Name: Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Öğrenin, asimetrik alan akış fraksiyonasyonu kullanan mikroakışkan cihazla büyük hacimli biyosıvılardan hücre dışı vezikülleri tek adımda izole etme yöntemini. Sürekli akış ve otomasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmaya katılan tüm bağışçılara, Letonya Genom Veritabanı personeline örnekleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Letonya Üniversitesi Katıhal Fiziği Enstitüsü, Mükemmeliyet Merkezi olarak, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Çerçeve Programı H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2'den 739508 No'lu hibe sözleşmesi, proje CAMART2. kapsamında fon aldı. Bu çalışma Letonya Bilim Konseyi Proje No. tarafından desteklenmiştir. lzp-2019/1-0142 ve Proje No: lzp-2022/1-0373.

İnsan İdrarından Sürekli Hücre Dışı Vezikül İzolasyonu için Mikroakışkan Cihaz

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A., G.M. ve R.R., Cellbox Labs, LLC'nin kurucuları, yönetim kurulu üyeleri ve hisse sahipleridir

Sunulan mikroakışkan cihaz, UC ve SEC12 gibi mevcut altın standart yöntemlerin bazı kritik sınırlamalarını ele alarak, EV'lerin biyolojik sıvılardan izolasyonu ve ekstraksiyonu için umut verici bir yöntem sunmaktadır. UC ve SEC'in emek yoğun, zaman alıcı olduğu ve düşük verimden muzdarip olduğu bilinmektedir, bu da onları büyük miktarlarda EV'ye ihtiyaç duyulan yüksek verimli uygulamalar için daha az uygun hale getirir21,22. Buna karşılık, tarif edilen mikroakışkan cihaz, minimum kullanıcı girdisi ile 20 mL'ye kadar önemli bir biyolojik sıvı hacmini sürekli olarak işleyebilir ve bu da onu endüstriyel veya klinik ortamlar için potansiyel bir oyun değiştirici haline getirir. Bu mikroakışkan cihazın en önemli avantajlarından biri, manuel adımları içeren geleneksel yöntemlere kıyasla EV izolasyonunu standartlaştırma ve tekrarlanabilirliği artırma yeteneğidir. Seri üretim yoluyla EV izolasyon cihazı üretiminin değişkenliğini azaltarak, cihazın performansı daha iyi kontrol edilebilir ve tutarlı olabilir, bu da EV tabanlı terapötikler ve teşhis gibi uygulamalar için hayati önem taşır. Ayrıca, cihazın uygun alt tabakaların reaksiyon enjeksiyonlu kalıplaması yoluyla büyük hacimli üretimle uyumluluğu, ölçeklenebilirlik ve daha geniş çapta benimsenme potansiyelini daha da artırır.
Tekrarlanabilirliği ve tutarlı performansı sağlamak için, hem çipi üretmek hem de deneylerde kullanmak için kapsamlı ve iyi tanımlanmış bir protokol gereklidir. Çip, sanayileşme göz önünde bulundurularak tasarlanmıştır. Bununla birlikte, laboratuvar ortamında cihaz imalatı sırasında, kabarcık oluşumundan kaçınmaya, hassas ve sağlam bir bağlanma sağlamaya ve gerçek deneylerde beklenenden daha yüksek akış hızlarında kapsamlı testler yapmaya dikkat edilmelidir. Bu önlem, özellikle daha yüksek akış hızlarında başarısız bağlanma nedeniyle sızıntıya eğilimli olabileceğinden, COC-OSTE cihazları için özellikle önemlidir. Ek olarak, OSTE ışığa duyarlı bir malzeme olduğundan, gereksiz UV'ye maruz kalmayı önlemek için cihaz imalatı sarı ışıkta yapılmalıdır. Bu teknoloji henüz başlangıç aşamasında