Name: Caenorhabditis elegansta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta düşük maliyetli boyalarla glikojen birikimi ve bağırsak bütünlüğünü görselleştirme yöntemlerini. Bu protokoller öğrencilere metabolizma ve yaşlanma süreçlerini inceleme imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NOT: Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) bakterileri ve Bristol N2 yabani tip suşları, CGC, Minnesota Üniversitesi, ABD'den veya bir C. elegans laboratuvarından bağış yoluyla elde edilebilir. Araştırmacıların güvenliği için Kişisel Koruyucu Donanımların kullanılması zorunludur. Hipoklorit ve sodyum hidroksit gibi reaktiflerin konsantrasyonları düşük olsa da, bu kimyasallarla ilişkili potansiyel riskleri en aza indirmek için makalede vurgulandığı gibi önerilen KKD'nin giyilmesi önemlidir.
1. Glikojen içeriği
<ol><li>Test plakalarının hazırlanması<ol><li>Solucan suşu başına altı, 60 mm x 15 mm NGM agar plakası20 ( Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi 10 mL nematod büyüme ortamı agar, NGM) hazırlayın ve oda sıcaklığında 1 gün kurumaya bırakın. Kontaminasyonu önlemek için plakaları kapalı tutun.</li>
		<li>Akış başlığındaki gerinim başına toplam dört, 60 mm x 15 mm NGM plakasını aşılamak için plaka başına 200 μL E. coli OP50 sıvı kültürü (optik yoğunluk = 0.600, yaklaşık 600 nm dalga boyunda) ekleyin. Kullanmadan önce kapalı plakaların 1 gün boyunca 37 °C'de inkübe etmesine izin verin. NOT: Altı tabak hazırlayın (adım 1.1), ancak sadece 4'ünü E. coli OP50 bakterisi ile aşılayın. Kalan iki plakayı, solucanları açlık koşullarına yerleştirirken daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. Bu analiz iki nüsha olarak gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>Test gününde, daha önce E. coli OP50 bakterileri ile tohumlanmış olan suş başına iki (6 mm x 15 mm) NGM agar plakasına 200 μL 0.025 M D-Glikoz ekleyin. Plakaların akış davlumbazında oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. NOT: E. coli OP50 bakterisi ile tohumlanmış NGM agar plakaları, bir akış başlığı kullanmaya alternatif olarak alkol lambalarının yakınında da kurutulabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Senkronizasyon<ol><li>Senkronizasyondan yaklaşık 3 gün önce, 3-4 parçayı (3 cm x 3 cm) C . elegans Bristol N2 (yabani tip) ile farklı aşamalarda (yığın başına yaklaşık 500 solucan) bir bakım NGM agarından daha önce E. coli OP50 bakterileri ile tohumlanmış yeni bir plakaya (150 mm x 90 mm) aktarın.</li>
		<li>Yeni solucan plakasını 20 °C'de kontrollü bir ortama yerleştirin ve 3 gün boyunca nemi %&gt;95) koruyun (72 saat, solucanların çoğunun gravid yetişkin aşamasına ulaşmasına izin verir). NOT: Büyüme sıcaklığının, kullanılan C. elegans suş(lar)ına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.</li>
		<li>Bir Pasteur pipeti kullanarak, solucanları damıtılmış H2O ile hazırlanan plakadan toplayın ve bunları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>Solucanların yerçekimi ile çökelmesini bekleyin (yaklaşık 15 dakika) ve ardından süpernatanı çıkarın. Bakterileri yok etmek için bu işlemi 3 kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra hacmi 5 mL'ye düşürün.</li>
		<li>10 mL ağartma solüsyonu ekleyin (Ek Tablo 1) ve ellerinizi yaklaşık 6 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.</li>
		<li>Çalkalama tamamlandıktan hemen sonra, tüpleri M9 tamponu ile 50 mL kapasiteye kadar doldurun.</li>
		<li>3 dakika boyunca 1400 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı 5 mL'ye kadar çıkarın ve ardından tekrar 45 mL M9 tamponu ekleyin. Bu işlemi 4 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Son yıkamadan sonra, hacmi 15 mL'ye düşürün ve yaklaşık 14 saat boyunca kontrollü bir sıcaklıkta (20 °C) ve nemde (%&gt;95) tutun. NOT: Senkronizasyon işlemi, yumurtlama yoluyla yumurta elde edilerek değiştirilebilir: Yaklaşık 20 yetişkin hamile solucanı, daha önce 200 μL E. coli OP50 ile tohumlanmış bir NGM plakasına (6 mm x 15 mm) aktarın. Solucanların 1 gün boyunca yumurta bırakmasına izin verin. Bundan sonra, hamile solucanları çıkarın ve yumurtaların çatlamasını bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Solucanların hazırlanması<ol><li>Otomatik bir pipet kullanarak, 10 μL senkronize solucanları (adım 1.2.8) bir mikroskop lamına ekleyin ve solucan sayısını sayın. 500-1000 solucan/μL elde etmek için ne kadar hacim pipetlenmesi gerektiğini hesaplayın.</li>
		<li>500-1000 L1 senkronize solucanları (adım 1.2.8), besin kaynağı olarak E. coli OP50 bakterisi ile tohumlanmış NGM agar plakalarına (150 mm x 90 mm, Ek Tablo 1), 20 ° C'de larva aşaması 4'e (L4) ulaşana kadar aktarın. NOT: Solucanlar otomatik bir pipet kullanılarak aktarılabilir. Otomatik bir pipet mevcut değilse, bir cam Pasteur pipeti kullanın ve hacimler mikrotüp etiketler veya cam dereceli pipetler kullanılarak kontrol edilebilir.</li>
		<li>48 saatlik senkronizasyondan20 sonra: L4 larvalarını M9 tamponlu plakalardan (Ek Tablo 1), plastik bir Pasteur pipeti yardımıyla 50 mL'lik temiz bir konik tüpe toplayın ve 3 kez taze M9 tamponu ile yıkayın veya kalan tüm E. coli OP50 bakterileri tamamen temizlenene kadar (oda sıcaklığında) yıkamaları tekrarlayın. NOT: Yıkama aşaması önemlidir çünkü bazı solucanlar işlem sırasında açlık yaşayacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Tahlili çalıştırma<ol><li>Önceden hazırlanmış yeni NGM agar plakalarının (60mm x 15mm) her birinden (adım 1.1.2 ve 1.1.3) 500-1000 L4 solucanını (adım 1.3.1) aktarın. Test gününe kadar 20 saat boyunca 48 °C'de tutun. Bu program, aşağıdaki gibi iki kopya halinde üç deney grubuyla sonuçlanacaktır (Şekil 1): A- (açlık): solucanlar, E. coli OP50 bakterisi içermeyen normal NGM agar plakalarında büyüyecektir; B- (normal): solucanlar, E. coli OP50 bakterileri ile tohumlanmış normal NGM agar plakalarında büyüyecektir; C- (yüksek glikoz): solucanlar, E. coli OP50 bakterisi ile tohumlanmış ve 0.025 M D-glikoz içeren NGM agar plakaları üzerinde büyüyecektir.</li>
		<li>Test gününde (48 saat sonra): solucanları toplayın ve M9 tamponunda üç kısa yıkama yapın (adım 1.2.2 ve 1.2.3) NOT: Burada, D-glikoz ilavesiyle (adım 1.3) NGM agar plakalarını hazırlayın ve solucanları ekleme zamanı gelene kadar bir kenara koyun.<ol><li>İyot boyama: taze M9 tamponu kullanarak% 5 (h / h) Lugol İyot çözeltisi (iyot / potasyum iyodür çözeltisi) hazırlayın. NOT: Lugol'un İyot çözeltisi yerel reaktif tedarikçilerinden veya eczanelerden temin edilebilir, bu nedenle başlangıç konsantrasyonu değişebilir. Gerekirse, %5'lik (h/h) bir çözelti elde etmek için hesaplayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Her gruptan yaklaşık 100 μL yıkanmış solucanı (adım 4.2) seyreltilmiş Lugol çözeltisi (% 5 v / v) içeren 1.5 mL mikrotüpe aktarın. 1:5 oranında otomatik bir pipet kullanarak 100 μL solucanı 400 μL Lugol çözeltisine aktarın, ardından bir karıştırıcıda 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. NOT: Bir karıştırıcı mevcut değilse, mikrotüpleri ellerle dikkatlice sallamak mümkündür.</li>
		<li>Bu 5 dakikadan hemen sonra, 1.5 mL mikrotüpü (solucanlar + Lugol çözeltisi) 1400 x g'da 3 dakika boyunca santrifüjleyin. NOT: Bu test, L4 aşamasından veya ötesinden solucanlar üzerinde gerçekleştirilirse, bir santrifüj kullanmak yerine yerçekimi sedimantasyonu elde etmek mümkündür. Mikrotüpleri, tüm solucanlar mikrotüpün dibine yerleşene kadar 10 dakika boyunca tezgah üzerindeki raflarda açık bırakın.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın ve solucanları 1.0 mL taze M9 tamponu ile yıkayın. Kalan tüm iyot çözeltiden çıkana kadar yıkamayı tekrarlayın (en az 3x).</li>
		<li>Son yıkama adımından sonra, yaklaşık 100 μL'lik bir kalıntı dışında süpernatanı çıkarın. Solucanları nazikçe yeniden süspanse etmek ve mikroskobik analiz için bunu kullanın.</li>
		<li>Yeniden süspanse edilmiş solucan çözeltisinin yaklaşık 50 μL'sini mikroskopi slaytlarına aktarın ve üzerlerini kapak fişleri ile örtün. Stereomikroskop (1,5x'te) kullanarak parlak alan görüntülerini gözlemleyin. NOT: Stereomikroskop mevcut değilse, normal bir mikroskop kullanılabilir ve görüntüler bir adaptör kullanılarak bir cep telefonu kamerasıyla (3.4x'te) yakalanabilir. Işık/parlaklık/pozlamadan kaynaklanan hataları önlemek için, tüm cep telefonu kamera ayarlarının tüm resimler için tutarlı kalması çok önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri incelemesi<ol><li>Kantitatif veriler: Solucanların iyot lekelenmesine dayalı olarak glikojen içeriğini hesaplayın.<ol><li>Grup başına en az 10 solucan içeren stereomikroskoptan görüntüleri, daha sonraki işlemler için bir .jpeg dosyası olarak kaydedin. Bunu yapmak için ücretsiz ImageJ yazılımını indirin. Ayrıntılar Ek Dosya 1, Ek Şekil 1, Ek Şekil 2'de verilmiştir.</li>
			<li>ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/download.html adresinden ücretsiz olarak indirilebilir) kullanarak .jpeg görüntüsünü açın. Segmentli satır'a tıklayın ve solucanı ana hatlarıyla belirtin (her seferinde bir solucan). Analiz Et'e tıklayın ve ardından leke miktarını elde etmek için Ölç'ü seçin. Veriler, tabloda Ortalama olarak görüntülenecektir. Ortalama, solucan alanı başına boyama yoğunluğundan hesaplanan verileri gösterir.</li>
		</ol></li>
		<li>Nitel veriler: Her grubun stereomikroskobundan görüntüler elde edin ve solucanların lekelenmesini görsel olarak karşılaştırın. Gerekirse, lekelenmeyi analiz etmek için bir puanlama sistemi oluşturun: 0 renksiz; 1 hafif lekeli; 2 lekeli ve 3 çok lekeli. Stereomikroskobu kullanarak, bir el sayacı ile grup başına (minimum) yaklaşık 10 solucanı manuel olarak sayın.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> Şekil 1: C. elegans'ta genel glikojen içeriği analizi şeması. Glikojen içerik testini gerçekleştirmek için burada gerçekleştirilen deneyin bir şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi
<ol><li>Solucanların hazırlanması<ol><li>Senkronizasyondan yaklaşık 14 saat sonra (adım 1.2.8), ilk larva aşamasında (L1) 500-1000 solucanı (adım 1.3.1 ve NOT) daha önce hazırlanmış olan her yeni NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) aktarın ve test gününe kadar 20 °C'de tutun. Bu program aşağıdaki gibi iki deney grubuna yol açacaktır (Şekil 2): A- (genç): solucanlar, larva evresi 4'e (L4) kadar E. coli OP50 bakterisi ile tohumlanmış NGM agar plakalarında büyüyecektir; B- (eski): Solucanlar, yetişkinliğin 7. gününe kadar E. coli OP50 bakterisi ile tohumlanmış NGM agar plakalarında büyüyecektir. NOT: Erişkin yaşamın 7. gününe kadar bakımı yapılan solucanlar her gün M9 tamponu ile yıkanmalı ve daha önce gıda yerine alınması ve döllerin uzaklaştırılması için tohumlanmış 200 μL E. coli OP50 bakterisi ile yeni NGM agar plakalarına (60 mm x 15mm) aktarılmalıdır. Daha genç solucanlar dekantasyon sırasında yüzer ve süpernatan çıkarılarak ayrılabilir. Şirin kurtlarının oranı yaşla birlikte artar. Bununla birlikte, bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi, çalışmanın amacına bağlı olarak herhangi bir aşamada ve yaşta yapılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Tahlili çalıştırma<ol><li>Test gününde, L4 solucanlarını (adım 2.1.1'den 2 gün sonra) ve yetişkinlik solucanlarını 7. günde ( şimdi 9. günlerinde ) M9 tamponu (Ek Tablo 1) ile toplayın ve etiketli 1.5 mL mikrotüplere aktarın.</li>
		<li>1400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın, 1.0 mL M9 ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bakterileri uzaklaştırmak için bu işlemi 3 kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra hacmi 500 μL'ye düşürün.</li>
		<li>Otomatik bir pipet kullanarak, bir mikroskop lamına 10 μL solucan tortusu ekleyin ve solucan sayısını sayın. 100 solucan/μL elde etmek için pipetlenecek hacmi hesaplayın.</li>
		<li>Şirin boyama: damıtılmış su kullanarak% 25 Erioglaucine disodyum tuzu (Ek Tablo 1) çözeltisi hazırlayın. Gerekirse, daha iyi çözünürlük için girdabı kullanın.</li>
		<li>Daha önce tanımlanmış yeni mikrotüplerde, otomatik bir pipet kullanarak, 100 solucan, 100 μL% 25 Erioglaucine disodyum tuzu çözeltisi, 200 μL E. coli OP50 içeren hacmi ekleyin ve 500 μL'lik bir nihai hacim için M9 tamponu ile tamamlayın. NOT: Erioglaucine disodyum, E. coli hacimleri ve solucan sayısı sabittir. M9 tamponunun hacmi değişkendir ve nihai hacmi 500 μL'ye getirmek için kullanılabilir.</li>
		<li>Oda sıcaklığında, ışıktan korunan bir karıştırıcıda çalkalama ile 3 saat inkübe edin. NOT: Bir mikser yoksa, mikrotüpleri her 15 dakikada bir ellerinizle dikkatlice sallayın.</li>
		<li>3 saat sonra, 1.5 mL mikrotüpü 1400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. 1.0 mL süpernatanı çıkarın ve solucanları 1.0 mL M9 tamponu ile yıkayın.</li>
		<li>Kalan Erioglaucine disodyum tuzu çözeltisi çözeltiden çıkarılana kadar yıkamaları tekrarlayın. Son yıkama adımından sonra, yaklaşık 250 μL'lik bir kalıntı dışında süpernatanı çıkarın. Bunu, solucanları dikkatlice yeniden askıya almak ve mikroskobik analiz için işlemek için kullanın.</li>
		<li>Yaklaşık 50 solucan yeniden süspanse edilmiş solucan çözeltisini mikroskopi slaytlarına aktarın ve üzerlerini kapak fişleri ile örtün. Solucanları felç etmek için mikroskopi slaytlarını buzdolabında -20 °C'de 10 dakika inkübe edin. NOT: Solucanları felç etmenin bir başka alternatifi, 10 μL Levamizol hidroklorür çözeltisi (10 mM; Ek Tablo 1) ve üzerlerini kapak fişleri ile örtün.</li>
		<li>Bir stereomikroskopta (1.5x'te) parlak alanı kullanarak toplam solucan sayısını ve tamamen boyanmış solucanları gözlemleyin ve sayın. Görüntüler, bir adaptörle birleştirilmiş bir cep telefonu kamerasından (3.4x'te) elde edilebilir. Işık/parlaklık/pozlamadan kaynaklanan hataları önlemek için, tüm cep telefonu kamera ayarlarının tüm resimler için tutarlı kalması çok önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri incelemesi<ol><li>Nitel veriler: Her grubun stereomikroskoptan (L4 ve yetişkinliğin 7. günü) görüntüler elde edin ve solucanların lekelenmesini görsel olarak karşılaştırın.</li>
		<li>Stereomikroskop kullanarak toplam solucan sayısını ve şirin solucan sayısını (mavi solucanlar) sayın.</li>
		<li>Genç solucanları (L4, kontrol grubu olarak) ve yaşlı solucanları (yetişkinliğin 7. günü) karşılaştırarak şirin solucanlarının yüzdesi olarak sonuçları ifade edin: A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A Nerede, A = toplam solucan sayısı B= şirin solucan sayısı</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> Şekil 2: C. elegans'ta genel bağırsak geçirgenlik deneyi şeması. (A) C. elegans hazırlığı. (B) Erioglaucine disodyum tuzu ile boyama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Caenorhabditis elegans'ta Metabolizma ve Yaşlanma Modelinin Değerlendirilmesi

<ol><li>Thorp, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChatGPT+is+fun%2C+but+not+an+author%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChatGPT is fun, but not an author.</a> Science. 379 (6630), 313(2023).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C.</a> elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).</li>
<li>Andersen, J., Krichevsky, A., Leheste, J. R., Moloney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+undergraduate+educational+tool+for+teaching+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an undergraduate educational tool for teaching RNAi.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (6), 417-427 (2008).</li>
<li>Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+catch+a+smurf%3F+-+Ageing+and+beyond...+In+vivo+assessment+of+intestinal+permeability+in+multiple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">How to catch a smurf? - Ageing and beyond... In vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms.</a> Bio Protoc. 8 (3), e2722(2018).</li>
<li>Ellingwood, S. S., Cheng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+clinical+aspects+of+glycogen+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and clinical aspects of glycogen storage diseases.</a> J Endocrinol. 238 (3), R131-R141 (2018).</li>
<li>Cori, C. F., Cori, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+formation+in+the+liver+from+d-and+l-lactic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Glycogen formation in the liver from d-and l-lactic acid.</a> J Bio Chem. 81 (2), 389-403 (1929).</li>
<li>Wosilait, W. D., Sutherland, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+epinephrine+and+glucagon+to+liver+phosphorylase.+II.+Enzymatic+inactivation+of+liver+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The relationship of epinephrine and glucagon to liver phosphorylase. II. Enzymatic inactivation of liver phosphorylase.</a> J Biol Chem. 218 (1), 469-481 (1956).</li>
<li>Zhang, H., Ma, J., Tang, K., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+energy+storage%3A+roles+of+glycogen+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Beyond energy storage: roles of glycogen metabolism in health and disease.</a> FEBS J. 288 (12), 3772-3783 (2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glycogen+molecular+structure+in+the+worm+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Characterization of glycogen molecular structure in the worm Caenorhabditis elegans.</a> Carbohydr Polym. 237, 116181(2020).</li>
<li>Cherkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+mapping+and+assessment+of+glycogen+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular mapping and assessment of glycogen in C.</a> elegans.Analyst. 144 (7), 2367-2374 (2019).</li>
<li>Gusarov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+controls+Caenorhabditis+elegans+lifespan+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress.</a> Nat Commun. 8, 15868(2017).</li>
<li>Seo, Y., Kingsley, S., Walker, G., Mondoux, M. A., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+shift+from+glycogen+to+trehalose+promotes+lifespan+and+healthspan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Metabolic shift from glycogen to trehalose promotes lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (12), E2791-E2800 (2018).</li>
<li>Frazier, H. N. 3rd, Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+sugar+provisioning+controls+survival+of+C.+elegans+embryos+in+adverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments.</a> Curr Biol. 19 (10), 859-863 (2009).</li>
<li>da Silva, F. N., Zimath, P. L., do Amaral, T. A., Martins, J. R. N., Rafacho, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadministration+of+olanzapine+causes+minor+impacts+on+the+diabetogenic+outcomes+induced+by+dexamethasone+treatment+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Coadministration of olanzapine causes minor impacts on the diabetogenic outcomes induced by dexamethasone treatment in rats.</a> Life Sci. 322, 121660(2023).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+at+the+crossroad+of+stress+resistance%2C+energy+maintenance%2C+and+pathophysiology+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Glycogen at the crossroad of stress resistance, energy maintenance, and pathophysiology of aging.</a> Bioessays. 40 (9), e1800033(2018).</li>
<li>Untersmayr, E., Brandt, A., Koidl, L., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+dysfunction+as+driving+factor+of+inflammaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier dysfunction as driving factor of inflammaging.</a> Nutrients. 14 (5), 949(2022).</li>
<li>Lin, P. Y., Stern, A., Peng, H. H., Chen, J. H., Yang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+and+metabolic+regulation+of+intestinal+barrier+function+and+associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Redox and metabolic regulation of intestinal barrier function and associated disorders.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 14463(2022).</li>
<li>Dambroise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+phases+of+aging+separated+by+the+Smurf+transition+as+a+public+path+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death.</a> Sci Rep. 6, 23523(2016).</li>
<li>Laranjeiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swim+exercise+in+Caenorhabditis+elegans+extends+neuromuscular+and+gut+healthspan%2C+enhances+learning+ability%2C+and+protects+against+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Swim exercise in Caenorhabditis elegans extends neuromuscular and gut healthspan, enhances learning ability, and protects against neurodegeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (47), 23829-23839 (2019).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C.</a> elegans.WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).</li>
<li>McGee, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+intestinal+nuclei+and+intestinal+integrity+in+aging+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C.</a> elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrotüpler ve nbsp;</td><td>Yerel</td> <td>tedarikçiler-37</td><td></td></tr> <tr><td>derece inkübatör</td><td>KS 4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Yerel</td> <td>tedarikçiler-6</td><td></td></tr> <tr><td>cm Petri plakaları&nbsp;</td><td>Yerel</td> <td>tedarikçiler-Agar</td><td></td></tr> <tr><td>bakteriyolojik</td><td>Din & acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea Ltda.</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (vahşi tip)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetik Merkezi (CGC, Minnesota, ABD)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea Ltda.</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - Susuz glukoz;</td><td>Neon</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış H2O</td><td>Yerel</td><td></td> tedarikçiler-Erioglaucine <td></td></tr><tr><td>disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetik Merkezi (CGC, Minnesota, ABD)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Akış başlığı</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>Kuzey Amerika'nın Panasonic Sağlık Şirketi, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din ve acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea Ltda.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Levamizol hidroklorür</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrosantrifüj Santrifüj 5425R Eppendorf SE, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din & acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea Ltda.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea Ltda.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>Pepton bakteriyolojik</td> <td>ve çevre; Xodo Cient&iacute; fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica S8 Apo Stereomikroskop (S&atilde; o Paulo, Brezilya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin Sülfat</td><td>Estreptomax</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans'ta glikojen birikimini ve bağırsak bütünlüğünü görselleştirmek için düşük maliyetli boyaların kullanılması

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Glikojen içeriği analizi, glikojen sentezini veya bozunmasını etkileyebilecek farklı suşların karşılaştırmalı çalışmaları gibi çeşitli test koşullarının taranması için sağlam ve hızlı bir yöntem sağlar. Bu çalışmada, L4 solucanları üç farklı test koşuluna tabi tutuldu: açlık, beslenme ve glikozla zenginleştirilmiş gruplar. Test üç kez gerçekleştirildi ve her koşul her testte iki kez tekrarlandı; Şekil 3'te temsili bir resim gösterilmektedir. Her tahlilden sonra, Lugol'un İyot çözeltisi ile boyanmış solucanlar stereomikroskop kullanılarak gözlemlendi ve solucanların boyanması ile ilgili olarak gruplar arasında kalitatif bir karşılaştırma yapıldı. Görsel gözlem açısından, açlık grubundaki (açlık), E. coli OP50 (normal) ile beslenen solucanlara ve ayrıca E. coli OP50 ve D-glikoz (yüksek glikoz) ile beslenenlere kıyasla daha az yoğun bir leke sergilemiştir. Ek olarak, E. coli OP50 ve D-glukoz (yüksek glikoz) ile beslenen solucanlar en yoğun lekelenmeyi sergiledi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> Şekil 3: Glikojen içerik analizinden temsili görüntüler. C. elegans'taki glikojen seviyeleri iyot boyaması ile değerlendirildi. Mikroskobik görüntüler, 48 saat boyunca (A) açlık, (B) düzenli veya (C) yüksek glikoz koşullarına maruz kalan temsili C. elegans solucanlarını göstermektedir. Solucanlar, adım 1.4'te ayrıntılı olarak açıklanan prosedürü takiben, 5 dakika boyunca Lugol'un iyot / M9 tamponu (% 1) çözeltisine daldırılarak boyandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bağırsak geçirgenliği sonuçları, sağlam barsaklı genç solucanların (L4) ve yaşlanmaya bağlı olarak bağırsak zarları hasar görmüş yaşlı solucanların (erişkin 7. gün) boyanmalarındaki farkı göstermektedir (Şekil 4). C. elegans'ın bağırsağı, sindirim ve metabolizmada kritik roller oynadığı ve stres tepkisi ve yaşlanmanın düzenlenmesi için bir sinyal merkezi olarak hizmet ettiği için sağlık için merkezi öneme sahip bir dokudur21. Genç solucanlarda, C. elegans'ın bağırsağı, bağırsak içeriğinin sızmasını önleyen güçlü bir bariyerden oluşur. Bununla birlikte, bu solucanlar yaşlandıkça, bağırsak bariyer fonksiyonu azalır ve hücrelerin ve mikrovillusların ilerleyici bozulması ve yaşlanan bağırsakta bakteri birikimi nedeniyle bozulmaya karşı daha hassas hale gelir21,22. Genç C. elegans Erioglaucine disodyum tuzu boyasını yuttuğunda, nematodun bağırsağı lekelenir (Şekil 4A). Öte yandan, yaşlı solucanların, solucanın tüm vücuduna nüfuz eden ve bağırsak zarının hasar gördüğünü gösteren bir boya ekstravazasyonu sunduğunu gözlemlemek mümkündür (Şekil 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> Şekil 4: Erioglaucine disodyum tuzu ile boyanan C. elegans'ın temsili görüntüsü. Mikroskobik görüntü, sağlam bağırsağı olan C. elegans'ı (evre L4) ve bağırsağı yırtılmış solucanları (yetişkinliğin 7. günü) göstermektedir. Solucanlar, adım 2.2.4'ü takiben 3 saat boyunca% 25'lik bir Erioglaucine disodyum tuzu çözeltisine daldırılarak boyandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: C. elegans konturunu seçmek için ImageJ ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Ortalamayı hesaplamak için ImageJ ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Ortam, tampon ve kültür tarifleri. Mevcut protokolde kullanılan farklı ortamların, arabelleklerin ve kültürlerin bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Solucanlardaki glikojen içeriğini ölçmek için ImageJ Yazılımının ayrıntılı açıklaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

using-low-cost-dyes-to-visualize-glycogen-accumulation-gut-integrity

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz canlı manikür görselleştirmek için bir yöntem...

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

Burada, sabit, bozulmamış nematodlarda genomik DNA'yı görselleştirmek için kullanılan bir tekniği açıklıyoruz. Video, döllenmemiş C. elegans oositlerindeki kromatini saymak için örnek bir protokol içerir.

Etanol Fiksasyonu ve DAPI Boyama: C. elegans'ta DNA'yı Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler...

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP ° C. elegans

Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım...

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Bu protokol, Caenorhabditis elegansbağırsak geçirgenliği ölçmek için nasıl açıklar. Bu yöntem bağırsak bakterileri ve ev sahibi arasındaki etkileşim ile ilgili bağırsak sağlığı temel biyolojik araştırma ve sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları nın tedavisi için probiyotik ve kimyasal ajanları belirlemek için tarama için yararlıdır.

Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta düşük maliyetli boyalarla glikojen birikimi ve bağırsak bütünlüğünü görselleştirme yöntemlerini. Bu protokoller öğrencilere metabolizma ve yaşlanma süreçlerini inceleme imkanı sunar.

Caenorhabditis elegansta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması (Video) | JoVE Journal

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Daha fazla video keşfet