Name: Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Keşfedin fare göz lensinin yapısını ve işlevini anlamak için tam montajlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile üç boyutlu doku yapısını koruyarak nicel analiz yapmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, CC'ye EY032056 Ulusal Göz Enstitüsü Hibe R01 ve VMF'ye EY017724 R01'in yanı sıra P20GM139760 numaralı hibe numarası altında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. S.T.I, Kimya-Biyoloji Arayüzü doktora öncesi eğitim programının bir parçası olarak NIH-NIGMS T32-GM133395 ve Delaware Üniversitesi Lisansüstü Akademisyenler Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Murin Oküler Lens Bütün Montajlarının Hazırlanması ve Görüntülenmesi

<ol><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics%2C+morphology%2C+refractive+index+and+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li>
<li>Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+strain+on+mouse+eye+lens+capsule+and+cellular+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure.</a> Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).</li>
<li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).</li>
<li>Martin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arvcf+dependent+adherens+junction+stability+is+required+to+prevent+age-related+cortical+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 840129(2022).</li>
<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).</li>
<li>Mekonnen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule+significantly+affects+the+viscoelastic+properties+of+the+lens+as+quantified+by+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086(2023).</li>
<li>Fincham, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+lens+capsule+in+the+accommodation+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Optical+Society%22%5BJournal%5D)">The function of the lens capsule in the accommodation of the eye.</a> Trans Optical Society. 30 (3), 101(1929).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Bassnett, S., Sikic, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+growth+process%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens growth process.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).</li>
<li>Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+full+lifespan+model+of+vertebrate+lens+growth%5BTitle%5D)+AND+%22R+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">A full lifespan model of vertebrate lens growth.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160695(2017).</li>
<li>Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+and+Src+regulate+equatorial+cell+morphogenesis+during+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development.</a> Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).</li>
<li>Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+polarity+protein+aPKClambda+is+required+for+eye+lens+formation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth.</a> Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).</li>
<li>Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+organization+of+the+mammalian+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial organization of the mammalian lens.</a> Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).</li>
<li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+Ocular+Lens%22">Development of the Ocular Lens</a>. , Cambridge University Press. (2011).</li>
<li>Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+cell+organization+in+crystalline+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Fibre cell organization in crystalline lenses.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).</li>
<li>Cvekl, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+mechanisms+of+vertebrate+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development.</a> Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).</li>