olduğundan, bu yeni yöntem için standartlaştırılmış protokoller henüz oluşturulmadığından ve sıvı viskozitesi, sonuçlarımıza dayanarak EV izolasyon etkinliğini açıkça etkileyebileceğinden, araştırmacılar kendi özel uygulamaları için en uygun ayarı belirlemek için farklı akış hızlarını denemelidir. Bu yönergeleri izleyerek ve standardizasyonun zorluklarını ele alarak, bu mikroakışkan cihazın EV izolasyonu için potansiyeli, çeşitli araştırma alanları ve uygulamalarında tam olarak gerçekleştirilebilir.
Mikroakışkan cihazı kullanan EV izolasyon yöntemi, performansı optimize etmek için kapsamlı modifikasyon ve sorun gidermeye izin verir. Parçacık ayrımını iyileştirmek için araştırmacılar daha uzun kanalları, farklı membran gözenekliliklerini ve gözenek yoğunluklarını ve değişen boyutları keşfedebilirler. Küçük partikül çıkışında çok sayıda büyük partikül varsa, daha yüksek bir tampon giriş hızının test edilmesi faydalı olabilirken, büyük partikül çıkışında çok sayıda küçük partikül varsa, daha uzun bir kanal veya daha büyük gözenekli bir membran ile deney yapılması önerilir. Partikül absorpsiyonunun ele alınması, akış hızlarının, yüzey modifikasyonlarının ve OSTE bileşiminin ayarlanmasını veya UV'ye maruz kalma süresinin değiştirilmesini içerebilir. Kararsızlık ve sızıntı yaşayan cihazlar için akış hızlarının düşürülmesi ve uygun yapıştırmanın sağlanması çok önemli adımlardır. EV hasarını en aza indirmek için araştırmacılar akış hızlarını azaltabilir, cihaz sterilizasyonundan sonra PBS ile daha kapsamlı bir şekilde yıkayabilir ve daha küçük membran gözenekleri veya alternatif kalıp tasarım teknikleri ve malzemeleri kullanmayı düşünebilir. Bu ayarlamalar sayesinde, mikroakışkan cihaza ince ayar yapılabilir ve EV araştırmaları ve ilgili alanlarda çeşitli uygulamalar için potansiyelini ortaya çıkarır. Ek olarak, cihazın performansını optimize etmek için, akış parametrelerini ayarlamak için yoğunluk ve viskozite ölçümleri dahil olmak üzere yukarı akış numune karakterizasyonu dahil edilebilir. Ayrıca, biyoakışkanların steril olmadığı göz önüne alındığında, numunenin doğasına özel önem verilmelidir23. Sonuç olarak, klinik uygulamalarda örneklerin uygulanmadan önce sterilizasyonu gerektiği gibi düşünülmelidir.
Bu zorluklara rağmen, mikroakışkan cihaz çeşitli araştırma alanlarında muazzam bir potansiyele sahiptir. EV'leri büyük hacimlerde yüksek oranda heterojen numunelerden sürekli olarak izole etme yeteneği, otomasyonun kapısını açar, yüksek verimli uygulamaları kolaylaştırır ve çeşitli kaynaklardan gelen EV'lerin daha derinlemesine analizini sağlar. Bu mikroakışkan modülün içi boş fiber hücreli biyoreaktör kartuşları veya yüksek çözünürlüklü akış sitometreleri gibi farklı cihazlara entegre edilmesi, EV uygulamalarını daha endüstri dostu hale getirebilir ve ilaç dağıtımı, teşhis ve kozmetik gibi alanlarda yeniliği teşvik edebilir4. Genel olarak, bu mikroakışkan cihaz, EV araştırmaları alanında ileriye doğru atılmış önemli bir adımı temsil eder ve çok çeşitli araştırmalarda ve endüstriyel ortamlarda umut verici uygulamalarla EV izolasyonu için verimli ve standartlaştırılmış bir yöntem sunar.

