Name: Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Öğrenin, tavşan gözünden yüksek kaliteli kriyoseksiyonlar elde etme yöntemini. Bu protokol, retinal pigment epiteli rejenerasyonu ve immünohistokimya çalışmalarında doku artefaktlarını en aza indirerek net görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik tavsiyeler için Rosanna Calderon, Dominic Shayler ve Rosa Sierra'ya teşekkürler. Bu çalışma kısmen, USC Keck Tıp Fakültesi Oftalmoloji Bölümü'ne Körlüğü Önleme Araştırmaları (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Oftalmoloji için Deneysel Terapötikler Vakfı (AN), Körlüğü Önleme Araştırması Kariyer Geliştirme Ödülü (AN), Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı Vakfı (AN), ve Edward N. ve Della L. Thome Anma Vakfı (AN, KG).

Tüm prosedürler, Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumlu olarak yürütülmüş ve onaylanmıştır. Bu protokolün geliştirilmesinde 4 ila 6 aylık yaşları arasında on dört (n = 14) Hollanda kuşaklı tavşan kullanılmıştır. Hem erkek hem de dişi hayvanlar kullanıldı. Tüm hayvanlar 2,0 ila 2,5 kg ağırlığındaydı. Bütün hayvanlar tek başına barındırıldı. Önerilen malzeme ve ekipmanların bir listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir.
1. Hazırlık
<ol><li>Fiksatif hazırlık.<ol><li>Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. En azından, göz başına 50 mL fiksatif gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kriyoprotektif ajan hazırlama.<ol><li>PBS'de hacimce ağırlıkça %30 (a/h) sükroz hazırlayın. Sükrozun tamamen çözüldüğünden emin olmak için en az 15 dakika çalkalayıcı üzerine koyun. En azından, göz başına 50 mL kriyoprotektif ajan gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseksiyon aletinin hazırlanması.<ol><li>İki çift forseps, bir çift kavisli makas, bir neşter bıçağı ve 100 mm'lik bir diseksiyon kabı toplayın ve bunları bir diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin. Örnek bir kurulum Şekil 1A'da gösterilmiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İlk fiksasyon
<ol><li>Trans-konjonktival enükleasyonun11 ardından, gözü hemen buz üzerinde PBS'de en az 50 mL %4 PFA'ya yerleştirin. Gözün tamamen suya daldırıldığından emin olun. Gözün dış yüzeyinde hava kabarcıkları birikirse, hafifçe çalkalayarak çıkarın.</li>
</ol>3. Kornea ve iris çıkarma
<ol><li>15 dakika sonra, gözü PBS'deki %4 PFA'dan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün kurumasını önlemek için tabağı PBS ile doldurun.</li>
	<li>Korneayı çıkarın.<ol><li>Alttaki yapıların kazara delinmesini önlemek için limbusun 1 mm önünde, iris düzlemine paralel bir cerrahi bıçakla bir kesi oluşturarak başlayın (Şekil 1B).</li>
		<li>İlk kesiğe kavisli makas sokun ve limbustan 1 mm uzakta kalarak çevresel olarak kesmeye devam edin. Keserken gözü stabilize etmek için forseps kullanın (Şekil 1C).</li>
		<li>Çevresel kesim tamamlandıktan sonra, korneayı forseps ile çıkarın ve fazla PBS'yi bir laboratuvar mendili ile nazikçe silin. Korneayı, kriyoproteksiyon veya atma için oda sıcaklığında (RT) %30 sükroz çözeltisine yerleştirin. Kriyoproteksiyon, kornea battığında tamamlanır ve bu genellikle 1 saatten az sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>İrisi çıkarın.<ol><li>İris boyunca kavisli bir makasla ilk kesimi yaparak başlayın. Korneanın çıkarılmasına benzer şekilde çevresel olarak keserek irisi dokunun geri kalanından tamamen ayırın (Şekil 1D).</li>
		<li>Çevresel kesim tamamlandıktan sonra, irisi forseps ile çıkarın ve fazla PBS'yi bir laboratuvar mendili ile nazikçe silin. İrisi, kriyoproteksiyon için RT'de% 30 sükroz çözeltisine yerleştirin veya yukarıdaki gibi atın. Kriyoproteksiyon, iris battığında tamamlanır ve bu genellikle 30 dakikadan az sürer.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Fiksasyonun tamamlanması
<ol><li>Kornea ve iris çıkarıldıktan sonra, gözü PBS'de en az 50 mL taze hazırlanmış% 4 PFA'ya yerleştirin ve hafif çalkalama için bir çalkalayıcıya koyun. Çalkalama sırasında gözün su altında kaldığından emin olun.</li>
	<li>Gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 4 PFA'da gözünüzü koruyun. NOT: %4 PFA'nın, 4 ° C'de 16 saat ile 24 saat arasında kullanıldığında mükemmel IHC boyaması ile sonuçlandığını, daha uzun fiksasyon sürelerinin spesifik olmayan arka plan boyaması ve epitop maskelemesinin artmasına neden olduğunu bulduk.</li>
</ol>5. Lensin çıkarılması
<ol><li>Ertesi sabah, gözü PBS'deki %4 PFA'dan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün kurumasını önlemek için tabağı PBS ile doldurun.</li>
	<li>Lensi çıkarın.<ol><li>Ön lens kapsülünü forseps ile dikkatlice kavrayarak başlayın. NOT: Retina dekolmanı oluşturabileceğinden, lensi forseps ile zorla itmemeye veya çekmemeye son derece dikkat edin.</li>
		<li>Makasları, bıçaklar lens boyunca arkaya doğru kıvrık olacak şekilde dikkatlice arka odaya yerleştirin. Kavisli makasla lens zonüllerinden ilk kesimi yapın. NOT: Retina dekolmanı oluşturabileceğinden, zonülleri makasla zorla itmemeye veya çekmemeye son derece dikkat edin (Şekil 1E).</li>
		<li>Lens zonüllerinden çevresel bir düzende küçük kesikler yapmaya devam edin. Saat başına üç ila beş kesim yapın.</li>
		<li>Lensin dokunun geri kalanından ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için, ön lens kapsülünü forseps ile nazikçe kavrayın ve nazikçe kaldırmaya çalışın. Lens hemen kalkmazsa, retina dekolmanı oluşturabileceğinden daha fazla çekmeye çalışmayın. Bunun yerine, kalan lens zonüllerinden daha fazla kesi yapın ve yeniden deneyin.</li>
		<li>Dokunun geri kalanından ayrıldıktan sonra, lensi kriyoproteksiyon için RT'de% 30 sükroz çözeltisine yerleştirin veya yukarıdaki gibi atın. Kriyoproteksiyon, lens battığında tamamlanır ve bu genellikle birkaç saat sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Kriyoproteksiyon için gözü 4 ° C'de PBS'de en az 50 mL %30 sükroz içine yerleştirin. Kriyoproteksiyon, göz battığında tamamlanır ve bu genellikle 24-48 saat sürer. Kriyoproteksiyonu hızlandırmak için, ilk sükroz solüsyonunu 8-12 saat sonra taze bir solüsyonla değiştirin ve/veya gözünüzü RT'de sakaroz solüsyonunda tutun.</li>
</ol>6. Gömme
<ol><li>Kriyoproteksiyon tamamlandıktan sonra, gözü %30 sükroz solüsyonundan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün iç kısmındaki fazla sakaroz solüsyonunu çıkarmak için gözü aşağı bakacak şekilde dikkatlice çevirin. NOT: Mendil vitreus gövdesine yapışabileceğinden ve retina dekolmanı ile sonuçlanabileceğinden, gözün iç kısmındaki fazla solüsyonu laboratuvar mendiliyle çıkarmaya çalışmayın.</li>
	<li>Göz aşağı bakacak şekilde, bir mendil kullanarak gözün dış kısmındaki fazla sükroz solüsyonunu nazikçe silin.</li>
	<li>Tek kullanımlık bir gömme kalıbını 0,5-1,0 cm derinliğe kadar optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun. NOT: Bu taban, gözün kalıbın altına temas etmemesini sağlar, bu da daha sonra kriyoseksiyona müdahale eder.</li>
	<li>Gözü yukarı bakacak şekilde tek kullanımlık gömme kalıbına yerleştirin. Göz içinde kabarcık oluşumunu önlemek için özel dikkat göstererek gözün iç kısmını yavaşça OCT ile doldurun. Kabarcıklar oluşursa, bunları dikkatlice çıkarın veya forseps kullanarak kalıbın kenarına itin.</li>
	<li>Tek kullanımlık gömme kalıbını OCT ile doldurmayı bitirin. Gözün tamamen OCT'ye batırıldığından ve kalıbın iç yüzeylerine temas etmediğinden veya havaya maruz kalmadığından emin olun. Gözü OCT'de içeren tek kullanımlık gömme kalıbını parafilme sarın; gece boyunca 4 °C'ye koyun. NOT: Deneyimlerimize göre, daha kısa kuluçka süreleri OCT'nin vitreusa tamamen sızmasına izin vermez. Sonuç olarak, retina ile OCT arasında genellikle bir sükroz tabakası kalır. Bu meydana geldiğinde, donmuş sükroz muhtemelen donmuş OCT'den daha az yapısal destek sağladığından, kriyoseksiyon sırasında retina genellikle dokunun geri kalanından ayrılır veya tamamen yırtılır, bu da yüksek kaliteli kesitlerin elde edilmesini zorlaştırır ve hatta imkansız hale getirir.</li>
	<li>Ertesi sabah, gözü OCT'de içeren gömme kalıbını diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Arka hyaloid zarın iç retinadan yukarı doğru kalkmış göründüğünü onaylayın. NOT: Bu yukarı kaldırma, retinanın görünümünü engelleyebilir ve yönün belirlenmesini zorlaştırabilir.</li>
	<li>Gözün yönünü daha iyi belirlemek için, posterior hyaloid membranı öne doğru dikkatlice kavrayın ve OCT sırasında alttaki retinayı ortaya çıkarmak için forseps ile soymaya çalışın. NOT: Bazen, optik sinir kafasına yapışan ve optik sinir başı retinanın üst kısmında yer aldığından yönlendirme amacıyla kullanılabilen hyaloid kanal görülebilir (Şekil 2A). Posterior hyaloid membranın tamamen çıkarılması gerekli değildir, çünkü OCT iç retinayı hizalamak için vitreus gövdesine zaten sızmıştır ve kalan herhangi bir membran kriyoseksiyonu etkilemeyecektir (Şekil 2B). Posterior hyaloid membran sadece gerekirse oryantasyon için çıkarılmalıdır. Oryantasyonu belirlemek için diğer seçenekler arasında, enükleasyondan önce bir sütür veya başka bir tür işaret yerleştirilmesi yer alır.</li>
	<li>Gözü 0,5-1,0 cm derinliğe kadar doldurulmuş yeni OCT ile yeni bir gömme kalıbına aktarın ve ardından son gömme ortamının kalıntı ve/veya gece boyunca birikmiş olabilecek diğer kusurlardan arınmış olduğundan emin olmak için 6.3-6.5 adımlarındaki gibi yeni OCT ile doldurun. Mümkünse, OCT'yi gözün içinden de bir mendille nazikçe çıkarın, ancak bu gerekli değildir.</li>
	<li>Kalıbı oryantasyon amacıyla etiketleyin (Şekil 2C). Kriyo kalıbında göz yukarı bakacak şekilde gözü yönlendirmek, OCT'nin iç retinayı kaplamasını sağlar. Optik sinir başına yapışan hyaloid kanal, gözün üst kısmının belirlenmesinde önemli bir dönüm noktasıdır (Şekil 2A).</li>
	<li>Gözü OCT olarak içeren etiketli gömme kalıbını kuru buzun üzerine yerleştirin. Gözün gömme kalıbının iç yüzeylerinden hiçbirine temas etmediğinden veya havaya maruz kalmadığından emin olun. Dondurma işlemini hızlandırmak için kalıbın doğrudan kuru buza temas ettiğinden emin olun (Şekil 2D).</li>
	<li>Gömülü gözü -80 °C'lik bir dondurucuya veya kesit almak için doğrudan kriyostata aktarın (Şekil 2E).</li>
</ol>7. Kriyoseksiyon
<ol><li>Bloğu, gözün üst kısmı üste ve gözün alt kısmı aşağıya bakacak şekilde, kalan kornea ve iris sağa ( Şekil 2E'deki gibi) veya sola (gösterilmemiştir) bakacak şekilde monte edin. Alternatif olarak, bloğu istediğiniz gibi farklı bir yönde monte edin. Gerekirse, kalıbın her iki tarafını birer birer dikkatlice kırarak ve gözün yönünü kaybetmemek için bloğu doğrudan işaretleyerek bloğu harekete geçirmek için kalıbı kırın.</li>
	<li>Bloğun kriyostat içindeki sıcaklığa 30-60 dakika dengelenmesine izin verin; -20 °C iyi bir başlangıç noktasıdır.</li>
	<li>Monte edildikten sonra, istenen açıda, tipik olarak gözün dikey eksenine paralel olarak yeni bir bıçak yerleştirin.</li>
	<li>Kesit kalınlığını istediğiniz gibi ayarlayın: 10-20 μm kalınlığındaki kesitler iyi bir başlangıç noktasıdır. 14 μm kalınlığındaki bir kesit örneği Şekil 3A-C'de gösterilmiştir.<ol><li>Yavaş ve kontrollü bir şekilde, bloğu bölümlere ayırmaya başlayın. Bıçağın bloğu gözün dikey eksenine paralel olarak kestiğinden emin olun. Değilse, bıçağın bloğa temas açısını veya sahne yönünü buna göre ayarlayın.</li>
		<li>Bloğu bölümlere ayırırken, bölümün bir fırça ile kırışmasını veya kıvrılmasını önleyin. Bölümü hızlı bir şekilde ters çevirin ve bölümü düzleştirmek ve kırışmayı veya kıvrılmayı en aza indirmek için uzun tüylü bir fırça ile aşağı doğru hafif bir baskı uygulayın. Bölümün manipülasyonuna yardımcı olmak için sivri uçlu ayrı bir fırça oluşturun.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytı aşağıya doğru bölüme doğru yavaşça hareket ettirerek bölümü yüklü bir cam slayta takın. Cam sürgüyü bölümün üzerinde hafifçe yuvarlayarak bölümün kendi üzerine katlanmasını veya takma sırasında başka bir şekilde kendini bozmasını önleyin. NOT: Slaytı doğrudan bölümün üzerine getirmeyin veya bölüme doğru bastırmayın, çünkü bu bölüme zarar verebilir veya deforme olabilir.</li>
	<li>-80 °C'lik bir dondurucuya aktarmadan veya doğrudan standart bir immünofloresan protokolüne geçmeden önce slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin.</li>
</ol>

İmmünohistokimya Çalışmaları için Tavşan Gözü Diseksiyonu ve Kriyoseksiyonu

<ol><li>Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeiffer%2C+RL+%22American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%2C+The+Biology+of+the+Laboratory+Rabbit%22">American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit</a>. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).</li>
<li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li>
<li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+models+of+ocular+diseases%3A+New+relevance+for+classical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology%2C+immunofluorescence%2C+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879(2021).</li>
<li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li>
<li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+whole+eyes%3A+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+in+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li>
<li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119(2022).</li>
<li>Baiza-Durán, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+%28PRO-169%29+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Retina+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32(2020).</li>
<li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li>
<li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li>
</ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yukarıdaki protokolü uygulamadan önce, IHC için tavşan gözlerinin doku işlemesinde sürekli olarak zorluklarla karşılaştık. Fareler gibi daha küçük hayvanların gözlerinden birkaç protokol uyarladık, ancak bunların yetersiz fiksasyona ve doku kesitinde zorluğa yol açtığını gördük. Tavşan retinasının tutarlı, yüksek kaliteli bölümlerine izin veren birkaç önemli husus vardır.
Dikkate alınması gereken bir husus, kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan diğer hayvan modellerine kıyasla tavşan küres...

Retina, göz içinde ışığı nöral sinyallere dönüştürmek için birlikte çalışan birkaç özel hücre katmanından oluşur. Retina görmede kritik bir rol oynadığından, yapısını ve işlevini anlamak, diğerlerinin yanı sıra makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati gibi görme kaybının en yaygın nedenlerinden bazıları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Tavşanlar, diğer modellere kıyasla çeşitli avantajlar sundukları için retina araştırmalarında uygun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Tavşan gözleri anatomik olarak insan gözlerine nispeten benzer 1,2. Örneğin, tavşanlar, insanlardaki foveaya benzer şekilde, yatay görsel çizgi olarak bilinen artmış bir fotoreseptör yoğunluğu alanına sahiptir. Kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan diğer hayvan modellerinin anatomik bir eşdeğeri yoktur. Ek olarak, kemirgenlerle karşılaştırıldığında, tavşanlardaki retina damar sistemi insanlardakine oldukça benzer. Tavşan gözleri de nispeten büyüktür. Bu, onları vitreus veya retina içinde ilaç uygulamasını veya cerrahi müdahaleyi içeren çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, aksi takdirde daha küçük bir gözde zor veya imkansız olabilir3.
İmmünohistokimya (IHC), bir doku içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir 4,5,6. Retina hassas bir yapı olduğundan, IHC ile faydalı sonuçlar elde etmek dikkatli bir doku işlemi gerektirir. Retina dekolmanı ve retina kırılmaları veya kıvrımları gibi diğer doku artefaktları genellikle işleme sırasında ortaya çıkar ve sonuçların yorumlanmasını engelleyebilir. Başarılı işleme, doku manipülasyonu, fiksasyonun türü ve süresi, gömme ortamının türü ve kesit alma teknikleri 7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Retina araştırmalarında tavşanların bir hayvan modeli olarak kullanılmasının avantajlarına rağmen, tavşan retinasının başarılı doku işlemesini tanımlayan çok az protokol mevcuttur. Bu makale, IHC'de kullanılmak üzere bütün tavşan gözlerinden yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>100 mm kültür kabı</td><td>Corning</td><td>353025</td><td>Diseksiyon için kullanılır (adım 1.3, 3 ve 5)</td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-106</td><td>Fiksasyon ve kriyoproteksiyon için (adım 1)</td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td>Kriyoseksiyon için (adım 7)</td></tr><tr><td>Kavisli makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91500-09</td><td>Diseksiyon için kullanılır (adım 1.3, 3 ve 5)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Bloke edici tamponda 1:1.000 seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Diseksiyon için kullanılır (adım 1.3, 3 ve 5)</td></tr><tr><td>Eşek anti-Keçi 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>Bloke edici tamponda 1:1.000 seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Eşek anti-Fare 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td>Bloke edici tamponda</td></tr> <tr><td>1:1.000 oranında seyreltilmişForseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td>Diseksiyon için kullanılır (adım 1.3, 3 ve 5)</td></tr> <tr><td>Cam Sürgülü Kapak</td><td>VWR</td><td>48404-453</td><td>Kriyoseksiyon için (adım 7)</td></tr> <tr><td>Keçi anti-SOX2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2018</td><td>Engelleme tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Yüksek profilli tek kullanımlık kriyostat bıçakları</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>14035838926</td><td>Kriyoseksiyon için (adım 7)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Fazla PBS veya OCT'yi silmek için kullanılır (adım 3 ve 6)</td></tr><tr><td>Fare anti-RPE65</td><td>Novus Bio</td><td>NB100-355SS</td><td>Bloke edici tamponda 1:100</td></tr><tr><td>Seyreltilmiş OmniPur Sükroz</td><td>Kırlangıç 167117</td><td></td><td>Kriyoprotektan için kullanılır (aşama 1.2)</td></tr><tr><td>Paraformaldehit %20 çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Sciences</td><td>15713</td><td>Doku sabitleyici olarak kullanılır (adım 1.1'de% 4'e seyreltilir)</td></tr> <tr><td>Peel-A-Away Tek Kullanımlık Gömme Kalıbı (22x22x20 mm Derinlik)</td> <td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td>Gömme kalıbı olarak kullanılır (adım 6)</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin, 1x</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>Fiksatif (adım 1.1) ve kriyoprotektan (adım 1.2) hazırlanmasında kullanılır,</td></tr> <tr><td>Neşter bıçağı no. 15</td><td>Tüy</td><td>08-916-5D</td><td>Diseksiyon için kullanılır (adım 1.3, 3 ve 5)</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Kriyoseksiyon için (adım 7)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Bileşik</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Gömme ortamı olarak kullanılır (adım 6)</td></tr></tbody></table>

bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi 

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye

Bu protokol, tavşanlar gibi daha büyük hayvanlarda yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonların nasıl elde edileceğini açıklar. Enükleasyondan sonra, göz kısa bir süre fiksatife daldırılır. Daha sonra kornea ve iris çıkarılır ve göz 4 °C'de ek fiksasyon için gece boyunca bırakılır. Sabitlemeyi takiben lens çıkarılır. Göz daha sonra bir kriyokalıba yerleştirilir ve bir gömme ortamı ile doldurulur. Lensi çıkararak, gömme ortamı vitreusa daha iyi erişebilir ve daha iyi retina stabilitesine yol açar. Daha da önemlisi, vitreus boyunca tam sızmaya izin vermek için göz gece boyunca gömme ortamında inkübe edilmelidir. Gece boyunca inkübasyondan sonra göz kuru buz üzerinde dondurulur ve kesitlere ayrılır. İmmünohistokimyada kullanılmak üzere tüm retina kesitleri elde edilebilir. Retina dokusu içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için standart boyama protokolleri kullanılabilir. Bu protokole uyulması, immünohistokimya kullanan herhangi bir deneyde kullanılabilecek yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonlar ile sonuçlanır.

Doku işlemeden sonra, retina içindeki herhangi bir sayıda biyolojik süreci araştırmak için standart bir immünofloresan protokolü kullanılabilir. Şekil 3A-C, konfokal mikroskopi ile elde edilen bir retina bölümünün temsili floresan görüntülerini göstermektedir. Retina bölümü daha önce tarif edilen bir protokol12'ye göre immün boyandı.
Şekil 3A-C'de</stro...

Bu protokol, bütün tavşan gözlerinin yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarını elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklar. Daha büyük gözlerde immünohistokimya kullanan herhangi bir çalışmada kullanım için kolayca uyarlanabilen tavşan gözü diseksiyonu, fiksasyonu, gömme ve kesit alma prosedürlerini detaylandırır.

Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi 

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

Araştırmamız, retina pigment epitelinin yenilenmesine yönelik yeni yaklaşımlara odaklanmaktadır. Retina pigment epitelinin disfonksiyonunun, makula dejenerasyonu gibi birçok göz hastalığının patofizyolojisinde merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir, bu nedenle bu hücre tabakasının yenilenmesi terapötik açıdan çekicidir. İmmünohistokimya yoluyla retinanın yapısal anatomisinin görüntülenmesi, retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir.Laboratuvarımızda, retina ekleri ve retina kıvrımları gibi doku artefaktları nedeniyle tavşan gözlerinden faydalı sonuçlar elde etmenin zor olduğunu gördük. Bu zorluklara rağmen, tavşan retinasının başarılı doku işlemesini tanımlayan çok az protokol mevcuttur. Bu protokol, tavşan retinasının mükemmel doku kesitleri ile sonuçlanan standart doku işleme tekniklerinde birkaç önemli değişiklik yapar.Bu çalışma, araştırmacıların tavşan modellerinde immünohistokimyanın kullanımını içeren araştırmalarından daha iyi sonuçlar elde etmelerini sağlayabilir.

obtaining-high-quality-cryosections-of-whole-rabbit-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, tavşan retina ve parçacık GFP veya retina ganglion hücrelerinin içine Subselüler belirteçleri çeşitli kodlama plazmid aracılı gen transferi diseksiyonu ve inkübasyon göstermektedir.

Yetişkin Tavşan Retina Organotipik Kültürü

Tavşanlar, göz içi ilaçların farmakokinetiğini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Tavşan gözleri kullanarak göz içi ilaçların farmakokinetik çalışmalarını yürütmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Göziçi İlaçların Farmakokinetik Çalışmaları Tavşan Gözlerinde Kullanımı

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır.  Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

Bu el yazması, kemirgen gözbebeklerinden slaytların histolojik olarak hazırlanması için bir protokol sunmaktadır. Önerilen yöntemle, iç retina ışık mikroskobu altında kolayca görüntülenebilir ve değerlendirilebilir. Prosedür, farelerin ve sıçanların gözbebekleri için sunulmuştur.

Retinayı değerlendirmek için sıçan ve fare gözbebeklerinin histolojik slaytlarının hazırlanması ve analizi

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Xenopus, yumurta, parçalanmış, bozulmamış ve / veya fraksiyone çeşitli deneyler için yararlıdır laevis. Bu protokol, yumurtlama neden yumurtaları toplamak ve dejelly ve herhangi bir hasarlı yumurta kaldırmak için yumurta sıralamak nasıl gösterir.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

Öğrenin, tavşan gözünden yüksek kaliteli kriyoseksiyonlar elde etme yöntemini. Bu protokol, retinal pigment epiteli rejenerasyonu ve immünohistokimya çalışmalarında doku artefaktlarını en aza indirerek net görüntüleme sağlar.

Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi

Daha fazla video keşfet