meme süreçlerini çıkarmak için rongeur forseps kullanın.</li>
	<li>Üzerindeki bağ dokularını temizledikten sonra sol veya sağ lomber-6 DRG'yi dikkatlice açığa çıkarın ve sağlam epinöryumu lomber-6 omurlarının sol veya sağ tarafında tutun.</li>
	<li>Açıkta kalan alanları tuzlu suya batırılmış küçük pamuk topları ile kaplayarak maruz kalan DRG'nin aktif koşullarını sağlayın. 
	NOT: Pamuk toplarını, maruz kalan DRG ve çevresindeki dokunun yakınında ince bir kan sızıntısı olmayana kadar değiştirin, çünkü bu, DRG nöronlarının net görüntülenmesini etkileyebilir. Tuzlu suyla ıslatılmış küçük pamuk toplarını, doku sıvılarında kırmızı veya sarı sızıntı kalmayana kadar değiştirin.</li>
</ol>
6. İmmobilizasyon ve ventilasyon
<ol>
	<li>Açıkta kalan lomber-6 DRG ile hayvanı, özelleştirilmiş bir spinal klemp16,17 (Şekil 1C) üzerindeki bir ısıtma yastığına yerleştirin.</li>
	<li>Test sırasında hareketi en aza indirmek için komşu omurların omurgalarında iki kelepçe kullanarak hayvanı sabitleyin (Şekil 1D).</li>
	<li>Tuzlu suyla ıslatılmış pamuk toplarını cerrahi alan yeterince temiz olana kadar değiştirmeye devam edin (Şekil 1E).</li>
	<li>Deney boyunca ventilasyonu ve nabız oksimetresini izleyin. 
	NOT: Özelleştirilmiş omurga kelepçesini kullanarak omurgaları hareketsiz hale getirin ve ardından pedin açısını, mikroskobun objektifi DRG'ye dik olacak şekilde ayarlayın. Açı ayarlayıcıları kullanarak objektifi ve DRG'yi hizalamak için gerekli ayarlamaları yapın.</li>
</ol>
7. Görüntüleme için donanım ve yazılım kurulumu
<ol>
	<li>Özelleştirilmiş spinal kelepçeyi özel olarak tasarlanmış mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 1F,G).</li>
	<li>Konfokal bir mikroskobun 10x/0.32 uzun çalışma mesafeli hava objektif merceğini (Malzeme Tablosuna bakın) görüntüleme için açıkta kalan DRG'nin üzerine yerleştirin (Şekil 1G).</li>
	<li>25 μm/adım ve 512 x 512 veya 1024 x 1024 piksel çözünürlükle sağlam L-6 DRG'nin zaman atlamalı z yığınlarını yakalayın. Tüm DRG'nin bir yığın taramasının süresi, DRG'nin konumunun objektif merceğe dikliği, her bir tarama adımının derinliği ve hızı ve görüntüleme çözünürlüğü gibi faktörlere bağlı olarak 5-15 s arasında değişir.</li>
	<li>DRG'nin XYZT taramasını 1-3 temel durum, 2-3 akupunktur veya viseral kolorektal distansiyon (CRD) uyaranı ve 1-2 uyaran sonrası durumu içeren 4-8 yığınla gerçekleştirin.</li>
</ol>
8. Akupunktur/viseral uyaranlar ve görüntüleme
<ol>
	<li>Görüntülenen DRG nöronlarının en hassas alıcı alanını değerlendirmek için hayvanın alt sırt, arka bacak veya arka pençe bölgelerine fırçalama veya çimdikleme uyaranları uygulayın (Şekil 1H).</li>
	<li>Akupunktur uyaranlarını manuel olarak veya piyasada bulunan bir akupunktur noktası ve sinir stimülatörü (Şekil 1F) ile uygulayın (bkz.</li>
	<li>Kendi kendine yapılan bir hava basıncı göstergesi (Şekil 1H) ile kolorektal distansiyon (CRD) kullanarak viseral uyaranları indükleyin. 
	NOT: Lumbar-6 DRG'nin alıcı alanlarını fırçalayarak veya sıkıştırarak görüntülenen DRG nöronlarının en hassas alıcı alanını test edin. Bu uyaranlar XYZT yığın kaydı sırasında floresan değişikliklerine neden oluyorsa, bu alanlarda alt sırt akupunktur noktası BL25 (Dachangshu)18 gibi akupunktur noktalarını seçin. Lomber-6 innervasyonunun alıcı alanı içinde cilt ve kaslara sahip olan akupunktur noktalarını Şekil 2'de gösterildiği gibi) seçin.</li>
</ol>
9. Veri analizi ve işleme
<ol>
	<li>Somatik veya viseral uyaranları takiben hücre içi kalsiyuma bağlandıktan sonra nöronal GCaMP'nin yeşil floresansındaki artışı ölçerek konfokal bir mikroskop kullanarak uyarılmış kalsiyum yanıtlarını değerlendirin.</li>
	<li>Görünür hücreleri manuel olarak izleyin ve görüntüleme yazılımını kullanarak hücre boyutunu ve bağıl floresan yoğunluğunu belirleyin (Fiji, bkz. Malzeme Tablosu). Küçük, orta ve büyük nöronları, önceki çalışmalara dayanarak sırasıyla <20 μm, 20 ila 30 μm ve >30 μm soma çaplarına sahip olarak tanımlayın17,19.</li>
	<li>Floresan yoğunluğunu, maksimum uyarılmış floresanstaki artışın bazal seviyeye (ΔF/F0) oranı veya maksimum uyarılmış floresansın bazal seviyeye oranı (Ft/F0) olarak ifade edin, burada F0, başlangıç döneminde ölçülen maksimum floresan yoğunluğunu temsil eder.</li>
	<li>Somatik veya CRD uyaranlarını takiben nöronal duyarlılıktaki değişiklikleri değerlendirmek için aktive edilmiş nöronların yüzdesini ve uyarılmış kalsiyum geçişlerinin yoğunluğunu ölçün.</li>
	<li>Bir hücrenin aktivasyonunu, floresan yoğunluğunda (ΔF) bir artış olarak tanımlayın ≥taban çizgisinin %30'u (F0). 
	NOT: Görünür hücreleri izlemeden önce, hücre kenarlıklarını belirlemeye yardımcı olması için görüntülerin parlaklığını maksimum düzeye ayarlayın. Herhangi bir belirsizlik varsa hücreleri izlemeyin. Hiçbir hücrenin gözden kaçmadığından emin olmak için kaydedilen filmi ileri ve geri gözden geçirin.</li>
</ol>

