Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi
November 8th, 2006
Pekala, bugün size bir akış odasının nasıl yapıldığını göstermek, dik mikroskopta görüntüleme için bir füzyon odası. Daha sonra film kullanarak iki alan yaratıyorum. Ben de para filmi çekip küçük şeritler halinde kesiyorum.
Bir sonraki adımda, bu temel olarak duvarlar için kanalları oluşturacak ve onları eğik bir hava ile kurutacağım. Kapak fişini paranın üstüne koydum, Ve işte bitti. Daha sonra parametreyi eritmek ve temelde bir conta oluşturmak için bir ısı bloğunda ısıtıyorum.
İşte bu nedir, buradaki kapak camı ve sonra kapak camının üstünde tam burada gördüğünüz gibi iki kat phim var. Ve bunun üzerine, yine, bir, 22'ye iki mil metrelik bir kapak kayması. Bu tam burada, mührü düşürmek için param'a bastırdım.
Tamam, sıvı burada bir yönde giriyor ve ben onu bu yönde bir filtre kağıdı ile emebilirim. Ve size bunu nasıl yapacağınızı birazdan göstereceğim. Yapmayı sevdiğim şey, onu nemlendirilmiş bir odaya koymak, ki bu çok basit.
İki tür yükseltilmiş şerit alın ve altına bir kağıt filtresi koyun. Ve ben olduğu gibi gürültülü tutmak için, akış haznesinin kapağını, kapak kızağını üzerine koydum. Şimdi, hazneye bir çözüm sunmanın yolu, pipet ucunu haznenin girişine koymanız ve basitçe ayırmanızdır.
Şimdi yaptığım şey, kapağı kapalı olarak odayı 10 dakika inkübe etmek. Sıvıyı diğer taraftan emmek için genellikle yaptığım şey, onu kullanmak, bir filtre kağıdı almak ve bu şekilde ince şeritler halinde kesmektir. Ve bu ince şeritlerden birini alıyorum ve aynı anda solüsyonu girişe uygularken filtre kağıdını çıkışa koyuyorum ki değişimi, solüsyonu emmek için.
Böylece sıvının çözeltiden aktığını göreceksiniz. Ve sonra orta kapanış için beş dakika bekliyorum. Şimdi yapmaya hazır olduğum şey, aslında aktini ve aktini, aslında polimerize etmem gerekiyor, akış odasının içinde polimerize ediyorum ve bu daha önceki prosedürlerin aynısı.
Yani bu şekilde ve şimdi hareket polimerize olduğu için, büyük miktarda sadece tampon kullanarak tüm fazla polimerize edilmemiş eylemi yıkıyorum. Yani burada yaklaşık yüz mikrolitreye sahibim ve bu birkaç reaksiyon odası hacmi değerinde bir tampon. Sadece, bilirsiniz, filtre kağıdı doygun hale geldiğinde, yönü değiştirmem gerekiyor. Tamam?
Ve bu yüzden bununla görüntüleme yapmaya hazırım. Yani ona bağlı aktin ile perfüzyon odası. Şimdi slaytı alıyorum, mikroskobun altına monte ediyorum ve bir yağ objektifi ile görüntülediğim için, kapağın üst yüzeyine biraz daldırma yağı süreceğim, çimen dokunuşu, yani çözelti veya protein veya içerideki herhangi bir şeyi değerlendireceğim.
Yani yaptığım şey, zaman atlamalı görüntüleme yaparken aslında çözüm tarafını değiştirebilmek. Gibi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, dik mikroskop üzerinde görüntüleme için bir akış odası ve füzyon odası inşasını göstermektedir. Süreç, parafilm kullanarak kanallar oluşturmayı ve bunları ısı ile kapatmayı içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
Arka Plan
- Akış odaları, çeşitli görüntüleme teknikleri için gereklidir.
- Bir füzyon odası inşası, gelişmiş görüntüleme yetenekleri sağlar.
- Parafilm, laboratuvar ortamlarında sızdırmazlık oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
- İnşa sürecini anlamak, alanda araştırmacılar için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Bir akış odası inşası için adım adım bir rehber sağlamak.
- Akış odalarını oluşturmada parafilm kullanımını göstermek.
- Araştırmacılar için görüntüleme tekniklerinin erişilebilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Parafilmi kanallar oluşturmak için şeritler halinde kesmek.
- Şeritleri eğimli havada kurutmak.
- Parafilmin üzerine bir kapak camı yerleştirmek.
- Bir sızdırmazlık oluşturmak için montajı bir ısı bloğu üzerinde ısıtmak.
Ana Sonuçlar
- Başarılı bir şekilde işlevsel bir akış odası inşa edildi.
- Sızdırmazlık süreci, görüntüleme için stabil bir ortam yaratmada etkili oldu.
- Gösterilen yöntem laboratuvar kullanımı için tekrarlanabilirdir.
- Araştırmacılar bu tekniği çeşitli görüntüleme uygulamaları için kullanabilir.
Sonuçlar
- Akış ve füzyon odalarının inşası basittir.
- Bu yöntem, gelişmiş görüntüleme çalışmalarını kolaylaştırabilir.
- Bu tür tekniklere erişilebilirlik, araştırma sonuçlarını artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
