Name: CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Keşfedin CRISPR/Cas9 ile insan hücre hattında RIPK1 gen nakavtı oluşturma yöntemini. Bu teknik genetik araştırmalarda hassas gen düzenlemesi için etkili bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Gostimskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%E2%80%93Cas9%3A+A+History+of+its+discovery+and+ethical+considerations+of+its+use+in+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+%28Mosc.%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing.</a> Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Educ+Pract+Ed%22%5BJournal%5D)">What is CRISPR/Cas9.</a> Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).</li>
<li>Ebrahimi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+CRISPR+PX-LmGP63+vector+effect+on+pathogenicity+of+Leishmania+major+as+a+primary+step+to+control+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis.</a> Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).</li>
<li>Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+px-lmgp63+using+crispr-cas9+as+primary+goal+for+gp63+gene+knockout+in+Leishmania+major+and+leishmanization%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization.</a> Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).</li>
<li>Lim, J. M., Kim, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+and+clinical+applications+of+CRISPR-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing.</a> Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+delivery+to+hard-to-transfect+cells+via+membrane+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation.</a> Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+for+the+study+of+hematopoietic+cells+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models.</a> J Vis Exp. (152), e59977(2019).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).</li>
<li>Mccaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Dis. , 1-14 (2018).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+prime+the+hyperglycemic+shift+from+apoptosis+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis.</a> Cell Death Dis. 6 (1), (2020).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+of+MLKL%2C+Bak%2FBax%2C+and+Drp1+Is+mediated+by+RIP1+and+ROS+which+leads+to+decreased+mitochondrial+membrane+integrity+during+the+hyperglycemic+shift+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).</li>
<li>LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemic+conditions+prime+cells+for+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis.</a> J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cytosolic+ATM%2FNEMO%2FRIP1+complex+recruits+TAK1+To+mediate+the+NF-%CE%BAB+and+p38+Mitogen-Activated+Protein+Kinase+%28MAPK%29%2FMAPK-activated+protein+2+responses+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).</li>
<li>Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+RIP+kinases+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions.</a> Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+in+the+inflammatory+response+and+sepsis%3A+Recent+advances%2C+drug+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond.</a> Front Immunol. 14, 1114103(2023).</li>
<li>Kowolik, C. M., Yee, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+human+hepatocytes+with+lentiviral+vectors+pseudotyped+by+Sendai+virus+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein.</a> Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Transfecting Macrophages.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+and+U937+cells.+The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22models%22%5BJournal%5D)">THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo.</a> models. 159 (147), (2015).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).</li>
<li>Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of immune cells.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ayarlanmış DMEM Ortamı</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A1593 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimid Hoechst 33342 trihidroklorür</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Komple RPMI-1640 Orta</td><td>Sigma</td><td>R6504 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR NTC gRNA E.coli Suşu</td><td>transOMİK</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR RIP1 gRNA E.coli Suşu</td><td>transOMİK</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>Uçtan uca Döndürücü</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Floresan Mikroskobu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenElute Plazmid Maxiprep Kiti</td><td>Sigma</td><td>PLX15 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG Antikoru, (H+L) HRP konjugatı</td><td>Sigma</td><td>AP307P Serisi</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka Makinesi Çalkalayıcı</td><td>New Brunswick Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Lentiviral Ambalaj Karışımı</td><td>Gibco</td><td>A43237 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Kırmızı</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-D1055 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektrofotometre</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nekrostatin-1</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Sigma</td><td>P7255</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan RIP1 mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ve western blot ekipmanı</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7058 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>U937 İnsan Monositleri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Hücre Proliferasyon Test Sistemi</td><td>Takara</td><td>MK400 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Roche Arıza Tespit</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>A1902 Serisi</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas1 sistemini kullanarak bir rip937 nakavt u9 hücre hattının oluşturulması

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

RIP1 CRISPR mutant U937 hücrelerinin birleşik bir popülasyonunun üretimini takiben, SDS-PAGE ve Western blot analizi yapıldı. Western blot analizi, RIP1 protein ekspresyon seviyelerinin kaybını değerlendirerek bir RIP1 CRISPR mutant hücre hattının başarılı bir şekilde oluşturulmasını belirlemek için kullanıldı. Bu belirleme, WT U937 monositleri ve NTC hücrelerinin karşılaştırmalı sonucuna dayanarak yapılmıştır. Şekil 2'de, 5 μg/mL puromisin RIP1 CRISPR mutant hücre...

CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

Araştırmamız, özellikle hiperglisemi bağlamında apoptoz ve nekroptoz arasındaki dengeyi inceleyen memeli programı hücre ölümüne odaklanmaktadır. Son zamanlarda, hücre ölümü proteini RIP1 kinazın nekroptoz sırasında gen ekspresyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Mevcut deneysel zorluğumuz, süspansiyon halinde büyüyen bağışıklık hücrelerini genetik olarak manipüle etmek, özellikle CRISPR-Cas1 kullanarak RIP9 kinaz genini devre dışı bırakmaktır.Protokolümüz iki farklı avantaj sunmaktadır. Lentivirüs kullanarak süspansiyon halinde büyüyen bağışıklık hücreleri için transfeksiyon yöntemlerini geliştirir ve CRISPR-Cas9 kullanarak genetik nakavt oluşturma sürecinde tek hücre klonlama ihtiyacını ortadan kaldırır. Sonuçlarımız, RIP1 kinazın nekroptozdaki hiperglisemik değişimdeki rolünü incelemenin yolunu açtı. Çeyrek çizgisine başlamak için Escherichia koli lentiviral vektör kılavuz RNA'sını barındıran Luria-Bertani veya LB agar plakaları mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile desteklenmiştir.Plakaları, plakadaki en seyreltik alanda tek tek koloniler görünene kadar bir ila iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, steril bir döngü kullanarak, tek bir koloni seçin ve 50 mililitrelik konik bir tüpte mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile desteklenmiş beş mililitre LB suyuna ekleyin. Tüpün kapağını havalandırın ve bantlayın.Tüpü bir orbital çalkalayıcıda 37 santigrat derece ve 225 RPM'de sekiz saat inkübe edin. Bu arada, dört adet 50 mililitrelik tüpe mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile desteklenmiş 40 mililitre LB suyu ekleyin. İnkübasyondan sonra, yetiştirilen kültürün 40 mikrolitresini dört tüpün her birine aktarın.Tüplerin kapaklarını 37 santigrat derece ve 225 RPM'de 12 ila 16 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe etmeden önce havalandırın ve bantlayın. Ertesi gün, kültürleri 20 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda 3.220 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları bir atık behere boşaltın ve dört peleti de ampisilin ile desteklenmiş 10 mililitre LB suyunda birleştirin.Tek bir pelet elde etmek için birleştirilmiş peletleri sallanan bir kova rotorunda 20 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin ve mümkün olduğu kadar çok süpernatantı atık behere atın. HEK293T hücreleri, altı hücrenin gücüne 10 ila üç ila beş kat konsantrasyonda DMEM içeren bir T25 şişesine tohumlayın. Şişeyi gece boyunca 37 santigrat derecede %5karbondioksit ile inkübe edin.Bu arada, transfeksiyon karışımını, 1:1:1:1 oranında plazmit ve 3:1 oranında transfeksiyon reaktifinin plazmit DNA'sına indirgenmiş serum ortamı kullanarak hazırlayın. 75 mikrolitre transfeksiyon reaktifi, 2.500 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve 25 mikrogram toplam plazmit DNA'yı karıştırın. Karışımın oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edilmesine izin verin.Daha sonra, transfeksiyon karışımını, ortam içeren şişedeki birleşen HEK293T hücrelerine dikkatlice pipetleyin. Karışımın yeterli homojenizasyonunu sağlamak için şişeyi hafifçe döndürün ve 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. İki günlük inkübasyondan sonra, ortamı üreticiden HEK293T hücre şişesinden 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Kalan HEK293T hücrelerini peletlemek için tüpü beş dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatant içeren tüm virüsü dikkatlice çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Altı hücrenin gücüne 2 x 10'luk bir pelet elde etmek için gerekli U937 hücre süspansiyonu hacmini sayın ve hesaplayın.Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve hücre peletini tüpte bırakarak süpernatanı boşaltın. Hücre peletini süpernatan içeren virüs içinde yeniden süspanse edin ve tüpü 60 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından, peleti tüpte süpernatant içeren virüs ile yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.Tüpü 60 dakika boyunca uç döndürücünün üzerine yerleştirin. Daha sonra tüpü 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve peleti, süpernatanlar ve %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı içeren virüsün 1:1 oranında yeniden süspanse edin. Hücre karışımını yeni bir T25 doku kültürü şişesine aktarın ve 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin.İnkübasyondan sonra, U937 hücrelerini 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Pelet, %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve mililitre puromisin başına beş mikrogram ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre kültürünü bir T25 şişesine aktarın.Hücreleri iki ila üç hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreleri her bir ila iki günde bir büyüme belirtileri açısından kontrol edin. Western blot analizi, vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerindeki güçlü sinyale kıyasla saptanabilir bir sinyal olmadan RIP1 CRISPR mutant hücrelerinde RIP1 protein ekspresyonunun kaybını doğruladı. TCZ ile tedavi, vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerinde önemli nekroptotik hücre ölümüne neden oldu ve bu, nekrostatin-1 tedavisi ile tersine çevrildi.Buna karşılık, RIP1 CRISPR nakavt hücreleri, nekrostatin-1'lerin hiçbir etkisi olmayan vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha düşük hücre ölümü gösterdi, bu da RIP1 fonksiyonunun kaybını gösterir. Canlı hücre floresan mikroskobu, nekrostatin-1 tedavisi üzerine azalan TCZ tedavisini takiben vahşi tip ve hedef olmayan kontrol hücrelerinde mitokondriyal süperoksit üretiminde önemli bir artış gösterdi. RIP1 CRISPR nakavt hücreleri, nekrostatin-1 tedavisinin gözlemlenebilir bir etkisi olmaksızın minimal mitokondriyal süperoksit üretimi sergiledi.

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Bu protokolde, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sisteminden yararlanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürleri açıklıyoruz. Açıklanan adımlar, sgRNA'ların tasarımını, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanmasını ve AAV'nin BAT loblarına mikroenjeksiyonunu içerir.

Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Keşfedin CRISPR/Cas9 ile insan hücre hattında RIPK1 gen nakavtı oluşturma yöntemini. Bu teknik genetik araştırmalarda hassas gen düzenlemesi için etkili bir çerçeve sunar.

CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

Daha fazla video keşfet