<li>Vu, M. P., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunofluorescence+staining+of+bundles+and+single+fiber+cells+from+the+cortex+and+nucleus+of+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens.</a> J Vis Exp. (196), e65638(2023).</li>
<li>Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+IIA+regulates+the+precise+alignment+of+hexagonal+eye+lens+epithelial+cells+during+fiber+cell+formation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20(2023).</li>
<li>Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+staining+of+lenses+for+visualization+of+lens+epithelial+cell+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins.</a> MethodsX. 8, 101376(2021).</li>
<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens%3A+Strain+and+morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses.</a> J Vis Exp. (111), e53986(2016).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+live-cell+imaging+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton.</a> Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Açıklanan protokoller, lensin ön ve ekvator bölgelerindeki periferik lens yapılarının ve hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu çalışmada, genel 3D lens mimarisinin korunduğu sağlam (canlı veya sabit) lensler kullanılarak lens çevre yapılarının görüntülenmesine yönelik yöntemler gösterilmiştir. Ek olarak, halka açık FIJI ImageJ yazılımı kullanılarak morfometrik kantitatif analiz için basit yöntemler sağlanmıştır. Tüm montaj görselleştirme ve miktar tayini yöntemleri önceki çalışmalarda kullanılmıştır. Bu yöntemler, ön kapsül ve hücrelerin lens şekli değişikliğine veya yaşlanmaya tepkisini anlamamızı sağladı 2,4. Bu yöntemler aynı zamanda lens şekli değişikliği veya yaşlanma 2,4 nedeniyle ekvatoral lif hücresi genişlemesini incelemek ve NMIIA'nın kesin altıgen şekiller ve periferik lif hücre organizasyonu oluşturmadaki rolünü belirlemek için kullanılmıştır20.
Tam montajlı görüntüleme, lens yapısının yüksek uzamsal çözünürlüklü ve yüz görüntülemesine olanak tanır. Ön lens bölgesinde, kapsül yapısı bütünlüğünü ve/veya epitelyal hücresel morfolojiyi değiştirebilecek hasarı önleyerek tam montajlı görüntüleme, düz montajlı görüntülemeye göre avantajlıdır. Ek olarak, epitel ve lif hücreleri arasındaki arayüz korunur. Bu yöntem, lens bölümlerinin görselleştirilmesine göre avantajlar sağlar, çünkü en yüz görüntüleme daha fazla uzamsal çözünürlük sağlar ve epitel hücre alanının ve nükleer alanın/seçilen bölgenin (yani, burada gösterildiği gibi orta-lateral) veya hücrelerin diğer bölgelerinin analizine izin verir. Ayrıca, görüntüleme yöntemleri, merceğin ekvator bölgeleri boyunca belirli noktalardaki morfolojik özelliklerin ölçülmesine izin vererek, altıgen şekillerin, meridyen sıralı hücre paketlemesinin, dayanak noktasının ve fiber hücre genişliklerinin görselleştirilmesini sağlar, bu da kesitleme sırasında meydana gelebilecek uzamsal çözünürlük eksikliği ve doku distorsiyonu nedeniyle görüntüleme ile boyanmış lens kesitleri ile kolayca elde edilemez. 
Ana hatlarıyla belirtilen protokoller, zaman içinde belirli lens yapılarını ve hücrelerini izlemek için canlı lenslerin görüntülenmesine de izin verir. Canlı lens görüntüleme protokolü, lens düzleşmesini indüklemek için lens sıkıştırmasından önce ve sonra aynı lensten alınan bir hücre alt popülasyonundan kapsül kalınlığı ve epitel hücre alanının tekrarlanan ölçümlerinin analizinin yapıldığı önceki bir çalışmada etkiliydi4. Lens sıkışmasının kapsül kalınlığında azalmaya ve epitel hücre alanında artışa neden olduğu belirlendi. Tek tek lensler arasındaki kapsül kalınlığı ve epitel hücre alanındaki önemli farklılıklar ve lens sıkıştırmasının neden olduğu bu parametreler üzerindeki etkilerin büyüklüğü nedeniyle, bağımsız bir ölçüm tasarımı kullanılsaydı farklılıkları tespit etmek zor olurdu (yani, tek tek sıkıştırılmamış lenslerin tek tek sıkıştırılmış lenslerle karşılaştırılması). Canlı görüntüleme yöntemleri kullanılarak, canlı epitel hücrelerinde F-aktin reorganizasyonunun izlenmesini sağlayan epitel hücrelerinde22 F-aktini görselleştirmek için LifeACT-GFP26'yı endojen olarak eksprese eden canlı fare lensleri üzerinde tam montajlı görüntüleme yapılmıştır.
Ana hatlarıyla belirtilen protokoller fare lenslerini görüntülemek için geliştirilmiş ve diğer türlerdeki lens yapılarını görselleştirmek için uyarlanabilirken, boyama protokolleri diğer kemirgen lenslerinde (sıçan, kobay) ve diğer memeli lenslerinde (, makak ve insan; veriler gösterilmemiştir) lensin hem ön hem de ekvatoral periferik yapılarını görselleştirmek için tasarlanmıştır. Daha büyük lenslerde yapıların görselleştirilmesi daha uzun fiksasyon (%4 PFA, buz üzerinde, 4 saat), blokaj (1 saat) ve boyama (gece boyunca, 4 °C) gerektirir. Farklı türlerde görüntüleme sadece sabit lenslerde yapıldı. Canlı görüntüleme protokolü, florojenik proteinleri eksprese eden transgenik farelerden alınan lensleri kullandığından, diğer türlerden alınan lenslerin canlı görüntülenmesi zor olabilir. Bu nedenle, bu görüntüleme, genetik modifikasyonların yaygın olmadığı diğer türlerin görüntüleme lenslerini engelleyebilir. Bununla birlikte, fare lenslerini sırasıyla lipofilik prob, FM4-64 veya bir F-aktin bağlayıcı prob, SiR-Jasplakinolide (SiR-aktin) ile önceden boyayarak lens epitel hücre zarlarının veya F-aktinin canlı görselleştirmesini gerçekleştirebildik (gösterilmemiştir). Diğer türlerin canlı lenslerini görüntülemek için bu tür probları kullanmak mümkün olabilir. Bununla birlikte, hedef dışı etkilerden kaçınmak için bu tür probları kullanırken dikkatli olunmalıdır; örneğin, SiR-Jasplakinolide, F-aktin dinamiklerinindeğişmesine yol açabilir 27. Boyama yöntemlerinin bir başka sınırlaması, ister canlı ister sabit lenslerde olsun, bu tür probların sınırlı penetrasyona sahip olmasıdır. Bu nedenle görüntüleme periferik bölgelerle sınırlıdır. Yine florojenik proteinlerin transgenik ekspresyonuna dayanan tdTomato transgenik fareleri4'ten elde edilen lensleri kullanarak iç bölgeleri (yani derin lif hücrelerini) görüntülemek mümkündür. İfade ayrıca derin lif hücrelerinde parlak sinyaller için yeterince yüksek olmalıdır. 
Bununla birlikte, özetlenen protokoller periferik lens özelliklerinin etkili morfolojik kantitasyonunu sağlamıştır 2,4,20. Niceleme metodolojileri etkilidir ve açık kaynaklı, halka açık FIJI ImageJ yazılımını kullanır. İlgilenilen bölgeleri belirlemek için manuel izleme araçları kullanılırken, ilgilenilen bölgelerin tanımlanmasını otomatikleştirmek mümkün olabilir. Otomasyon, belirli yapıların (yani çekirdek sınırları) FIJI ImageJ tabanlı tanımlanması için kontrastı artırmak için floresan eşikleme uygulamak veya hücre şekli farklılıklarını (yani düzensiz epitel veya lif hücre şekilleri) tespit etmek için daha karmaşık makine öğrenimi algoritmaları uygulamak kadar basit olabilir. Daha karmaşık analizler, özel eklentiler veya görüntüleme yazılımı gerektirebilir. Özel eklentiler veya yazılımlar, elde edilen z-yığınlarından 3B hacimsel morfolojik ölçümlerin elde edilmesine de izin verebilir. Genel olarak, açıklanan niceleme yöntemleri kolayca erişilebilir, uygun maliyetli ve birçok yararlı sonuç ölçütü için uygun olsa da 2,4,20, görüntüleme protokolü platformu, karmaşık yazılım analizi ile birlikte, gelecekteki çalışmalar için çok sayıda ek morfolojik ölçüm sağlayabilir.
Lens, hücrelerin ve bunlarla ilişkili yapıların konumuna ve derinliğe bağlı geometrilerine dayanan özel işlevlere sahip karmaşık bir biyolojik dokudur. Burada gösterilen görüntüleme protokollerinin ve niceleme yöntemlerinin kullanılması, lens yapılarının ve lensin karmaşık organizasyonunun nasıl kurulduğunun daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Ayrıca, görüntüleme protokolleri ve kantifikasyon yöntemleri, lens yapısı ve işlevleri arasındaki ilişkileri tanımlamaya yardımcı olacaktır.

Oküler lens, gözün ön bölgesinde yer alan ve ışığı retinaya ince odaklama işlevi gören esnek, şeffaf bir dokudur. Lensin işlev görme yeteneği, kısmen karmaşık mimarisine ve organizasyonunabağlanabilir 1,2,3,4,5,6. Lens dokusunu çevreleyen, lens yapısını ve biyomekanik özelliklerini korumak için gerekli olan bir bazal membranolan kapsüldür 7,8,9. Lensin kendisi tamamen hücreseldir ve iki hücre tipinden oluşur: epitelyal ve fiber hücreler. Epitel tabakası, lensin10 ön hemisferini kaplayan tek bir küboidal hücre tabakasından oluşur. Yaşam boyunca, epitel hücreleri çoğalır ve lens kapsülü boyunca lens ekvatoruna doğru göç eder. Anterior epitel hücreleri enine kesitte hareketsiz ve parke taşıdır ve lens ekvatorunun yakınında epitel hücreleri çoğalır ve yeni lif hücrelerine farklılaşma sürecinden geçmeye başlar11,12. Ekvator epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş hücrelerden altıgen şekilli hücrelerle organize meridyen sıralarına dönüşür. Altıgen hücre şekli, bu farklılaşan hücrelerin bazal tarafında korunurken, apikal taraf lens dayanak noktasında veya modiolus 4,13,14,15'te daralır ve sabitlenir. Ekvatoral epitel hücreleri yeni oluşan lif hücrelerine uzamaya başladığında, hücrelerin apikal uçları ön epitel hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca ön kutba doğru hareket ederken, bazal uçlar lens kapsülü boyunca arka kutba doğru hareket eder. Yeni nesil fiber hücreler, önceki nesil hücrelerin üzerini kaplayarak küresel lif kabukları oluşturur. Hücre uzaması ve olgunlaşma süreci sırasında, lif hücreleri morfolojilerini önemli ölçüde değiştirir 11,12,16. Bu lif hücreleri, lens kütlesinin 11,12,16,17,18 kütlesini oluşturur.
Karmaşık lens mikro yapılarının, hücre morfolojisinin ve benzersiz hücresel organizasyonun kurulmasına katkıda bulunan moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca, lens kapsülünün ve hücre yapısının genel lens fonksiyonuna (saydamlık, lens şekli değişikliği) katkısı belirsizdir. Bununla birlikte, bu ilişkiler yeni görüntüleme metodolojisi ve lens yapısal ve hücresel özelliklerinin kantitatif değerlendirmeleri kullanılarak aydınlatılmaktadır2,4,19,20,21,22. Lens kapsülünün, epitel hücrelerinin ve periferik fiber hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlükte görüntülenmesine izin veren tüm lensleri görüntülemek için yeni protokoller geliştirilmiştir. Bu, kapsül kalınlığını, hücre boyutunu, hücre çekirdeği boyutunu ve daireselliğini, meridyen sıra sırasını, fiber hücre paketlemesini ve fiber hücre genişliklerini ölçmek için metodolojiyi içerir. Bu görselleştirme ve görüntü niceleme yöntemleri, derinlemesine morfometrik incelemeye izin verir ve genel 3D doku yapısını koruyarak diğer görselleştirme yöntemlerine (düz bağlantıların veya doku kesitlerinin görüntülenmesi) göre avantajlara sahiptir. Bu yöntemler, yeni hipotezlerin test edilmesine izin vermiştir ve lens hücresi paterni gelişimi ve işlevinin anlaşılmasında sürekli ilerlemeyi sağlayacaktır.
Aşağıdaki deneyler için, her iki cinsiyetten 6 ila 10 haftalık yaşlar arasında C57BL/6J arka planında vahşi tip ve Rosa26-tdDomates fareleri tandem dimer-Domates (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) kullanıyoruz. tdTomato fareleri, N-terminal miristilasyon ve iç sistein-palmitoilasyon bölgeleri23 yoluyla plazma zarını hedef alan mutasyona uğramış bir MARCKS proteininin N-terminal 8 amino asitlerine kaynaşmış tdTomato proteininin ekspresyonu yoluyla canlı lenslerde hücresel plazma zarlarının görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca orijinal olarak Dr. Robert Adelstein'dan (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) elde edilen NMIIAE1841K / E1841K fareleri24 kullanıyoruz. Daha önce açıklandığı gibi, CP49 boncuklu ara filament proteini kaybına sahip (olgun lif hücresi morfolojisini ve tüm lens biyomekaniğini korur) FvBN/129SvEv/C57Bl6 arka planındaki NMIIAE1841K/E1841K fareleri, C57BL6/J vahşi tip farelerle geri çaprazlanır. Yavruları vahşi tip CP49 alelinin varlığı açısından taradık. 
Konfokal görüntüleme, 20x (NA = 0.8, çalışma mesafesi = 0.55mm, 1x yakınlaştırma), 40x (NA = 1.3 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.2mm, 1x yakınlaştırma) veya 63x (NA = 1.4 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.19mm, 1x yakınlaştırma) büyütme ile lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Tüm görüntüler, optik kesit kalınlığının belirleyicisi olan iğne deliği boyutu kullanılarak 1 Airy Unit'e kadar elde edilmiştir (ortaya çıkan optik kalınlıklar şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Görüntüler Zen Software'de işlendi. Görüntüler .tif formatta dışa aktarıldı ve ardından FIJI ImageJ Yazılımına (imageJ.net) aktarıldı.

<table><tbody><tr><td>3 mm Biyopsi Punch</td><td>Acuderm Inc</td><td>NC9084780</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>Antimikotik/Antibiyotik</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (Fraksiyon V)</td><td>Prometheus</td><td>25-529</td><td></td></tr><tr><td>Hassas görev mendilleri</td><td>Kimwipe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı tabak ( Florodish)</td> <td>World Precision International</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td></td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal Mikroskop 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MatTek Görüntüleme Kabı</td><td>MatTek Yaşam Bilimleri</td><td>P35G-1.5-14</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit ve nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>100503-917</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GenClone</td><td>25-507B</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı içermeyen ortam 199</td><td>Gibco</td><td>11043023</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>00027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>WGA-640</td><td>Biotium</td><td>CF 640R</td><td></td></tr></tbody></table>

periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization

Oküler lens, ışığı farklı mesafelerden retinaya odaklamak için şeklini değiştiren şeffaf esnek bir dokudur. Kapsül adı verilen organı çevreleyen bir bazal zarın yanı sıra, lens, ön hemisferde tek katmanlı bir epitel hücresi tabakası ve bir yığın lens lifi hücresi kütlesinden oluşan tamamen hücreseldir. Yaşam boyunca, epitel hücreleri lens ekvatorundaki çimlenme bölgesinde çoğalır ve ekvatoral epitel hücreleri göç eder, uzar ve yeni oluşan lif hücrelerine farklılaşır. Ekvatoral epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş parke taşı şeklindeki hücrelerden morfolojiyi, meridyen sıraları oluşturan hizalanmış altıgen şekilli hücrelere büyük ölçüde değiştirir. Yeni oluşan mercek lifi hücreleri, altıgen hücre şeklini korur ve ön ve arka kutuplara doğru uzar, böylece önceki nesil liflerin üzerine binen yeni bir hücre kabuğu oluşturur. Lens epitel hücrelerinin lif hücrelerine dikkat çekici morfogenezini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lens yapısını, gelişimini ve işlevini daha iyi anlamak için, tüm oküler lens yuvalarını kullanarak periferik yapıları görüntülemek için yeni görüntüleme protokolleri geliştirilmiştir. Burada, kapsül kalınlığını, epitel hücre alanını, hücre nükleer alanını ve şeklini, meridyen sıra hücre sırasını ve paketlemesini ve lif hücre genişliklerini ölçme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ölçümler, yaşam boyu lens büyümesi sırasında meydana gelen hücresel değişiklikleri aydınlatmak ve yaş veya patoloji ile meydana gelen değişiklikleri anlamak için gereklidir.

Ön lens kapsülü, epitel hücre alanı ve nükleer alan Lens kapsülü kalınlığını analiz etmek için, canlı veya sabit lenslerdeki lens kapsüllerini WGA ile boyadık. Lens epitel hücrelerini, canlı lenslerde membranları tdTomato ile etiketleyerek (Şekil 2A) veya sabit lenslerde hücre membranlarında F-aktin için rodamin-phalloidin boyaması yoluyla tanımladık (Şekil 2B). Ortogonal (XZ) bir projeksiyonda, WGA ve tdTomato/rodamin-falloidin için boyama, floresan yoğunluğunun tepeden tepeye çizgi tarama analizini yapmamızı sağlar. WGA kanalındaki majör pik kapsüler yüzeyi gösterirken, tdTomato/rodamin-phalloidin kanalındaki majör pik epitel hücrelerinin bazal bölgesini gösterir. Bu pikler arasındaki mesafeyi hesaplayarak kapsül kalınlığı elde edebiliriz. Çizgi tarama analizi, 9 haftalık bir fare canlı merceğinden alınan kapsüllerin 11.2 μm kalınlığa sahip olduğunu ve 9 haftalık bir fare sabit merceğinden alınan kapsüllerin 12.5 μm kalınlığa sahip olduğunu göstermektedir. Gözlenen bu kapsül kalınlıkları önceki bulguları temsil etmektedir 2,4.
tdTomato etiketli transgenik fare lenslerinin (veya rodamin-falloidin lekeli lenslerin; gösterilmemiştir) tam montajlı görüntülemesi, epitel hücre morfolojisinin canlı olarak görüntülenmesine izin verir. Ortogonal (XZ) projeksiyon, lens epitel hücresinin yandan görünümünü sağlarken, lateral bölgelerdeki düzlemsel (XY) görünüm, epitelyal poligonal şeklin görselleştirilmesine izin verir. Sağlıklı lenslerde hücreler arasında herhangi bir boşluk gözlemlemeyiz. Bir görüntüdeki hücre popülasyonunu izleyerek ve alanı ROI içindeki hücre sayısına bölerek ortalama hücre alanını hesaplayabiliriz. Hücre sayısı, belirli bir ROI'deki Hoechst boyalı çekirdeklerin sayısı sayılarak belirlenir. Analiz, önceki çalışmalarla uyumlu olarak 260μm2'lik bir ortalama hücre alanı göstermektedir 2,4.
Çekirdeklerin Hoechst boyaması ayrıca epitel hücrelerinde lens epitel hücresi nükleer morfometrisinin incelenmesine izin verir. Ortogonal (XZ) çıkıntılar, çekirdeklerin yandan görünümüne izin verir. Düzlemsel (XY) görünüm, çekirdeklerin dairesel/elipsoid şekillerini gösterir. Çekirdeklerin izlenmesi, tek tek hücrelerin nükleer alanının ve dairesellik gibi diğer şekil parametrelerinin hesaplanmasına olanak tanır. Analiz, ortalama 0.8 dairesellik ile 64μm2'lik bir ortalama nükleer alan göstermektedir. 1'e yakın dairesellik değerleri mükemmel bir daireyi gösterirken, 0'a yaklaşan değerler daha uzun bir morfolojiyi gösterir.
Ekvatoral epitel hücresi ambalajı, fiber hücre altıgen ambalajı ve fiber hücre genişlikleri Lens ekvator bölgesinin düzlemsel (XY) görünümü, dayanak noktasında birleşen altıgen şekilli ve düzenli olarak paketlenmiş lens epitel hücrelerini gösterir. Dayanak noktası, uzayan epitel hücrelerinin apikal uçlarının, ekvator 4,13,14,15'teki ilk lif hücresi farklılaşması ve uzaması sırasında bir bağlantı noktası oluşturmak üzere daraldığı yerdir (Şekil 6B, kırmızı kesikli bir çizgi ile gösterilmiştir). Dayanak noktası, ekvatoral epitel hücrelerini ve lif hücrelerini ayıran sürekli bir çizgi oluşturan artan F-aktin boyamasına dayalı olarak lokalize edilebilir (Şekil 6B, kırmızı kesikli çizgi). Hücresel zarlardaki F-aktin boyaması, dayanak noktasının altındaki hücrelerin hassas bir şekilde hizalandığı ve paralel sıralar halinde düzenlendiği hücre şeklindeki değişiklikleri de gösterir (Şekil 6). Hücre çekirdekleri de dayanak noktasının altında hizalanır.
Lens meridyen sıra epitel hücrelerini ve lif hücrelerini görselleştirmek için, meridyen sıra hücrelerinin bazal bölgesinin göründüğü XY düzleminde dayanak noktasına (lens kapsülüne doğru) 4.5-5 μm periferik bir görüntü, daha önce açıklandığı gibiseçilir 20. Meridyen sıra bozukluğunu ölçmek için, bir ilgi alanı (ROI) ana hatlarıyla belirtilmiştir (Şekil 7A; sarı kutu). Wildtype lens görüntüsündeki ROI alanı 15.833μm2'dir. Gözlenebilir bir bozukluk olmadığı için bozukluk alanı yüzdesi 0'dır. Kas dışı miyozin IIA'nın (NMIIA), NMIIA-E1841K mutasyonuna sahip fareler kullanılarak hücre altıgen paketlemede oynadığı kritik rol daha önce tanımlanmıştır20. Şekil 7A , meridyen sıra hücresi bozukluğunu göstermek için temsili bir NMIIAE1841K/E1841K lens ekvator görüntüsünü göstermektedir. Meridyen sırası ROI'si 20.757μm2 idi. Daha sonra, düzensiz yamaların toplam alanı izlendi. Toplam bozukluk alanı 3.185μm2 idi. Hesaplanan bozukluk yüzdesi .3 olarak belirlendi (düzensiz alan x 100/toplam ROI; Şekil 7B). Bu yüzde düzensiz alan, önceki bir çalışmada20 aralığındadır.
Daha sonra, vahşi tip meridyen sıra hücrelerinde altıgen paketlemenin incelenmesi gösterilmiştir20. F-aktin, meridyen sıra hücrelerinin tüm çevresi etrafında ve vahşi tip (yani, NMIIA +/+) lenslerde hücre zarlarının bazal bölgelerinin altı köşesinde zenginleştirildiğinden, hücre şekillerini ve paketleme organizasyonunu değerlendirmek için F-aktin boyama kullanıldı. Temsili resim 1'de, hücreler etiketlendi ve her hücrenin etrafındaki bitişik hücrelerin sayısı sayıldı. Resim 1'de, on hücrenin hepsinde altı bitişik hücre vardır, bu da bu hücrelerin bir petek paketleme organizasyonunda düzenlendiğini düşündürmektedir (Şekil 8<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig06large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig07.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig07large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig08.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig08large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig09.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig09large.jpg" target="_blank"></a>

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement ...

Karmaşık lens mimarisini oluşturan moleküler mekanizmaları ve bu yerleşik mimarinin saydamlık ve lens şekli değişiminde lens fonksiyonunu nasıl düzenlediğini belirlemeyi amaçlıyoruz. Alanımızdaki araştırmaları ilerletmek için, lens özelliklerini yüksek uzamsal çözünürlükle görselleştirmemize olanak tanıyan yeni görüntüleme yöntemleri kullanıyoruz ve bu, lens yapılarının ve hücresel özelliklerin nicel görüntü analizini yapmamızı sağlıyor. Tüm montaj görüntüleme, genel 3D doku yapısının korunmasını sağladığı için doku kesitlerinin görüntülenmesine veya düz montaj prosedürlerine göre avantajlıdır.Bu, doğal lens yapısı üzerinde derinlemesine morfo metrik inceleme ve miktar tayini yapmamızı sağlar. Lens, hücrelerin ve ilişkili yapılarının lokalizasyonuna ve derinliğe bağlı geometrilerine dayanan özel işlevlere sahip entegre bir biyolojik dokudur. Gösterilen görüntüleme protokollerinin ve niceleme yöntemlerinin kullanılması, lens yapılarının ve lensin karmaşık organizasyonunun nasıl kurulduğunun daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

whole-mount-imaging-to-visualize-quantify-peripheral-lens-structure

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre Lensfree çip üzerinde görüntüleme ve karakterizasyonu gösterilmiştir. Bu çip üzerinde hücre görüntüleme yaklaşımı, kaynak yoksul ayarları için özellikle uygun hale, tıbbi teşhis ve yüksek verimli hücre biyolojisi uygulamaları için kompakt ve maliyet-etkin bir araç sağlar.

Hücre Lensless-çip Görüntüleme Yüksek throughput Hücre Biyolojisi ve Tıbbi Teşhis için Yeni Aracı sağlar.

Onlar kendi ana mikroçevresinin geliştikçe birçok biyolojik ve klinik durumlarda hücresel süreçleri incelemek için avantajlıdır. Burada montaj ve hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik hasta çalışmaları, gerçek zamanlı görüntüleme sağlayacak bir düşük maliyetli, fiber-optik mikroskop kullanımını tanımlamak.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Hücresel mimarili normale Yapıştırıcı micropatterns, ilaç etkileri algılama duyarlılığını artırmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve otomatik görüntü elde edilmesi ve analizi basitleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji, geleneksel hücre kültürleri destekleyen üzerinde gerçekleştirilen ve dolayısıyla aşırı hücre-hücre değişkenlik muzdarip ilaç / siRNA tarama testleri, fayda sağlayacaktır.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntülerinin bir kombinasyonu aracılığıyla hücresel kütle, hacim ve yoğunluğun kantitatif ölçümlerini gerçekleştirmek için standart bir optik mikroskobun kullanımını açıklıyoruz.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Objektif-ücretsiz video mikroskobu hücre kültürleri doğrudan kuluçka makinesi içinde izlemek sağlar. Burada biz almak ve kültürlü HeLa hücreleri 2,7 gün uzun edinimi çözümlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak, 2.2 x 10 bir veri kümesi için önde gelen6 ölçümleri tek hücre morfolojisi ve 10584 hücre döngüsü izler.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk...

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Burada sunulan yöntem, memeliyle ilgili kültürlerin içinde uzamsal organizasyon ortaya çıkarmak için nicel görüntüleme ile birlikte micropatterning kullanır. Teknik standart bir hücre biyoloji laboratuarında kurmak kolaydır ve in vitro desen çalışması için bir uysal sistemi sunar.

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Bu protokol, karmaşık hücreden hücreye interdigitasyonları ve membran mimarisini incelemek için periferik, olgun ve nükleer göz merceği fiber hücrelerini immünofloresan boyama için hazırlama yöntemlerini açıklar.

Göz Merceğinin Korteks ve Çekirdeğinden Demetlerin ve Tek Fiber Hücrelerin Hazırlanması ve İmmünofloresan Boyanması

Bu protokol, 3D lazer baskı kullanılarak implante edilebilir bir entegre görüntüleme penceresinin imalatını açıklar. Pencere, mikro iskelelerle birleştirilmiş bir mikro mercek sisteminden oluşur. Yöntem, biyouyumlu fotorezist SZ2080'in sürekli bir sırayla iki fotonlu polimerizasyonunu (2PP) içerir ve üretim verimliliğini ve farklı bileşenler arasındaki hizalamayı optimize eder.

Gelişmiş In Vivo Görüntüleme için Mikroyapılı Görüntüleme Penceresine Entegre Edilmiş İmplante Edilebilir Optiklerin Mikrofabrikasyonu

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Keşfedin fare göz lensinin yapısını ve işlevini anlamak için tam montajlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile üç boyutlu doku yapısını koruyarak nicel analiz yapmanızı sağlar.

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Daha fazla video keşfet