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

<ol><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+tactile+acuity+in+chronic+low+back+pain+is+linked+with+structural+neuroplasticity+in+primary+somatosensory+cortex+and+is+modulated+by+acupuncture+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Reduced tactile acuity in chronic low back pain is linked with structural neuroplasticity in primary somatosensory cortex and is modulated by acupuncture therapy.</a> Neuroimage. 217, 116899(2020).</li>
<li>Wei, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+activates+inhibitory+neural+circuits+in+the+somatosensory+cortex+to+relieve+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture activates inhibitory neural circuits in the somatosensory cortex to relieve neuropathic pain.</a> iScience. 24 (2), 102066(2021).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Referred+somatic+hyperalgesia+mediates+cardiac+regulation+by+the+activation+of+sympathetic+nerves+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Referred somatic hyperalgesia mediates cardiac regulation by the activation of sympathetic nerves in a rat model of myocardial ischemia.</a> Neuroscience Bulletin. 38 (4), 386-402 (2022).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivity+as+an+indicator+of+visceral+inflammation+via+c-nociceptor+axon+bifurcation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivity as an indicator of visceral inflammation via c-nociceptor axon bifurcation.</a> Neuroscience Bulletin. 37 (1), 45-54 (2021).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+population+of+dorsal+root+ganglion+neurons+unravels+novel+mechanisms+of+visceral+pain+sensitization+and+referred+somatic+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity.</a> Pain. 162 (4), 106801081(2021).</li>
<li>Huang, T. Y., Belzer V Fau - Hanani, M., Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+dorsal+root+ganglia%3A+possible+contribution+to+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in dorsal root ganglia: possible contribution to visceral pain.</a> European Journal of Pain. 14 (1), 49.e1-49.e11 (2010).</li>
<li>Wang, Y. L., Su, Y. S., He, W., Jing, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+relieved+visceral+and+referred+hindpaw+hypersensitivity+in+colitis+rats+by+inhibiting+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+sixth+lumbar+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture relieved visceral and referred hindpaw hypersensitivity in colitis rats by inhibiting tyrosine hydroxylase expression in the sixth lumbar dorsal root ganglia.</a> Neuropeptides. 77, 101957(2019).</li>
<li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+diminishes+P2X2+and+P2X3+purinergic+receptor+expression+in+dorsal+root+ganglia+of+rats+with+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture diminishes P2X2 and P2X3 purinergic receptor expression in dorsal root ganglia of rats with visceral hypersensitivity.</a> Neural Regeneration Research. 8 (9), 802-808 (2013).</li>
<li>Spencer, N. J., Hibberd, T. J., Lagerström, M., Otsuka, Y., Kelley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+pain+-+Novel+approaches+for+optogenetic+control+of+spinal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visceral pain - Novel approaches for optogenetic control of spinal afferents.</a> Brain Research. 1693 (Pt B), 159-164 (2018).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+single-fiber+recording+and+intact+dorsal+root+ganglion+with+attached+sciatic+nerve+to+examine+the+mechanism+of+conduction+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure.</a> Journal of Visualized Experiments. 150, e59234(2019).</li>
