Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Mekanik ve biyokimyasal sinyallerin, hücreler ve moleküller tarafından tespit ve kuvvetlere verilen tepki de dahil olmak üzere hayvan morfogenezini nasıl ilişkilendirdiğini anlamayı amaçlıyoruz. Daha fazla molekülün mekanosensitif olduğu, değişen gerilim seviyelerinde farklı şekilde işlev gördüğü keşfedilmiştir. Bununla birlikte, bu kuvvete duyarlı olayların fizyolojik bağlamı ve işlevi büyük ölçüde bilinmemektedir.

Kuvvete duyarlı olayların dinamik doğası nedeniyle, alanımız moleküler ve hücresel davranışları yakalamak için büyük ölçüde yüksek hızlı floresan görüntülemeye ve hızlandırılmış kayda dayanır. Floresan etiketli proteinlerin çoğu görüntülenecek kadar parlak değildir ve önemli bir ağartıcı olmadan uzamsal-zamansal çözünürlük gerektirir. Öte yandan, geleneksel immünofloresan yöntemleri, fiksasyondan sonra yalnızca moleküler ve hücresel fikstürün anlık görüntüsünü yakalayabilir.

Bu yöntem, Notch, Wnt ve BMP yolları gibi ana sinyal yollarının birçok düşük bolluktaki protein reseptörünün lokalizasyonunu dinamik olarak izlemenin yolunu açar. Sonunda, geleneksel doğrusal sinyal kaskadlarına ek olarak, sinyal olaylarının hücre altı ölçeklerde nerede meydana geldiğini ve nerede gerçekleştiğini belirleyebiliriz.