Hücre dışı veziküller (EV'ler), iki ana tip içeren hücre kaynaklı zara bağlı parçacıklardır: eksozomlar (30-200 nm) ve mikro-veziküller (200-1000 nm)1. Eksozomlar, multiveziküler bir cisim (MVB) içinde endozomal membranın içe doğru tomurcuklanması yoluyla oluşur ve plazma membranı1 ile füzyon üzerine hücre dışı boşluğa intraluminal vezikülleri (ILV'ler) serbest bırakır. Buna karşılık, mikro-parçacıklar, hücre zarının2 dışa doğru tomurcuklanması ve fisyonu ile üretilir. EV'ler, proteinleri, nükleik asitleri, lipitleri ve metabolitleri taşıyarak, büyüme, anjiyogenez, metastaz, proliferasyon ve tedavi direnci dahil olmak üzere hücrenin fizyolojik durumunu yansıtarak hücreler arası iletişimde çok önemli bir rol oynar3. Sonuç olarak, kanser de dahil olmak üzere hastalıklar için umut verici biyobelirteçler ve terapötik hedefler olarak ortaya çıkmışlar ve teşhis ve ilaç dağıtım sistemlerindeki potansiyellerini vurgulamışlardır4.
Hastalık teşhisi ve tedavisinde EV'leri tam olarak kullanmak için, çeşitli biyosıvılardan verimli izolasyon çok önemlidir5. Yaygın yöntemler arasında ultrasantrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), filtrasyon ve immünoizolasyon6 bulunur. UC yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ancak EV olmayan ve EV agregaları üretebilen benzer yoğunlukta parçacıklar verebilir7. SEC, yoğunluk8 yerine boyuta dayalı parçacıkları hariç tutarak daha yüksek saflıkta numuneler sağlama yeteneği nedeniyle popülerlik kazanmıştır. Bununla birlikte, SEC kolonu için uygun gözenek boyutunun dikkatli bir şekilde seçilmesi ve kromatografi koşullarının optimizasyonu, şilomikronlar ve düşük yoğunluklu lipoproteinler gibi istenmeyen partiküllerin birlikte izolasyonunu en aza indirmek için gereklidir8. Etkinliklerine rağmen, her iki yöntem de özellikle hücre ortamı veya idrar gibi daha büyük hacimli numuneler için zaman alıcı ve otomatikleştirilmesi zordur, bu da endüstriyel uygulamalar için ölçeklenebilirliklerini sınırlar9.
Son yıllarda, asimetrik alan akış alanı fraksiyonlaması (A4F), boyut ve kaldırma kuvvetine dayalı mikro ve nanometre boyutlu partikül ayırma için güçlü bir ayırma tekniği olarak gelişmiştir10. A4F'nin çalışma prensibi, tabanında gözenekli bir zar bulunan ve çapraz akış10 adı verilen zara uygulanan bir kuvvet üreten bir mikroakışkan kanala dayanır. Sisteme özgü Brown hareketi ve Poiseuille akışı ile birleştirildiğinde, çapraz akış, akış dinamikleri11 içindeki değişen parçacık konumu nedeniyle verimli parçacık ayrımını kolaylaştırır. Faydalarına rağmen, bu yöntem mikrolitre aralığındaki numune hacimleri12 ile sınırlıdır ve işlemin süresiniuzatan ek bir odaklama adımı gerektirir 10.
Son on yılda, mikroakışkanlar hızlı, verimli ve klinik olarak güvenilir EV ayrımı için bir araç olarak öne çıkmıştır13. Bununla birlikte, EV ayırma için tasarlanan çoğu mikroakışkan yöntem, küçük hacimli, yüksek konsantrasyonlu EV numuneleri için optimize edilmiştir veya karmaşık ayırma prosedürlerinebağlıdır 14. Ayrıca, mikroakışkanlar alanında, polidimetilsiloksan (PDMS), optik şeffaflığı, biyouyumluluğu ve kullanım kolaylığı nedeniyle altın standart malzeme olarak kabul edilmektedir15. Bununla birlikte, EV'ler de dahil olmak üzere küçük lipofilik molekülleri absorbe etme eğilimi, EV alanındaki uygulaması için sorunlu olabilir13.
Siklik olefin kopolimeri (COC), biyouyumluluk, moleküllerin küçük absorpsiyonu ve yüksek kimyasal direnci nedeniyle mikroakışkanlarda sıklıkla kullanılan bir malzemedir15. Bununla birlikte, COC cihazlarının imalatı genellikle karmaşık süreçleri veya özel ekipmanı içerir16. Alternatif olarak, stokiyometri dışı tiyol-en (OSTE), küçük moleküllerin emiliminin azalması, üstün kimyasal stabilite, üretim kolaylığı ve ölçeklenebilir üretim süreci nedeniyle PDMS'ye umut verici bir alternatiftir17,18. Bununla birlikte, borulara yapılan karmaşık bağlantılar nedeniyle, cihazlar sızıntıyaeğilimli olabilir 19.
Bu çalışmanın amacı, idrar veya hücre ortamı gibi büyük hacimli numunelerden EV ayrımı için OSTE ve COC ve çatallı A4F prensibini birleştiren bir mikroakışkan cihaz tasarlamak ve üretmekti.