<li>Ma, C., Nie, H., Gu, Q., Sikand, P., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+responses+of+cutaneous+C-mechanosensitive+neurons+in+mouse+to+punctate+chemical+stimuli+that+elicit+itch+and+nociceptive+sensations+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo responses of cutaneous C-mechanosensitive neurons in mouse to punctate chemical stimuli that elicit itch and nociceptive sensations in humans.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (1), 357-363 (2012).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neuroscience Bulletin. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Yao, L., Ye, Q., Liu, Y., Yao, S., Yuan, S., Xu, Q., Deng, B., Tang, X., Shi, J., Luo, J., Wu, J., Wu, Z., Liu, J., Tang, C., Wang, L., Xu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+swallowing+function+in+a+post-stroke+dysphagia+mouse+model+by+activating+the+motor+cortex+inputs+to+the+nucleus+tractus+solitarii+through+the+parabrachial+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves swallowing function in a post-stroke dysphagia mouse model by activating the motor cortex inputs to the nucleus tractus solitarii through the parabrachial nuclei.</a> Nat Commun. 14 (1), 810 PMID: 36781899; PMCID: PMC9925820 (2023).</li>
<li>Tian, D., Liu, B., Huang, S., Shi, W., Tian, Y., Yang, Y., Zhang, D., Zhang, Z., Bu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+Ileus+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postoperative Ileus Murine Model.</a> J Vis Exp. (209), PMID: 39072642 (2024).</li>
<li>Zhu, X., Li, C., Afridi, S. K., Zu, S., Xu, J. W., Quanquin, N., Yang, H., Cheng, G., Xu, Z. E90 subunit vaccine protects mice from Zika virus infection and microcephaly. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+X+%22Acta+Neuropathol+Commun%22">Acta Neuropathol Commun</a>. 6 (1), 77 PMID: 30097059; PMCID: PMC6086021 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+cluster+firing%2C+a+distinct+form+of+sensory+neuron+activation%2C+drives+spontaneous+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain.</a> Neuron. 110 (2), 209-220 (2022).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor+as+a+new+target+for+electroacupuncture+relieving+comorbidity+of+visceral+pain+and+depression+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor as a new target for electroacupuncture relieving comorbidity of visceral pain and depression of inflammatory bowel disease.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 139(2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron-specific+GPCR+Mrgprs+are+itch+receptors+mediating+chloroquine-induced+pruritus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus.</a> Cell. 139 (7), 1353-1365 (2009).</li>
<li>Chen, G. S., Su, X. L., Liu, Q., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+moxibustion+in+treatment+of+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Acupuncture-Moxibustion%22%5BJournal%5D)">Research progress of moxibustion in treatment of irritable bowel syndrome.</a> World Journal of Acupuncture-Moxibustion. 31 (02), 136-140 (2021).</li>
<li>Scanziani, M., MHäusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+descending+facilitation+of+spinal+sensory+excitatory+transmission+from+the+anterior+cingulate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Top-down descending facilitation of spinal sensory excitatory transmission from the anterior cingulate cortex.</a> Nature Communications. 9 (1), 1886(2018).</li>
<li>Cartarozzi, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+motoneurons+and+adjacent+glia+in+the+ventral+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of motoneurons and adjacent glia in the ventral spinal cord.</a> Journal of Neuroscience Methods. 299, 8-15 (2018).</li>
<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> Journal of Visualized Experiments. 192, e64826(2023).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, e2760(2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+dorsal+root+ganglia+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 3087(2019).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Akupunktur analjezisinin, ağrı bölgelerinden gelen afferent impulslar ile akupunktur noktalarından gelen impulslar arasındaki etkileşimi içeren DRG'deki bütünleştirici süreçler tarafından modüle edildiğine inanılmaktadır. Burada, L6 DRG görüntüleme için ayrıntılı bir prosedür açıklıyoruz. Görüntülemenin avantajları, dikkate değer uzamsal çözünürlük, geniş nöron alanlarının aynı anda yüksek verimli görüntülenmesi olasılığı ve gen hedefleme probları21 kullanılarak belirli hücresel alt tipleri ve hüc...

