Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi
8 Kasım 2006
Pekala, bugün sizlere dik mikroskopta görüntüleme yapmak için bir akış odası, yani bir füzyon odasının nasıl oluşturulacağını göstermek istiyorum. Ardından, film kullanarak iki boşluk oluşturuyorum. Bunun için parafilm alıp onu küçük şeritler halinde kesiyorum.
Sıradaki adımda, temel olarak kanal duvarlarını oluşturacağım ve bunları eğik bir hava akımıyla kurutacağım. Lamelini parafinin üzerine yerleştiriyorum ve işte tamamlandı. Ardından, parafini eritmek ve temel olarak bir sızdırmazlık sağlamak için ısıtıcı blok üzerinde ısıtıyorum.
Burada gördüğümüz şey lamine camdır ve lamine camın üzerinde, tam burada gördüğünüz gibi, iki katman film bulunmaktadır. Bunun üzerinde ise tekrar, 22 x 22 mm boyutlarında bir lamine cam vardır. Mühürlemeyi tamamlamak için filmin üzerine bastırdığım cam budur.
Tamam, sıvı burada tek yönde ilerliyor ve ben onu buradaki filtre kağıdıyla bu yönde çekebiliyorum. Bunu nasıl yapacağınızı birazdan göstereceğim. Benim tercih ettiğim yöntem ise, bunu oldukça basit olan nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirmektir.
İki adet yükseltilmiş şerit alın ve altına bir filtre kağıdı yerleştirin. Akış odasını sızdırmaz tutmak için üzerine bir kapatma lamı yerleştiriyorum. Çembere bir solüsyon ekleme yöntemi, pipet ucunu odanın girişine yerleştirip solüsyonu eklemektir.
Şimdi yapacağım işlem, hazneyi kapağı kapalı olarak 10 dakika boyunca inkübe etmektir. Sıvıyı diğer taraftan çekmek için genellikle kullandığım yöntem, bir filtre kağıdını alıp şu şekilde ince şeritler halinde kesmektir. Bu ince şeritlerden birini alıyorum ve bir yandan çözeltiyi giriş kısmına uygularken, diğer yandan filtre kağıdını çıkış kısmına yerleştirerek değişim çözeltisini çekiyorum.
Böylece sıvının çözelti boyunca aktığını göreceksiniz. Ardından, orta kısmın kapanması için beş dakika bekliyorum. Şimdi yapmaya hazır olduğum şey, aktini yerleştirmek; aktini aslında polimerize etmem gerekiyor, polimerizasyonu akış odasının içinde gerçekleştiriyorum ve bu, önceki prosedürlerle aynıdır.
Bu şekilde olduğu için ve artık aktin polimerize olduğu için, fazla polimerize olmamış aktini sadece tampon kullanarak büyük bir hacimle yıkayıp uzaklaştırıyorum. Burada yaklaşık 100 µL tamponum var ve bu, birkaç reaksiyon odası hacmine karşılık geliyor. Filtre kağıdı doyuma ulaştığında yönünü değiştirmem gerekiyor. Tamam mı?
Böylece bununla görüntüleme yapmaya hazırım. Aktin'in tutturulduğu perfüzyon odası hazır. Şimdi lamı alıp mikroskobun altına yerleştiriyorum ve yağlı objektif ile görüntüleme yapacağım için lamın üst yüzeyine, içeriye aktin üzerine bir solüsyon, protein veya herhangi bir madde ekleyebilmek için imersiyon yağı damlatıyorum.
Bu nedenle, zaman ayarlı görüntüleme yaparken aslında solüsyon tarafını değiştirebiliyorum.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, dik mikroskop üzerinde görüntüleme yapmak için bir akış odası ve füzyon odasının kurulumunu göstermektedir. İşlem, parafilm kullanarak kanallar oluşturmayı ve bunları ısı yardımıyla mühürlemeyi kapsamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
Arka Plan
- Akış odaları, çeşitli görüntüleme teknikleri için temel öneme sahiptir.
- Bir füzyon odası inşa etmek, gelişmiş görüntüleme yetenekleri sağlar.
- Parafilm, laboratuvar ortamlarında sızdırmazlık oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
- İnşa sürecini anlamak, alandaki araştırmacılar için kritik önem taşımaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Akış hücresi oluşturmak için adım adım bir kılavuz sunmak.
- Görüntüleme hücreleri oluşturmada parafilm kullanımını örneklendirmek.