<table><tbody><tr><td>0.1 ve mikro; m karboksilat FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Stok konsantrasyonu: 3.6 x 1013 boncuk / mL (LOT'a bağlı)</td></tr> <tr><td>0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Luer koni şırınga iğnesiz tek kullanımlık</td><td>IŞINLAR</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &mikro; m polistiren FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Stok konsantrasyonu: 1 x 1010 boncuk/mL (LOT'a bağlı)</td></tr><tr><td>10 mL Serolojik</td><td>pipetler Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Amicon Ultra santrifüj filtreler</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Protein LoBind tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL şırınga</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 ve mikro; m ID polieter eter keton boru</td><td>Darwin Mikroakışkanlar</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO santrifüj filtre üniteleri</td><td>Merck Millipore,UFC200324</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 mL İğnesiz Tıbbi Şırınga</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti sabit açılı ultrasantrifüj rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 ve mikro; m ID politetrafloroetilen boru</td><td>Darwin Mikroakışkanlar</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu mikroplaka, f-alt, med. bağlayıcı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>ELISA plakası</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), serum içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas mikroskopi slayt platformu</td><td>Mikroakışkan Yonga Atölyesi</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas mikroskopi slayt platformu 2 x 16 Mini Luer ve nbsp;</td><td>Mikroakışkan Yonga Atölyesi</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 basınç kontrolörü</td><td>Elvesys Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer konektörleri</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Maske hizalayıcı Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Grup</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karıştırıcı Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>nanopartikül analizörü ve nbsp;</td></tr><tr><td>Optik mikroskop Nikon Eclipse LV150N,</td><td>Nikon Metroloji NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Kristal Berraklığında</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg ücretsiz. Fisher Biyoreaktifleri. 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC membran (50 nm gözenek çapı, %11,8 yoğunluk)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belçika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları, steril</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 nm sütun</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC sütunu</td></tr><tr><td>QSIL 216 Silikon Elastomer Kiti</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reçine Sert Siyah</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti salıncak ultrasantrifüj rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 süspansiyon şişesi</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc proteini</td><td>Adipojen Yaşam Bilimleri</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3 ',5,5'-tetrametilbenzidin)</td> <td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>Yaban turpu peroksidaz substratı</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleme ünitesi P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üniversal Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>Bio-Tek aletleri</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>İdrar toplama kabı, 150 mL, steril</td><td>APTACA 2120_SG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 Şırınga Filtresi</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalitik</td><td></td><td>dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>Zortrax Mürekkep Kulesi</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çatallı a4f mikroakışkan cihaz ile büyük hacimli Örneklerden hücre dışı veziküllerin tek adımlı İzolasyonu

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Hücre dışı veziküller (EV'ler), teşhis, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıp dahil olmak üzere çeşitli biyomedikal uygulamalar için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, EV'leri izole etmeye yönelik mevcut metodolojiler, karmaşıklık, zaman tüketimi ve klinik çevirilerini engelleyen hantal ekipman ihtiyacı gibi önemli zorluklar ortaya koymaktadır. Bu sınırlamaları ele almak için, EV'lerin büyük hacimli numunelerden sürekli bir şekilde verimli bir şekilde izole edilmesi için siklik olefin kopolimer-stokiyometri dışı tiyol-ene (COC-OSTE) dayalı yenilikçi bir mikroakışkan sistem geliştirmeyi amaçladık. Boyut ve kaldırma kuvvetine dayalı ayırmayı kullanarak, bu çalışmada kullanılan teknoloji, idrar ve hücre ortamı örneklerinden elde edilen mevcut yaklaşımlara kıyasla önemli ölçüde daha dar bir boyut dağılımı elde etti ve gelecekteki uygulamalarda belirli EV boyut fraksiyonlarının hedeflenmesini sağladı. Çatallı asimetrik akış alan akış fraksiyonlama teknolojisini kullanan yenilikçi COC-OSTE mikroakışkan cihaz tasarımımız, büyük hacimli numuneler için basit ve sürekli bir EV izolasyon yaklaşımı sunar. Ayrıca, bu mikroakışkan cihazın seri üretim potansiyeli, ölçeklenebilirlik ve tutarlılık sunarak, EV izolasyonunu, yüksek tutarlılık ve verimin temel gereksinimler olduğu rutin klinik teşhis ve endüstriyel süreçlere entegre etmeyi mümkün kılar.

Çatallı A4F prensibine dayalı yüksek verimli EV ayrımı için yumuşak litografi (Şekil 2A) aracılığıyla 3D baskılı çift negatif kalıp (Şekil 1) kullanarak bir mikroakışkan cihaz ürettik (Şekil 2B,C). Kurulum, EV'lerin otomatik bir şekilde izolasyonu için Şekil 3'te görülebileceği gibi bir pompa ve bir akış istasyonu gerektirir. İlk olarak, cihazların kavram kanıtını değerlendirmek için, sırasıyla vezikülleri ve ince hücre kalıntılarını temsil etmek için100&amp;L&amp;<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Hücre dışı veziküllerin potansiyelini görüyoruz, ancak aynı zamanda, özellikle biyoreaktör ortamı gibi büyük numune biyosıvılarından izolasyonlarındaki zorluğun da farkındayız. Bu araştırmada, hücre dışı vezikülleri izole etmek için asimetrik akış alan akış fraksiyonlamasını kullanıp kullanamayacağımızı test ettik. Şu an itibariyle, hücre dışı vezikülleri biyoreaktörlere entegrasyon için sürekli bir akışta doğrudan biyosıvılardan izole etmek imkansızdır.Bunun yerine, biyoakışkanlar önce toplanmalı ve işlenmelidir, bu da değişkenlik ve işçilik ekler. Büyük hacimli biyoakışkanlardan hücre dışı vezikül izolasyonu için tasarlanan cihazımız, sürekli akış ve otomasyon için biyoreaktörlerle entegrasyon sağlar. Sıvı viskozitesinin, asimetrik alan akış fraksiyonlaması kullanarak hücre dışı vezikül izolasyonunu etkileyebileceğini bulduk.Biyoakışkan ve tampon akışlarını viskoziteye uyarlamanın izolasyonu artırıp artıramayacağını araştırıyoruz.

single-step-isolation-extracellular-vesicles-from-large-volume

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Watson, D.C., ve diğerleri. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) bir bakteri kültürü filtratından izole etmek için gözenekli reçine boncukları ile boyut dışlama kromatografisinin kullanımını göstermektedir. Daha büyük EV'ler reçine gözeneklerini atlayarak erken ayrışırken, daha küçük proteinler gözeneklere girer ve daha sonra ayrışır.

Boyut Dışlama Kromatografisi Kullanılarak Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu 

Bu protokol, 10 kadar ul serum örneklerinden, hücre dışı veziküller (EVS), hücrelerden salınan küçük zar parçacıkları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu yaklaşım, ultra-santrifüj ihtiyacını önlediği deney süresi sadece birkaç dakika sürer ve sınırlı hacim örneklerinden EV'lerin izolasyonunu sağlar.

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli (0,15–1,5 ml) parçacık ayırma işlemleri gerçekleştirmek için bir sistem mimarisini tanımlar ve akustoakışkan cihaz performansını ve çalışmasını optimize etme yöntemlerini tartışır.

Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Burada, hücre tarafından üretilen doğal Nano opartiküllerden oluşan bir grup olan ekstrüllüler veziküller için depolama kararlılığını değerlendirmek üzere kolayca uygulanabilir bir protokol sunuyoruz. Veziküller bir model enzim olarak glukuronidaz ile yüklenir ve farklı koşullarda saklanır. Depodan sonra, fizikokimyasal parametreleri ve kapsüllenmiş enzimin aktivitesi değerlendirilir.

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.

Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Öğrenin, asimetrik alan akış fraksiyonasyonu kullanan mikroakışkan cihazla büyük hacimli biyosıvılardan hücre dışı vezikülleri tek adımda izole etme yöntemini. Sürekli akış ve otomasyon sağlar.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Daha fazla video keşfet