<a href="https://app.jove.com/t/6596">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/65975">10.3791/65975</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/65975">In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons&#39; Response to Somatic and Visceral Stimuli</a>. The Authors section was updated.

Erratum: In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Geleneksel Çin tıbbının ayrılmaz bir parçası olan Akupunktur, öncelikle kronik iç organ ağrısının hafifletilmesi de dahil olmak üzere ağrı yönetimindeki etkinliği nedeniyle küresel tanınırlık kazanmıştır1. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, akupunktur analjezisinin altında yatan merkezi sinir mekanizmaları hakkındaki bilgilerimiz önemli ölçüde büyümüştür1,2. Bununla birlikte, viseral nosisepsiyonda akupunkturun analjezik etkisini indüklemede dorsal kök gangliyonları (DRG) nöronlarının fonksiyonel rollerini keşfetmeye çok az dikkat edilmiştir. Viseral nosisepsiyon ve akupunktur analjezik çalışmaları, elektrofizyolojik teknikler veya diğer nöral kayıt yöntemleri kullanılarak birincil duyusal nöronlar üzerinde potansiyel olarak gerçekleştirilir3,4. Bu tür araştırmalar, belirli hedef dokulardan veya hedef organlardan gelen somatik ve viseral girdi arasındaki ilişkinin anlaşılmasına yardımcı olur ve akupunktur, iç organ ağrısı, otonom sinir sistemi düzenlemesi ve ilgili tıbbi durumlarla ilgili durumlar hakkında değerli bilgiler sunar.
Somatosensoriyel sistemdeki birinci dereceden nöronlar olan DRG'deki nöronlar, dış çevre ve iç durum hakkındaki bilgilerin elektrik sinyallerine aktarılmasında ve sinyallerin merkezi sinir sistemine (CNS) iletilmesinde önemli rollere sahip birincil duyusal nöronlar olarak adlandırılır. Çok sayıda çalışma, viseral nosisepsiyonun baskın olarak hücre gövdeleri DRG5,6'da olan duyusal nöronlar tarafından iletildiğini öne sürmüştür. Akupunkturun neden olduğu analjezik etkide DRG nöronlarının viseral ağrı üzerindeki hücresel ve moleküler mekanizmasını çok sayıda araştırma aydınlatmış olsa da7,8, teknik zorluklar nedeniyle fonksiyonel özellikleri hakkında çok az literatür bulunmaktadır9. DRG'de nöral aktiviteyi kaydetmek için periferik fiber kaydı, tek hücreli elektrofizyoloji kaydı ve in vivo kalsiyum görüntüleme gibi çeşitli yöntemler, aksonlar10 boyunca geçen aksiyon potansiyellerinin modellerini ve özelliklerini kaydetmek için kullanılabilir. DRG'nin gevşek yamalı cam elektrot kaydı, nöronal aktiviteler ile farklı uyaranlar arasındaki korelasyonu araştırmak için en yaygın kullanılan tekniklerden biri olmuştur in vivo11. Bununla birlikte, elektrofizyolojik kayıt gibi geleneksel yöntemler, in vivo olarak viseral duyarlı nöronları tanımlamak için yeterli hücre sayısını ve farklı spesifik hücresel alt tipleri verimli bir şekilde inceleyemez.