- Araştırmacılar için görüntüleme tekniklerinin erişilebilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kanal oluşturmak için parafilmin şeritler halinde kesilmesi.
- Şeritlerin eğik hava akımıyla kurutulması.
- Parafilmin üzerine bir lamelin yerleştirilmesi.
- Sızdırmazlık sağlamak için düzeneğin bir ısıtıcı blok üzerinde ısıtılması.
Ana Sonuçlar
- Fonksiyonel bir akış odası başarıyla inşa edilmiştir.
- Sızdırmazlık işlemi, görüntüleme için stabil bir ortam oluşturmada etkili olmuştur.
- Gösterilen yöntem, laboratuvar kullanımı için tekrarlanabilirdir.
- Araştırmacılar bu tekniği çeşitli görüntüleme uygulamaları için kullanabilirler.
Sonuçlar
- Akış ve füzyon odalarının kurulumu oldukça basittir.
- Bu yöntem, gelişmiş görüntüleme çalışmalarını kolaylaştırabilir.
- Bu tür tekniklere erişim, araştırma sonuçlarını iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, hücre iskeleti dinamiklerinin mekanistik çalışmalarını destekleyerek, canlı hücre görüntüleme için kontrollü mikroortamların tekrarlanabilir şekilde hazırlanmasına olanak tanır. Akış odası montajını standartlaştırarak, perfüzyon temelli analizlerdeki değişkenliği azaltır ve keşif ekipleri arasındaki veri tutarlılığını artırır. Bu yöntem; onkoloji ve immünolojide hedef doğrulamasıyla ilgili olan ve hücre hareketliliği ile sinyal iletiminde temel bir süreç olan aktin yıkım kinetiğinin kantitatif analizini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Sitoskeletal yeniden yapılanma regülatörlerini incelemek için aktin depolimerizasyon dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Canlı hücrelerdeki aktin döngüsü üzerindeki bileşik etkilerini test etmek için standartlaştırılmış bir platform sunar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Aktin sökülme hızları için floresan tabanlı okumaların, fonksiyonel bir analiz son noktası olarak geliştirilmesini destekler.
- Operasyonel Değer: Perfüzyon altında doz-yanıt ilişkilerini değerlendirmek için zaman ayarlı görüntüleme sırasında çözelti değişimine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Aktin dinamiğini; metastaz, invazyon ve immün sinaps oluşumu ile ilgili hücresel fenotiplere bağlar.
- Operasyonel Değer: Sayısal olarak ölçülebilir görüntüleme biyobelirteçleri kullanarak yolak inhibitörlerinin preklinik değerlendirmesine olanak tanır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef etkileşim taramasından hastalıkla ilişkili hücresel sistemlerdeki fonksiyonel doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Aktin akışının gerçek zamanlı görselleştirilmesi yoluyla hücre iskeleti regülatörlerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Kontrollü perfüzyon koşulları altında aktin sökülmesinin kantitatif ve tekrarlanabilir ölçümlerini sağlar.
- Analiz: Aktin döngüsünün kinetik modellemesine olanak tanıyan zaman çözünürlüklü floresans yoğunluğu verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hücre migrasyonunun preklinik modellerinde moleküler mekanizmayı hücresel fenotiplerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hücre iskeleti hedefi ve hücre tipine uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir bir perfüzyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doğrudan fonksiyonel okumalar aracılığıyla aktin regülasyonunda yer alan hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış hazne hazırlığı, farklı merkezler ve operatörler arasında assay tekrarlanabilirliğini artırır.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonunu fonksiyonel hücre iskeleti sonuçlarıyla ilişkilendirerek daha erken go/no-go kararları alınmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Hücre motilitesi ve invazyon fenotipleri üzerindeki etkilere dayanarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre görüntüleme ve mikroakışkan akış kontrolü konusunda uzmanlık gerektirir.
- Çevresel kontrol ve perfüzyon özelliklerine sahip dik mikroskoplara erişime bağlıdır.
- Odacıklar arası tutarlılık için parafilm kalınlığının ve sızdırmazlık parametrelerinin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı hücre tiplerine adaptasyon, yüzey kaplama ve aktin polimerizasyon koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, protokolde belirtildiği üzere, uzun süreli perfüzyon sırasında hücreler üzerinde oluşabilecek potansiyel kayma gerilmesi etkileri yer alır.
