Name: Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Keşfedin, iki foton mikroskobuyla fare kesici dişlerindeki epitel hücrelerinin canlı görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, doku yenilenmesi sırasında hücre bölünmesi ve hareketlerini gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UCLA Gelişmiş Işık Mikroskobu/Spektroskopi Laboratuvarı'na ve California NanoSystems Enstitüsü'ndeki (RRID:SCR_022789) Leica Microsystems Mükemmeliyet Merkezi'ne iki foton mikroskobu sağladıkları için teşekkür ederiz. AS, İsrail Bilim Vakfı'ndan ISF 604-21 tarafından desteklenmiştir. JH, NIH/NIDCR'den R03DE030205 ve R01DE030471 tarafından desteklendi. AS ve JH, Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı'ndan (BSF) hibe 2021007 de desteklendi.

Tüm fareler, California Los Angeles Üniversitesi'nde (UCLA) veya Kudüs İbrani Üniversitesi'nde (HUJI) patojen içermeyen hayvan tesislerinde tutuldu. Fareleri içeren tüm deneyler, ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan yönetmelik ve protokollere göre gerçekleştirildi (ARC-2019-013; UCLA) veya (MD-23-17184-3; HUJI). Deneysel adımların genel bir iş akışı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm aletler, reaktifler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Çözelti ve jellerin hazırlanması
<ol><li>Diseksiyon ortamı: %0,5 glikoz içeren taze DMEM/F12 hazırlayın ve adım 2.4'te ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de sıcak tutun. NOT: Canlı görüntüleme sırasında otofloresansı azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen DMEM/F12 kullanıyoruz.</li>
	<li>1x Kültür ortamı:% 50 DMEM / F12,% 50 sıçan serumu,% 1 glutamin ikamesi, 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler,% 1 glikoz,% 0.1 mg / mL L-askorbik asit ve% 0.5 penisilin-streptomisin kullanarak taze ortam hazırlayın. Adım 5.5'te ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de sıcak tutun. Bu besiyeri, canlı görüntüleme sırasında kesici diş eksplantlarını kültürlemek için kullanılır. NOT: Sıçan serumu yüksek kalitede olmalı ve araştırmacılar tarafından veya ticari bir kaynaktan tüm doku kültürü için özel olarak hazırlanmalıdır. Özellikle, pıhtılaşma oluşmaya başlamadan önce kan santrifüj edilmelidir (oda sıcaklığında 1.200 × g'da 5 dakika). Santrifüjlemeden sonra ortaya çıkan fibrin pıhtısı sıkılmalı ve atılmalıdır33.</li>
	<li>Kültür jeli: Jelin amacı, görüntüleme sırasında numuneleri hareketsiz hale getirmektir ve taze olarak hazırlanır.<ol><li>Bir mikrodalga kullanarak 200 mg düşük erime noktalı agarozu 10 mL DMEM/F12 içinde çözerek DMEM/F12'de% 2 jel yapın. %2'lik jeli 37 °C'de tutun.</li>
		<li>% 50 sıçan serumu, 1 x glutamin ikamesi, 1 x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler,% 1 glikoz, 0.1 mg / mL L-askorbik asit ve% 0.5 penisilin-streptomisin karıştırarak 2x kültür ortamı (DMEM / F12 olmadan) yapın. 2x kültür ortamını (DMEM/F12 olmadan) 37 °C'ye ısıtın.</li>
		<li>Eşit hacimlerde% 2 jel ve 2x kültür ortamını (DMEM / F12 olmadan) karıştırarak% 1 kültür jeli yapın. Adım 5.1'de ihtiyaç duyulana kadar% 1 kültür jelini 37 ° C'de tutun. NOT: Jelleşmeyi önlemek için karıştırmadan önce tüm solüsyonların sıcak olduğundan emin olun. Yetişkin fare kesici dişlerini kültürlemek için %1 jelin uygun olduğunu gördük. Diğer dokular kültürlenecekse jel yüzdesi ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Yetişkin fare mandibulalarının çıkarılması
<ol><li>IACUC tarafından onaylanan standart prosedürleri kullanarak fareleri istenen yaşta ötenazi yapın. NOT: Burada CO2 boğulmasını takiben servikal çıkık kullanıyoruz. Hayvan ötenazisi için düzenlemeler farklı bölgelerde farklılık gösterebilir. Araştırmacılar, deneyleri gerçekleştirmeden önce gerekli kurumsal onayı almalı ve yerel hayvan bakımı yönetmeliklerine uygunluğu sağlamalıdır.</li>
	<li>Fareyi% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin.</li>
	<li>Farenin başını kesin ve sol ve sağ mandibulaları çıkarın.<ol><li>Fareyi karnının üzerine yatırın, ardından boyun bölgesini kesmek ve fare kafasını vücudun geri kalanından ayırmak için #9 tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçağı kullanın. NOT: Farenks veya boyun bölgesinden de dokular toplanacaksa, dekapitasyon yapılmamalıdır ve doğrudan adım 2.3.2'ye geçilebilir.</li>
		<li>Fareyi ventral tarafı yukarı bakacak ve mandibulalara kolayca erişilebilecek şekilde ters çevirin.</li>
		<li>Hayvanın başını başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe tutarak sabitleyin.</li>
		<li>Alt çenenin derisini alt dudaktan boyun çizgisine doğru kesen orta sagital bir kesi yapmak için tıraş bıçağını kullanın. NOT: İnsizyon ve sonraki diseksiyonları yapmak için #15 cerrahi bıçak da kullanılabilir (adım 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>Kesi yapılırken, altındaki kasları ve çene kemiğini ortaya çıkarmak için başparmak ve işaret parmağını kullanarak kesilen deriyi açın.</li>
		<li>Alt çenenin bukkal tarafındaki masseter kaslarını kesmek için tıraş bıçağını kullanın, böylece sol ve sağ yarımların dış kısmı artık kas eklerinden arınmış olur.</li>
		<li>Oradaki kas eklerini çıkarmak için mandibulanın iç tarafındaki mylohyoid kasları kesin.</li>
		<li>İki hemimandible'ı birbirine bağlayan mandibular simfizde başka bir kesi yapın. Kesildikten sonra mandibula sol ve sağ yarıya ayrılacaktır.</li>
		<li>Tıraş bıçağını mandibular kondil ile temporal mandibular eklem arasına sıkıştırın ve hemimandible'ı başın geri kalanından dikkatlice çıkarın. NOT: Keserken aynı anda kesici dişi nazikçe çekmeyi faydalı bulduk. Alt çenenin kırılmamasına ve içindeki yumuşak dokulara zarar vermemesine özen gösterilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseke edilmiş mandibulaları önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı ile hemen bir Petri kabına aktarın (adım 1.1) ve kalan kas dokularını #15 cerrahi bıçak kullanarak çıkarın. NOT: Numunelerin soğuk ortamda tutulması, hücre aktivitelerini yavaşlatır, bu da canlı görüntüleme sırasında proliferasyon veya hücre hareketi gibi belirli hücre aktivitelerinin gecikmeli ve hatta başarısız bir şekilde geri kazanılmasına neden olur.</li>
</ol>3. Tüm fare kesici dişlerinin izolasyonu
NOT: Kesici dişin daha fazla izolasyonu, parlak alan diseksiyon mikroskobu altında yapılır.
<ol><li>Kesici diş yuvasını kaplayan ve kesici dişin apikal kısmını barındıran mandibulanın oval bölgesini görsel olarak tanımlayın.</li>
	<li>Mandibulayı iç (lingual) yüzey yukarı bakacak şekilde konumlandırın.</li>
	<li>Mandibulayı bir çift tırtıklı forseps ile yerinde tutarken, kondilden azı dişlerine doğru bir yönde #15 cerrahi bıçak kullanarak üstteki zar kemiğini tıraş ederek oval bölgede bir pencere oluşturun. Bu, apikal kesici dişin yumuşak dokusunu iç yüzeyde ortaya çıkarır.</li>