Periferik hissi kodlamanın yanı sıra, DRG nöronları akupunktur sinyallerinin merkezi sinir sistemine iletilmesinde önemli bir rol oynar. Geleneksel elektrofizyolojik kayıt, patolojik ağrının neden olduğu DRG nöronlarının anormal aktiviteleri üzerinde akupunkturun düzenlenmesini araştırmak için zaten yaygın olarak uygulanmaktadır11. Duyusal innervasyon ile ilgili olarak DRG'nin uygun segmentlerinin gözlemlenmesi gerekir. Lomber (L) 6 DRG'nin genellikle kolon modülasyonunu araştırdığı gözlendi4.
Optik ve genetik yöntemlerin geliştirilmesindeki son gelişmeler, genetik olarak etiketlenmiş nöronların büyük popülasyonlarının aktivitesini aynı anda araştırmayı mümkün kılar12. Bununla birlikte, viseral ve somatik stimülasyon altında DRG'deki nöronal aktiviteyi izlemek için ayrıntılı kalsiyum görüntüleme yöntemleri hala eksiktir. Bu nedenle, bu protokol, L6 DRG nöronlarının intrakolonik ve akupunktur stimülasyonuna duyarlılığının in vivo gözlemi için prosedürleri açıklar. Burada açıklanan yöntem, somatik ve viseral duyusal nöronların özelliklerini tespit etmek için de kullanılabilir.
Kalsiyum görüntülemenin geniş uygulaması ve tanıtımı, akupunktur araştırmaları için çok etkili ve pratik bir araç sunar. Yukarıda bahsedilen kalsiyum görüntülemenin avantajları göz önüne alındığında, bu yöntemin akupunktur araştırmalarında yaygın olması ve uygulanması gerekirdi. Bununla birlikte, akupunktur araştırmalarında kalsiyum görüntülemenin kullanımı hala nispeten nadirdir. Bu sınırlamanın temel nedeni, operasyonel ve kayıt prosedürlerinin zorluğu olabilir. Bu makalenin birincil amacı, farelerde L6 DRG nöronlarının kalsiyum görüntüleme kayıtlarının yürütülmesindeki bazı kritik noktalara genel bir bakış sunmaktır. En önemlisi, bu son teknoloji ürünü aracı in vivo kullanarak akupunktur araştırmalarının ilerlemesini ve gelişmesini teşvik etmeyi umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Anestezi Sistemi&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td></td></tr><tr><td>DC Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC Sıcaklık Kontrol Cihazı Isıtma Yastığı</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Fiji yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin Süngerler</td><td>Coltene</td><td>274-007</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Han' s Akupunktur Noktası Sinir Stimülatörü</td><td>Jason Scientific</td><td>HANS-200A</td><td></td></tr><tr><td>Entübasyon Kanülü</td><td>Harward Aparatı</td><td>73-2737</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>RWD</td><td>R510</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-cre</td><td>fareler Johns Hopkins Üniversitesi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-GCaMP6s&nbsp; fareler (AI96)</td><td>Jax Laboratuvarı</td><td>28866</td><td></td></tr><tr><td>Omurga Adaptörü</td><td>N/A</td><td>N/A Özel</td><td>yapım</td></tr><tr><td>Bahar Makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Yaylı</td><td>Makas Güzel Bilim Araçları</td><td>15019-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (İn canlı) dorsal kök gangliyon nöronlarının somatik ve viseral uyaranlara yanıtının kalsiyum görüntülemesi

