CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

Araştırmamız, özellikle hiperglisemi bağlamında apoptoz ve nekroptoz arasındaki dengeyi inceleyen memeli programı hücre ölümüne odaklanmaktadır. Son zamanlarda, hücre ölümü proteini RIP1 kinazın nekroptoz sırasında gen ekspresyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Mevcut deneysel zorluğumuz, süspansiyon halinde büyüyen bağışıklık hücrelerini genetik olarak manipüle etmek, özellikle CRISPR-Cas1 kullanarak RIP9 kinaz genini devre dışı bırakmaktır.

Protokolümüz iki farklı avantaj sunmaktadır. Lentivirüs kullanarak süspansiyon halinde büyüyen bağışıklık hücreleri için transfeksiyon yöntemlerini geliştirir ve CRISPR-Cas9 kullanarak genetik nakavt oluşturma sürecinde tek hücre klonlama ihtiyacını ortadan kaldırır. Sonuçlarımız, RIP1 kinazın nekroptozdaki hiperglisemik değişimdeki rolünü incelemenin yolunu açtı. Çeyrek çizgisine başlamak için Escherichia koli lentiviral vektör kılavuz RNA'sını barındıran Luria-Bertani veya LB agar plakaları mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile desteklenmiştir.

Plakaları, plakadaki en seyreltik alanda tek tek koloniler görünene kadar bir ila iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, steril bir döngü kullanarak, tek bir koloni seçin ve 50 mililitrelik konik bir tüpte mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile desteklenmiş beş mililitre LB suyuna ekleyin. Tüpün kapağını havalandırın ve bantlayın.

Tüpü bir orbital çalkalayıcıda 37 santigrat derece ve 225 RPM'de sekiz saat inkübe edin. Bu arada, dört adet 50 mililitrelik tüpe mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile desteklenmiş 40 mililitre LB suyu ekleyin. İnkübasyondan sonra, yetiştirilen kültürün 40 mikrolitresini dört tüpün her birine aktarın.

Tüplerin kapaklarını 37 santigrat derece ve 225 RPM'de 12 ila 16 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe etmeden önce havalandırın ve bantlayın. Ertesi gün, kültürleri 20 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda 3.220 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları bir atık behere boşaltın ve dört peleti de ampisilin ile desteklenmiş 10 mililitre LB suyunda birleştirin.

Tek bir pelet elde etmek için birleştirilmiş peletleri sallanan bir kova rotorunda 20 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin ve mümkün olduğu kadar çok süpernatantı atık behere atın. HEK293T hücreleri, altı hücrenin gücüne 10 ila üç ila beş kat konsantrasyonda DMEM içeren bir T25 şişesine tohumlayın. Şişeyi gece boyunca 37 santigrat derecede %5karbondioksit ile inkübe edin.

Bu arada, transfeksiyon karışımını, 1:1:1:1 oranında plazmit ve 3:1 oranında transfeksiyon reaktifinin plazmit DNA'sına indirgenmiş serum ortamı kullanarak hazırlayın. 75 mikrolitre transfeksiyon reaktifi, 2.500 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve 25 mikrogram toplam plazmit DNA'yı karıştırın. Karışımın oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edilmesine izin verin.

Daha sonra, transfeksiyon karışımını, ortam içeren şişedeki birleşen HEK293T hücrelerine dikkatlice pipetleyin. Karışımın yeterli homojenizasyonunu sağlamak için şişeyi hafifçe döndürün ve 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. İki günlük inkübasyondan sonra, ortamı üreticiden HEK293T hücre şişesinden 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Kalan HEK293T hücrelerini peletlemek için tüpü beş dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatant içeren tüm virüsü dikkatlice çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Altı hücrenin gücüne 2 x 10'luk bir pelet elde etmek için gerekli U937 hücre süspansiyonu hacmini sayın ve hesaplayın.

Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve hücre peletini tüpte bırakarak süpernatanı boşaltın. Hücre peletini süpernatan içeren virüs içinde yeniden süspanse edin ve tüpü 60 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından, peleti tüpte süpernatant içeren virüs ile yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.

Tüpü 60 dakika boyunca uç döndürücünün üzerine yerleştirin. Daha sonra tüpü 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve peleti, süpernatanlar ve %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı içeren virüsün 1:1 oranında yeniden süspanse edin. Hücre karışımını yeni bir T25 doku kültürü şişesine aktarın ve 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, U937 hücrelerini 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Pelet, %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve mililitre puromisin başına beş mikrogram ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre kültürünü bir T25 şişesine aktarın.

Hücreleri iki ila üç hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreleri her bir ila iki günde bir büyüme belirtileri açısından kontrol edin. Western blot analizi, vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerindeki güçlü sinyale kıyasla saptanabilir bir sinyal olmadan RIP1 CRISPR mutant hücrelerinde RIP1 protein ekspresyonunun kaybını doğruladı. TCZ ile tedavi, vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerinde önemli nekroptotik hücre ölümüne neden oldu ve bu, nekrostatin-1 tedavisi ile tersine çevrildi.

Buna karşılık, RIP1 CRISPR nakavt hücreleri, nekrostatin-1'lerin hiçbir etkisi olmayan vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha düşük hücre ölümü gösterdi, bu da RIP1 fonksiyonunun kaybını gösterir. Canlı hücre floresan mikroskobu, nekrostatin-1 tedavisi üzerine azalan TCZ tedavisini takiben vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerinde mitokondriyal süperoksit üretiminde önemli bir artış gösterdi. RIP1 CRISPR nakavt hücreleri, nekrostatin-1 tedavisinin gözlemlenebilir bir etkisi olmaksızın minimal mitokondriyal süperoksit üretimi sergiledi.