	<li>Mandibulayı, dış (bukkal) yüzey yukarı bakacak şekilde ters çevirin.</li>
	<li>Adım 3.3'te açıklandığı gibi dış mandibuladaki oval bölgede bir pencere oluşturun ve kenarda kalan kemik parçalarını almak için neşterin ucunu kullanın. Dişin apikal ucunun her iki taraftan da görünür olduğundan emin olun. NOT: Alttaki yumuşak dokuya zarar vermemek için kemikleri tıraş ederken aşırı basınçtan kaçının.</li>
	<li>Tüm dişi izole etmek için kesici dişi çevreleyen kemikleri sistematik olarak kesin.<ol><li>Önce kondiler işlemi çıkarmak için apikal kesici dişin hemen bitişiğindeki bir düzlemde temiz bir kesim yapın. NOT: Kesici dişi kesmemeye dikkat edin.</li>
		<li>3. azı dişinin hemen arkasında, ancak dişe zarar vermeden kesici dişin dorsalinde ikinci bir kesi yapın. Bu, koronoid süreci içeren kemiği çıkarır.</li>
		<li>Ventral mandibulayı kademeli olarak kademeli olarak çıkarmak için açısal işlemin ucundan kesici kısma doğru seri olarak kesin. NOT: Diş epiteli ve ilişkili periodontal dokular genellikle kemiğe yapışır ve ventral kemiğin büyük bir kısmı bir kerede kesilirse kolayca kopar. Kemiği kesici yumuşak dokudan ayırmak için, neşter (veya bir çift keskin tırtıklı olmayan forseps) kesici dişin apikal ucundaki iki doku arasına yerleştirilebilir ve alet hassas bir şekilde ileri kaydırılabilir.</li>
		<li>Alveolar kemiği azı dişleri ve hala kesici dişlere bağlı kalan kemiklerle kesin.</li>
		<li>Tüm kesici diş şimdi izole edilmiştir. Tamamen diseke edilmiş kesici dişi temiz, sıcak diseksiyon ortamı olan bir kaba aktarın (adım 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Gerektiğinde ek kesici dişleri izole etmek için 3.2-3.6 adımlarını tekrarlayın. NOT: Farenin maksiller/üst kesici dişleri de yetişkin kök hücreleri korur ve diş rejenerasyonunu incelemek için kullanılabilir34. Diş araştırmacıları tipik olarak alt kesici dişlere odaklanır çünkü bunlar daha erişilebilirdir ve üst kesici dişlerden daha kolay diseke edilebilir. Mandibular ve maksiller kesici progenitör hücreler arasındaki farklar henüz belirlenmemiştir.</li>
</ol>4. Kesici epitelyal servikal halkayı ortaya çıkarmak için periodontal dokuların çıkarılması
<ol><li>Tüm kesici diş lingual tarafında yatarken ve dişi bir çift tırtıklı forseps ile yerinde tutarken, apikal kesici dişi ve servikal halka bölgesini kaplayan periodontal dokuları sıkıştırmaya başlamak için bir çift #5 ince forseps kullanın.</li>
	<li>Periodontal dokuyu apikal tomurcuktan dikkatlice soyun, böylece servikal döngünün (veya diğer ilgi bölgelerinin) lateral tarafı kapsam altında görünür hale gelir. NOT: Diş epiteline zarar vermemek veya mezenşimden ayrılmamak için özen gösterilmelidir. Kesici dişin ilgilenilen bölgede floresan sinyalleri varsa ve bir floresan diseksiyon mikroskobu mevcutsa, doku tiplerini ayırt etmeye yardımcı olmak ve diseksiyonlara yardımcı olmak için floresan sinyalleri kullanılabilir. Numunelerin hızlı bir şekilde kültür ortamına aktarılabilmesi ve eksplant kültürü yoluyla yeterince korunabilmesi için bölüm 2-4'ün verimli bir şekilde yürütülmesi önemlidir (aşağıya bakınız).</li>
</ol>5. Eksplant kültürü için doku gömme
<ol><li>24 oyuklu bir plakadaki bir kuyucuğa 500 μL ılık, katılaşmamış kültür jeli ekleyin ve diseke edilen bütün kesici dişleri hızlı bir şekilde kuyuya aktarın. Kesici dişleri durulamak için plakayı birkaç kez döndürün.</li>
	<li>Bir kültür kabına 400 μL ılık, katılaşmamış kültür jeli ekleyin ve durulanmış kesici dişleri tabağa aktarın. NOT: Perfüzyon kurulumuyla uyumlu, piyasada bulunan bir kültür kabı kullanıyoruz. Alternatif seçenekler için adım 6.4'e bakın.</li>
	<li>Servikal halka bölgesini (veya ilgilenilen diğer bölgeleri) çanağın ortasına yerleştirmek için kesici dişi yönlendirin (Şekil 2A,B) ve apikal kesici dişin eğimini istenen görüntüleme düzlemi için ayarlayın. NOT: Doku oryantasyonu, tam jelleşmeden önce hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Jel sertleştikten sonra, jel ile kaplanmaması için ilgilenilen bölgenin üstündeki herhangi bir jeli çıkarmak için bir çift ince forseps kullanın.</li>
	<li>Numuneyi (~150 μL) kaplayacak şekilde tabağın kenarına yavaşça pipetleyerek yeterli hacimde ılık kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Doku çökelmesine ve 1 saat boyunca kültür durumuna uyum sağlamasına izin vermek için eksplant kültürünü 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.</li>
</ol>6. Kesici diş eksplantlarının timelapse mikroskobu
NOT: Bu deneyde, sayısal açıklığı 1 olan 25x suya daldırma objektifi ile donatılmış dik bir mikroskop kullandık. Genel olarak, yüksek sayısal açıklığa sahip bir su daldırma merceği, derin doku görüntüleme için en uygunudur.
<ol><li>Mikroskobu ve iki fotonlu lazeri açın.</li>
	<li>Kültür çanağını s'ye sabitleyintage adaptör ve perfüzyon adaptör halkasını üstüne monte edin (Şekil 2C).</li>
	<li>Kültürü 37 °C'de tutmak için s'yi bir sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.</li>
	<li>Adaptör halkasının giriş ve çıkışını bir mikro perfüzyon pompasına bağlayın ve pompada perfüzyon hızı 20'ye ayarlanmış olarak kültür ortamının perfüzyonuna başlayın. Bu, numunelerin üst kısmında kültür ortamının yavaş bir akışını (~5 mL/h) oluşturur (Şekil 2C). NOT: Dokuyu stabil bir şekilde kontrol edilen bir ortamda tutmak için sistemle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Diğer sistemler de kullanılabilir. 37 °C'lik bir ısıtma plakası ve şırınga pompalarına bağlı bir giriş ve çıkışa sahip ev yapımı bir perfüzyon kültürü kabının (Ek Şekil S1) bir kombinasyonu da kullanılabilir.</li>
	<li>Adaptör halkasının üzerine bir Atmosferik Kontrol Bariyeri Halkası (ACBR) yerleştirin ve sadece kültür ortamıyla temas etmek için hedefi ACBR'den indirin (Şekil 2D).</li>
	<li>Hem GFP hem de kırmızı floresan (örn. tdTomato) sinyallerini görselleştirmek için lazer dalga boyunu 920 nm'ye ayarlayın.</li>
	<li>Örnekleri göz merceklerinden ve ardından mikroskobun yazılımından bulun.</li>
	<li>Yazılımı kullanarak Z yığınlarını, çok konumlu görüntülemeyi ve zaman aralıklarını ayarlayın. Bu protokolü takip etmek için, 4 μm'lik bir z adımı boyutu ve 14 saat boyunca 5 dakikalık bir zaman aralığı kullanın. NOT: 5 dakikadan daha uzun bir zaman aralığının, düzgün hücre hareketlerini ve bölünmelerini yakalamak için genellikle yetersiz olduğunu bulduk.</li>
	<li>Timelapse görüntülemeyi başlatın. NOT: Numune konumu ilk bir saat içinde değişebilir ve daha fazla ayarlama gerekebilir.</li>
	<li>Aşağı akış veri işleme ve analizleri için dosyaları kaydedin.</li>
</ol>

İki foton mikroskobu ile diş hücrelerinin canlı takibi

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Canlı doku görüntüleme, hücrelerin niş ortamlarında tutulduklarında dinamik süreçlerini ve davranışlarını incelememizi sağlayan önemli bir tekniktir41. İdeal olarak, canlı görüntüleme yüksek uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, memeli organları için in vivo görüntüleme, doku erişilemezliği, optik opaklık ve hayvanı veya organı uzun süre hareketsiz hale getirme zorluğu nedeniyle zor olabilir42. Doku eksplantları bu z...

Son yirmi yılda, fare kesici dişi, yetişkin kök hücre regülasyonu ve diş rejenerasyonuilkelerini araştırmak için paha biçilmez bir platform olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Fare kesici diş sürekli büyür ve hayvanın yaşamı boyunca kendini yeniler. Bunu, kendi kendini yenileyebilen ve dişin farklı hücre tiplerine farklılaşabilen hem epitelyal hem de mezenkimal kök hücreleri koruyarak yapar 1,2. Dental epitelyal kök hücreler mine matriksini salgılayan ameloblastlara yol açarken, dental mezenkimal kök hücreler sırasıyla dentin, sement ve periodontal ligament oluşturan odontoblastlara, sementoblastlara ve fibroblastlara yol açar 3,4,5,6. Bu sürekli yeni hücre kaynağı, doku homeostazını korur ve çiğneme aşınması veya yaralanmalar nedeniyle kaybedilen eski hücrelerin değiştirilmesine izin verir 7,8. Bu nedenle, dental kök hücrelerin korunmasını ve farklılaşmasını düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması, artan bir ilgi alanı olan dental rejenerasyonu anlamanın merkezinde yer almaktadır.
Anatomik olarak, yetişkin fare kesici dişinin büyük bir kısmı çene kemiği ile kaplıdır. Dişin insizal kenarı açıktayken, kesici dişin apikal ucu bir yuvaya oturur ve periodontal ligamentler ve bağ dokuları aracılığıyla çevre kemiğe sıkıca tutunur (Şekil 1A,B). Kesici dişin apikal ucu aynı zamanda dişin büyüme bölgesidir ve hem epitel tabakasında hem de mezenkimal pulpada diş sapı ve progenitör hücreleri korur 9,10,11,12,13. Spesifik olarak, diş epitelyal kök hücreleri, apikal tomurcuk olarak bilinen ve labial servikal döngü olarak da adlandırılan epitelin soğanlı ucunda tutulur (Şekil 1C). Bağırsak epiteli ve epidermise benzer şekilde, kesici dişteki epitelyal yenilenme, öncelikle aktif olarak döngüsel kök hücreler ve bunların transit-amplifikasyon hücreleri 14,15,16,17 olarak adlandırılan, her ikisi de servikal döngünün iç kısmında bulunan yüksek oranda proliferatif ara torunları tarafından desteklenir. Bununla birlikte, kesici epitelin rejenerasyon sırasında hareketsiz kök hücreler içerip içermediği ve kullanıp kullanmadığı henüz belirlenmemiştir. Buna karşılık, apikal pulpada hem aktif hem de hareketsiz dental mezenkimal kök hücreler tanımlanmıştır ve hareketsiz kök hücreler, yaralanma onarımı sırasında aktive olan bir yedek popülasyon olarak işlev görür13,18.
Fare kesici dişlerin yenilenmesi ve yenilenmesinin biyolojisi üzerine yapılan keşiflerin çoğu, örneklerin farklı zamansal kavşaklarda elde edildiği, sabitlendiği, işlendiği ve daha sonra belirli bir düzlem boyunca mikron inceliğinde dilimler halinde bölümlere ayrıldığı histolojik araştırmalardan kaynaklanmıştır. Bilim adamları, soy takibini veya genetik bozulmaları mümkün kılan farklı fare modellerinden alınan histolojik kesitlerin ayrıntılı analizi yoluyla, farklı progenitör popülasyonların hücre soylarının yanı sıra kesici diş homeostazını ve yaralanma onarımını kontrol eden genetik ve sinyal yollarını tanımladılar 19,20,21. Bununla birlikte, bölümlerdeki hayati olmayan hücrelerin statik iki boyutlu (2B) görüntüleri, hücre şekli değişiklikleri, hareketleri ve hücresel kinetik gibi canlı dokudaki hücresel davranışların ve uzamsal organizasyonların tam spektrumunu yakalayamaz. Doku kesiti ile çözülemeyen bir zaman ölçeğinde meydana gelen bu hızlı hücresel değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek farklı bir strateji gerektirir. Ayrıca, bu tür bilgileri edinmek, diş hücrelerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini, farklı sinyal uyaranlarına nasıl tepki verdiğini ve doku yapılarını ve işlevlerini korumak için kendi kendini nasıl organize ettiğini anlamak için de kritik öneme sahiptir.
Üç uzamsal boyutu zamansal çözünürlükle bütünleştiren bir teknoloji olan iki foton mikroskobu22 kullanılarak dört boyutlu (4D) derin doku görüntülemenin ortaya çıkışı, kültürlenmiş doku eksplantlarının, organoidlerin ve hatta dokuların yerinde uzay-zamansal incelemesini sağlayarak histolojik analizin doğal sınırlamalarının üstesinden gelir 23,24,25,26 . Örneğin, gelişmekte olan diş epitelinin 4 boyutlu canlı görüntülemesi, doku büyümesini, sinyal merkezi oluşumunu ve diş epitel morfogenezini koordine eden hücre bölünmelerinin ve göçlerinin uzay-zamansal modellerini ortaya çıkarmıştır 27,28,29,30,31,32. Yetişkin fare kesici dişinde, 4D görüntüleme son zamanlarda diş epitel yaralanması onarımı sırasında hücresel davranışları incelemek için uyarlanmıştır. Canlı görüntüleme, suprabazal tabakadaki stratum intermedium hücrelerinin, hasarlı epiteli yeniden oluşturmak için bazal tabakada doğrudan ameloblastlara dönüştürülebileceğini ortaya koydu ve geleneksel epitel hasarı onarımı paradigmasınameydan okudu 15.
Burada, labial servikal döngüdeki epitel hücrelerine odaklanarak yetişkin fare kesici dişinin diseksiyonunu, kültürlenmesini ve görüntülenmesini açıklıyoruz (Şekil 1). Bu teknik, diş hücresi canlılığını 12 saatten fazla korur ve floresan etiketli hücrelerin tek hücre çözünürlüğünde canlı olarak izlenmesine izin verir. Bu yaklaşım, hücre hareketi ve göçünün yanı sıra normal kültür koşulları altında veya genetik, fiziksel ve kimyasal bozulmalara yanıt olarak hücre şekli ve bölünme oryantasyonundaki dinamik değişikliklerin araştırılmasına izin verir.

<table><tbody><tr><td>24 kuyulu, düz tabanlı doku kültürü plakası</td><td>Olympus plastikler</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>25x HC IRAPO motCORR suya daldırma objektifi</td><td>Leica</td><td>11507704</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit (C Vitamini)</td><td>Acros Organics</td><td>352685000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Delta T sistemi&nbsp;</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4</td><td>Sıcaklık kontrolü, kültür yemekleri ve perfüzyon kurulumu dahil</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu- LEICA S9E</td><td>Leica</td><td>LED300 SLI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11039047</td><td>Fenol kırmızısı içermeyen bazal ortam</td></tr><tr><td>Tüy cerrahi bıçak (# 15)</td> <td>Tüy</td><td>72044-15</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Glutamin ikamesi</td></tr><tr><td>Leica SP8-DIVE 25X HC IRAPO motCORR su daldırma objektifi ile donatılmıştır &</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>düşük erime noktalı agaroz</td><td>NuSieve</td><td>50080</td><td></td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asitler (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>penisilin&ndash; streptomisin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Gen Klon</td><td>32-107G</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Sıçan serumu</td><td>Vadi Biyomedikal</td><td>AS3061SC</td><td>Canlı görüntüleme için işlenmiştir</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı #9</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Neşter sapı</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>FST</td><td>37133</td><td></td></tr><tr><td>tırtıklı forseps</td><td>FST</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>yaylı makas</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

fare diş yenileme sırasında hücre bölünmelerini ve hareketlerini araştırmak için ex vivo canlı görüntülemeyi kullanma

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

Sürekli büyüyen fare kesici dişi, yetişkin epitelyal ve mezenkimal kök hücrelerin düzenlenmesini ve diş rejenerasyonunu araştırmak için oldukça izlenebilir bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Bu progenitör popülasyonlar, doku homeostazını korumak ve kayıp hücreleri duyarlı bir şekilde yenilemek için aktif olarak bölünür, hareket eder ve farklılaşır. Bununla birlikte, sabit doku kesitlerini kullanan geleneksel analizler, hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini yakalayamadı ve bu da düzenlemelerini inceleme yeteneğimizi sınırladı. Bu makale, bir eksplant kültür sisteminde tüm fare kesici dişlerini korumak ve multifoton timelapse mikroskobu kullanarak canlı diş epitel hücrelerini izlemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu teknik, diş araştırmaları için mevcut araç kutumuza katkıda bulunur ve araştırmacıların canlı bir dokudaki hücre davranışları ve organizasyonları hakkında uzay-zamansal bilgi edinmelerini sağlar. Bu metodolojinin, araştırmacıların hem diş yenilenmesi hem de rejenerasyon sırasında meydana gelen dinamik hücresel süreçleri kontrol eden mekanizmaları daha fazla keşfetmelerine yardımcı olacağını tahmin ediyoruz.

Yetişkin fare kesici dişinin apikal bölgesi mandibula içinde yer alır (Şekil 1) ve bu nedenle, büyüme bölgesinde bulunan progenitör hücreleri görselleştirmek ve canlı izlemek için doğrudan erişilebilir değildir. Bu nedenle, tüm kesici dişin çene kemiğinden çıkarılması ve iki fotonlu timelapse mikroskobu için bir eksplant kültür sisteminde tutulması için bir yöntem geliştirdik (Şekil 2). Burada, diş epitelinin labial servikal döngü bölgesindeki hücre proliferasyo...

Ex vivo canlı görüntüleme, canlı dokulardaki hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini incelemek için güçlü bir tekniktir. Burada, kültürlenmiş tüm yetişkin fare kesici dişlerinde diş epitel hücrelerini canlı izlemek için iki foton mikroskobu uygulayan bir protokol sunuyoruz.

Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Organ yenilenmesi sırasında doğru hücresel organizasyonu sürdürmek için, hücrelere yaklaşan doku hareket eder ve belirli yönelimleri ve kalıpları böler. Bu nedenle, bu dinamik hücresel olayların kurallarını ve düzenlemelerini anlamak önemlidir. Fare kesici dişi, yetişkin kök hücre araştırmaları için ortaya çıkan bir modeldir ve sistemde gen fonksiyonlarını incelemek ve soy takibi için hücreleri etiketlemek için birçok genetik araç mevcuttur.Bugüne kadar yapılan çalışmaların çoğu, belirli zaman noktalarında toplanan ve sabitlenen yetişkin diş örneklerini kullanır ve bu, yaşam hücresi davranışını incelememizi engeller. Bu protokolde, yetişkin fare kesici dişlerindeki yaşam tarzlarını izlemek için bir yöntem tarif ediyoruz ve bu teknik, dinamik hücre davranışlarının diş dokularının yenilenmesine ve onarımına nasıl katkıda bulunduğunu anlamayı amaçlayan gelecekteki çalışmaları mümkün kılacaktır.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak fare sekonder damak füzyonunun canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktayız. Bu protokol, çeşitli floresan muhabir fare hatları ve mekanik içgörü için yol inhibitörleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, diğer gelişimsel sistemlerde canlı görüntüleme için uyarlanabilir.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

Farelerde ortodontik diş hareketi oluşturmak için bir protokol ve periodontal ligamentin kollajen liflerinin ve kan damarlarının bölümlenmeden 3D görselleştirilmesi için yöntemler sunuyoruz.

Mandibular Murine Modelinde Ortodontik Diş Hareketi Sırasında PDL Kollajen Liflerinin 3D Görüntülenmesi

Fare kesicisi, kök hücre nişinde değerli etiket tutucu hücreler içerir. Etiket tutucu hücreleri tarafsız bir şekilde tespit etmek ve ölçmek için yeni bir yolumuz var; Çalışmamızda EdU etiketleme ve PEGASOS dokusunun mandibuladan temizlenmesinden sonra 3D rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır.

Doku Temizliğinden Sonra 3D Rekonstrüksiyon Yaklaşımı Kullanılarak Fare Kesici Dişlerinde Etiket Tutan Hücrelerin Tespiti ve Kantitasyonu

İmmünofloresan görüntüleme, karmaşık, zamana bağlı biyolojik süreçleri zaman içinde tek bir anlık görüntüde gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bu çalışma, hassas kesilmiş fare submandibular bez dilimleri üzerinde yürütülen canlı görüntüleme yaklaşımını özetlemektedir. Bu yaklaşım, homeostaz ve rejenerasyon ve onarım süreçleri sırasında hücre-hücre etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin verir.

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Burada, kalp ve kas progenitör hücrelerinin ve mikro çevrelerinin biyolojisini incelemek için faringeal kemerleri kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Keşfedin, iki foton mikroskobuyla fare kesici dişlerindeki epitel hücrelerinin canlı görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, doku yenilenmesi sırasında hücre bölünmesi ve hareketlerini gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma

Daha fazla video keşfet