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Canlı, anestezi uygulanmış bir laboratuvar faresinde lomber-6'nın dorsal kök ganglionunu (DRG) cerrahi olarak açığa çıkarmak için bir teknik, çeşitli viseral ve somatik uyaranlara yanıt olarak maruz kalan DRG'nin in vivo kalsiyum görüntüleme protokolü ile birlikte tanımlanmıştır. Ca2 + geçici olaylarını yakalamak için GCaMP6'larla paketlenmiş AAV virüsleri intratekal olarak enjekte edilen Pirt-GCaMP6s fareleri veya C57BL6 fareleri kullanıldı. Bu geçici akımların genliği, belirli duyusal modalitelere duyarlılığı gösterir. Afferent lifler iç organlardan kaynaklanır ve primer nöronal hücre gövdeleri spinal veya vagal gangliyonlarda bulunur. Viseral nosisepsiyon ve akupunktur analjezisi ile ilgili çalışmalar, in vivo kalsiyum görüntüleme gibi gelişmiş görüntüleme teknolojileri kullanılarak birincil duyusal nöronlar üzerinde potansiyel olarak yürütülebilir ve bu da stimülasyon veya müdahale sırasında sağlam hayvanda nöronal aktivite topluluklarının kaydedilmesine olanak tanır. DRG nöron topluluklarının, karşılık gelen alıcı alanlarına uygulanan somatik ve viseral uyaranlara tepkileri kaydedildi. Bu teknik, nöronal popülasyonların çeşitli somatik ve viseral uyaranlara nasıl tepki verdiğini gösterir. Nöronal topluluk tepkilerini farklı uyaranlara kapsamlı bir şekilde karşılaştırmak mümkündür, bu da viseral ağrı ve akupunktur gibi somatik stimülasyonun segmental mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalarda özellikle değerli bir yaklaşımdır.

Yukarıdaki protokol takip edilerek, transgenik bir Pirt-GCaMP6s faresinin lumbar-6 DRG'si açığa çıkarılmış ve kolorektuma veya reseptif alana visseral CRD veya somatik akupunktur stimülasyonları uygulanmıştır. Bu deney, farklı visseral CRD ve somatik stimülasyonlar tarafından uyarılmaya tetiklenen nöronların sayısını ve tiplerini gözlemlemeyi amaçlamıştır.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, lumbar-6 DRG'deki nöronların çoğu bazal koşullar altında GFP floresansı sergil...

Mevcut protokol, lomber-6 DRG nöron topluluklarının somatik ve viseral uyaranlara tepkilerini ölçmek için in vivo kalsiyum görüntülemeyi ana hatlarıyla belirtir. Farklı uyaranlara yanıt veren nöronlar arasında kapsamlı karşılaştırmalar yapılabilir. Bu protokol, akupunktur gibi viseral ağrı ve somatik stimülasyon mekanizmalarını araştırmak için değerlidir.

In vivo (İn canlı) Dorsal Kök Gangliyon Nöronlarının Somatik ve Viseral Uyaranlara Yanıtının Kalsiyum Görüntülemesi

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

in-vivo-calcium-imaging-dorsal-root-ganglia-neurons-response-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Shannonhouse, J.,  et al. İn Vivo Sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki primer duyusal nöron ağlarındaki nöronal toplulukların kalsiyum görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2023). Video, transgenik bir farenin dorsal kök gangliyonlarındaki (DRG) nöronal aktiviteyi izlemek için in vivo bir kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. DRG nöronları, kalsiyuma bağlandıktan sonra floresan yoğunluğunu artıran bir kalsiyum indikatörünü ifade eder. Bir arka pençeye uygulanan mekanik veya termal...

Bir farenin sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki nöronal toplulukların in vivo kalsiyum görüntülemesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Bu çalışma, senkron EKG kayıtları ile birlikte in vivo kalsiyum görüntüleme için anestezi uygulanmış farelerde T-DRG'yi ortaya çıkarmak için cerrahi bir manipülasyon sunmaktadır. Bu yöntem, periferik elektriksel sinir stimülasyonu ve torasik viseral organ girdilerinin yanı sıra bunların birincil duyusal düzeydeki etkileşimlerini incelemek için son teknoloji bir araçtır.

Periferik Sinir Stimülasyonunu İncelemek için İn Vivo Torasik Dorsal Kök Gangliyonları (DRG) Kalsiyum Görüntüleme ve EKG Kaydı

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Biz dorsal kök ganglion dokusundan kromatin immunoprecipitation aksonal yaralanma sonrası için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşım, belirli bir transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri ve periferik ve santral sinir sistemi hem de yaralı aksonların rejenerasyonu için histon ve DNA önemli epigenetik modifikasyon tanımlamak için kullanılır.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Keşfedin, farelerde lumbar-6 dorsal kök gangliyon nöronlarının somatik ve viseral uyaranlara yanıtını in vivo kalsiyum görüntüleme ile nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, akupunkturun analjezik etkilerini anlamak için güçlü bir araç sunar.

In vivo (İn canlı) Dorsal Kök Gangliyon Nöronlarının Somatik ve Viseral Uyaranlara Yanıtının Kalsiyum Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet