Name: Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden enterik sinir sistemi soylarını farklılaştırma yöntemini. Bu protokol, hastalık modelleme ve rejeneratif tıp için ölçeklenebilir fonksiyonel nöron üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı ve Sandler Vakfı, March of Dimes hibe no. 1-FY18-394 ve 1DP2NS116769-01, NIH Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2NS116769) F.F.'ye ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK121169) F.F.'ye, HM, Larry L. Hillblom Vakfı doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. NIH T32-DK007418 bursu ve UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı bağımsız doktora sonrası bursu.

1. Medya hazırlığı
NOT: Protokol boyunca belirtilen konsantrasyonlar, medya bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarıdır. Tüm ortamları steril koşullar altında laminer akış başlığında hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. 2 hafta içinde kullanın.
<ol><li>hPSC bakım ortamı: Besleyici içermeyen hPSC bakım ortamı takviyesini (20 μL/mL) temel ortamıyla karıştırın.</li>
	<li>Orta A: Farklılaşma baz ortamına kemik morfogenetik protein 4 (BMP4; 1 ng / mL), SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (600 nM) ekleyin.</li>
	<li>Orta B: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (1,5 μM) ekleyin.</li>
	<li>Orta C: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1.5 μM) ve RA (1 μM) ekleyin.</li>
	<li>Nöral kret tam (NCC) Orta: FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), N2 takviyesi (10 μL/mL), B27 takviyesi (20 μL/mL), L-glutamin takviyesi (10 μL/mL) ve MEM NEAA'lar (10 μL/mL) nörobazal ortama ekleyin.</li>
	<li>ENC Ortamı: GDNF (10 ng/mL), askorbik asit (100 μM), N2 takviyesi (10 μL/mL), B27 takviyesi (20 μL/mL), L-glutamin takviyesi (10 μL/mL) ve MEM NEAA'lar (10 μL/mL) nörobazal ortama ekleyin.</li>
	<li>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 1x: 500 mM EDTA'yı (1000x) PBS'de 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. NOT: Aksi belirtilmedikçe bu protokol boyunca Ca2+ ve Mg2+ serbest PBS kullanın.</li>
</ol>2. Kültür plakalarının kaplanması
<ol><li>Bodrum membran matrisi kaplı plakalar: 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak kuvvetlice pipetleyerek 500 μL'lik donmuş bazal membran matrisi alikotunu 50 mL soğutulmuş DMEM:F12'de hızla çözün ve seyreltin. Kuyuları seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 100 μL) ile kaplayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce kaplama ortamını aspire edin. Bazal membran matrisinin jelatinleşmesini önlemek için, bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin ve donmuş alikotu çözmek için soğuk DMEM: F12 kullanın. NOT: Pıhtılaşmayı önlemek için bazal membran matris sıcaklığı, çözülme (buz üzerinde) ve alikotlama (buz üzerindeki tüpler) sırasında soğuk tutulmalıdır.</li>
	<li>PO / FN / laminin kaplı plakalar: 1000x stoğu seyrelterek PBS'de 15 μg / mL polinitin (PO) çözeltisi hazırlayın. Kuyucukları 2 cmyüzey alanı başına 100 μL PO / PBS çözeltisi ile kaplayın ve plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, PO / PBS'yi aspire edin ve kuyucukları 2 μg / mL fibronektin (FN) ve 2 μg / mL laminin içeren yeni yapılmış FN / laminin / PBS çözeltisi ile cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL'de kaplayın. Plakalar 37 °C'de en az 2 saat inkübasyondan sonra kullanılabilir. Kullanmadan önce FN / laminin / PBS'yi aspire edin.</li>
</ol>3. hPSC kültürünün bakımı
NOT: Tüm hücre inkübasyon adımları, nemlendirilmiş bir inkübatörde %5CO2 ve 37 °C'dedir.
<ol><li>hPSC kültüründen hPSC besiyerini aspire edin ve koloniler ~%80 birleşene kadar her gün taze besiyeri (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 200 μL) ekleyin.</li>
	<li>Geçiş için, hPSC ortamını aspire edin ve hücrelericm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL PBS ile yıkayın. NOT: Hücreleri yıkamak için Ca2+ ve Mg2+ içermeyen PBS kullanmak önemlidir.</li>
	<li>500 μM EDTA (cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL) ekleyin. Plakanın kapağını yerine takın. Ters çevrilmiş bir mikroskopla izleyin ve hücreleri koloni kenarlarının ayrılması açısından izleyin (2-4 dakika).</li>
	<li>Aynı hacimde hPSC ortamını her bir oyuğa aktarmak için 5 veya 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak hasat edin. NOT: Optimum EDTA inkübasyon süresi iPSC hattına bağlıdır. Aşırı koloni ayrışmasına ve hücre ölümüne yol açabileceğinden, kolonileri ayırmak için kuvvetli pipetlemeden kaçının. Bir farklılaşma plakasını başlatmak için geçerken, hücreleri EDTA ile 1-2 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>Hücreleri uygun bir hacimde hPSC ortamında yeniden süspanse edin ve yeni bir bazal membran matris kaplı plakanın kuyularına aktarın. NOT: Düzenli hPSC bakımı için 1:18 - 1:24 geçiş oranı kullanın (1:18, 6 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğundan ayrılan hücrelerin üçte birinin tamamen yeni bir plakaya aktarılması anlamına gelir). Bir farklılaştırma plakasını başlatmak için 5:6'lık bir geçiş oranı izleyin.</li>
	<li>% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>4. Nöral kret indüksiyonu
NOT: Bu adım, Şekil 1A'da şematik olarak gösterilmiştir. Hücreler yaklaşık% 80 birleşim olduğunda NC farklılaşmasına başlayın. Bu, hücreler 5:6 oranında geçtiğinde 1-2 gün içinde elde edilecektir (yukarıya bakın). Pluripotent ve tamamen farklılaşmamış hPSC hücreleri ile 0. günde NC farklılaşmasına başlayın. Yüksek bir verimlilik için, koloni sınırları minimum farklılaşan hücrelere sahip olmalıdır. Koloniler büyük olduğunda veya ters mikroskop kullanılarak izlendiğinde koloninin merkezi kalınlaşmaya/kararmaya başladığında farklılaşma için geçiş ve plaka hPSC. Birleşme ve morfolojiye dikkat etmek, hücre hattına bağlı olarak değişebileceğinden vecm2 başına 50.000-200.000 arasında değişebileceğinden, kaplanmış hücre sayısından daha güvenilir olma eğilimindedir.
<ol><li>0. günde, hPSC bakım ortamını 1 ng/mL BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) içeren Ortam A ile değiştirin.</li>
	<li>2. günde, hücreler% 100 birleşik olmalıdır. Harcanan Ortam A'yı nazikçe aspire edin ve 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 (cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) içeren Orta B ile hücreleri besleyin. NOT: NC indüksiyonu sırasında kültürler büyüdükçe, hücreler alttaki tek tabakadan ayrılabilir. Eski ortamı nazikçe çıkararak ve kuyu tarafına taze ortam ekleyerek fazla hücre kaybını önleyin.</li>
	<li>4. günde, hücreleri tekrar Ortam B (cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) ile besleyin.</li>
	<li>6. günde, orta B'yi 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 ve 1 μM retinoik asit (cm2 kuyu yüzey alanı başına 400 μL ortam) içeren Orta C ile değiştirin.</li>
	<li>8. ve 10. günlerde 6. gün olarak besleyin.</li>
</ol>5. ENC küresel oluşumu
NOT: Bu adım, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.
<ol><li>12. günde, Orta C'yi nazikçe aspire edin ve hücrelericm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL PBS ile yıkayın. Aynı hacimde hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve% 5 CO2 ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10 ng/mL FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/mL N2 takviyesi, 20 μL/mL B27 takviyesi, 10 μL/mL L-glutamin takviyesi ve 10 μL/mL MEM NEAA içeren aynı hacimde NCC ortamı ekleyerek hücre ayırma solüsyonunu seyreltin. Serolojik bir pipet kullanarak, tek hücreli süspansiyonu hasat edin ve 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, 12 mL (tam 6 oyuklu bir plaka için) NCC ortamı ekleyin ve 1-2 kez mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tamamen yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın. NOT: Yaklaşık 10cm2 ENC tek katmanlı hücreler, 2 mL NCC ortamında yeniden süspanse edilir ve ultra düşük bir bağlantı plakasının bir kuyucuğuna aktarılır. Bu, tam 6 oyuklu ultra düşük bağlantı plakasına aktarılan tam 6 oyuklu bir NC indüksiyon plakasına eşittir.</li>
	<li>14. günde, her bir oyuğun ortasında küçük küreler toplanana kadar plakaları hafifçe döndürün. Bir P1000 mikropipet kullanarak ve yavaş dairesel hareketlerle, harcanan NCC ortamını her bir oyuğun çevresi boyunca aspire edin. Serbest yüzen sferoidleri çıkarmaktan kaçının.</li>
	<li>Hücreleri orijinal NCC ortamı hacmiyle besleyin.</li>
</ol>6. EN indüksiyonu
NOT: Bu adım, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.
<ol><li>15. günde, ortamı nazikçe çıkarmak ve sferoidleri PBS ile yıkamak için 14. günde kullanılan tekniğin aynısını uygulayın. Sferoidlerden kaçınarak mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın.</li>
	<li>Hücre ayırma çözeltisi ekleyin (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 100 μL) ve sferoidleri% 5 CO2 ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe ederek tek hücrelere ayırın.</li>
	<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, eşit hacimde ENC ortamı ekleyin (10 ng/mL GDNF, 100 μM askorbik asit, 10 μL/mL N2 takviyesi, 20 μL/mL B27 takviyesi, 10 μL/mL L-glutamin takviyesi ve nörobazal ortamda 10 μL/mL MEM NEAA içerir) her bir oyuğa ve kalan sferoidleri 2-3 tur mekanik pipetleme ile kırın. Hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. NOT: Zorla pipetleme veya daha küçük uç açıklığına sahip pipetlerin kullanılmasından kaynaklanabilecek aşırı stres ve hücre ölümünden kaçının.</li>
	<li>Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, ~ 5-10 mL ENC ortamı ekleyin ve 1-2 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tamamen yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Tripan mavisi ve hemositometre gibi bir hücre sayma yöntemi kullanarak canlı hücrelerin konsantrasyonunu sayın. DİKKAT: Tripan mavisi şüpheli bir kanserojendir. Dikkatli tutun, uygun şekilde atın.</li>
	<li>mL başına yaklaşık ~ 1.000.000 hücre yoğunluğunda cm2 yüzey alanı başına yaklaşık 300.000-400.000 canlı hücre kaplamayı hedefleyen yeterli miktarda ENC ortamı ekleyin. Plakanın kuyularından FN / laminin / PBS çözeltisini aspire edin. NOT: EN kültürleri için planlanan tahlillere göre plaka formatını seçin, çünkü bu aşama protokolün son yeniden kaplama adımını işaret eder. Enterik nöron progenitörleri 15. günde dondurulabilir. Küreleri hücre ayırma çözeltisi ile ayırdıktan sonra, progenitörleri %10 DMSO veya Kök hücre bankacısı gibi dondurucu ortamda yaklaşık 5 x10 6 hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Gerektiğinde, 5 μM Y-27632 ROCK inhibitörü ile ılık ENC ortamında çözdürün. İstenilen plaka formatında plaka hücreleri. Ortamı birkaç saat sonra taze ENC ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri yavaşça PO / FN / laminin kaplı oyuklara ekleyin. Özellikle 384 oyuklu plakalar gibi daha küçük kuyu boyutuna sahip plakalar kullanıldığında, hücrelerin PO / FN / laminin kaplamaya bağlanmasını önleyen hücre süspansiyonunun altında kabarcıkların sıkışmasını önleyin. Bu hücre ölümüne yol açabilir.</li>
	<li>Hücreleri 30-40. güne kadar ENC ortamı(cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL) ile her gün besleyin, ardından besleme sıklığını azaltın (haftada bir veya iki kez), ancak besleme hacmini iki katına çıkarın (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 400 μL ortam). NOT: Bu, ortamın aşırı çıkarılması ve eklenmesi, nöronal kültürün kuyucukların yüzeyinden ayrılmasını kolaylaştırabileceğinden önemlidir. Özellikle uzun süreli kültürler için dekolmanı prospektif olarak önlemek için, ENC'yi haftada bir kez FN (2 μg / mL) ve laminin (2 μg / mL) ile destekleyin.</li>
</ol>

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Enterik Nöronların Türetilmesi

<ol><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%3A+a+second+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp+Pract%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system: a second brain.</a> Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).</li>
<li>Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+drug+discovery+for+neuropsychiatric+disorders+using+patient-specific+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models.</a> Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).</li>
<li>Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+tool+for+modeling+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest%3A+The+fourth+germ+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neural crest: The fourth germ layer.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).</li>
<li>Crane, J. F., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem and progenitor cells.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).</li>
<li>Thomas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+cells+display+molecular+and+phenotypic+hallmarks+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells.</a> Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enteric+neuron+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nat Med. 23, 49-59 (2017).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).</li>
<li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hPSC-derived+enteric+ganglioids+model+human+ENS+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+Schwann+cells+from+hPSCs+enables+disease+modeling+and+drug+discovery+for+diabetic+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy.</a> Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).</li>
<li>Samuel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Schwann+cell+derived+melanocytes+from+hPSCs+identifies+pro-metastatic+factors+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
<li>Richter, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+muscarinic+receptor+signaling+protects+human+enteric+inhibitory+neurons+against+platin+chemotherapy+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Burada tarif edilen farklılaşma protokolü, 30-40 gün içinde hPSC'lerden enterik nöronlar elde etmek için sağlam bir in vitro yöntem sağlar (Şekil 1E) ve daha eski kültürlerde glial fibriler asidik protein, GFAP ve SOX10 eksprese eden enterik glia (> gün 55)13,14,19,22. Bu nöronlar ve glia, hPSC'lerin vagal ve enterik nöral krest hücrelerine kademeli olarak farklılaşması ve ardından enterik nöron ve glia progenitörleri13,14 ile indüklenir. Nöral krest hücreleri, nöral krest belirteçlerini, transkripsiyon faktörü AP-2 alfa ve beta, TFAP2A ve TFAP2B'yi sırasıyla21 eksprese eder. Daha önce CD49'un hPSC'den türetilmiş nöral krest hücrelerinin14 verimliliğini belirtmek için bir belirteç olarak kullanılabileceğini göstermiştik. Bu yöntemin verimliliği ve başarısı, faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. İlk olarak, tüm adımların steril koşullar altında gerçekleştirilmesi çok önemlidir. hPSC kültürlerinin mikoplazma kontaminasyonu açısından test edilmesi, kök hücre büyümesini olumsuz etkileyebileceği ve görsel olarak tespit edilemediği için önemlidir. İkincisi, eşit ve düzgün bir şekilde kaplanmış plakaların kullanılması, yamalı hPSC kültürünün büyümesi ve NC kültürlerinin ve daha eski nöronların kuyucukların yüzeyinden ayrılması olasılığını azaltır. Üçüncüsü, farklılaşmada yüksek verimlilik için pluripotent ve tamamen farklılaşmamış hPSC hücreleri ile başlamak esastır. hPSC kolonileri, koloni sınırlarında minimal farklılaşan hücrelere sahip olmalıdır. hPSC'ler, koloniler büyük olduğunda veya bir faz kontrast mikroskobu ile gözlemlendiği gibi koloninin merkezi rengi kalınlaşmaya/koyulaşmaya başladığında farklılaşma için geçilmeli veya kaplanmalıdır. İstenmeyen farklılaşmış hücreler (genellikle mezenkimal hücreler), sadece genel farklılaşma verimliliğini düşürmekle kalmaz, aynı zamanda kültürler yaşlandıkça nöronların kuyu yüzeyinden ayrılmasına neden olabilir. Bu nedenle ENC kültürlerinin ilk 15 gün dikkatli bir şekilde izlenmesi önerilir. Verimli farklılaşma koşulları altında, kültürün ~ 6. gününde yüzeyinde koyu renkli diskler belirir, bu da 12-15. günlerde verimli sferoid oluşumunu gösterir. Ek olarak, küresel fazda (12-15. gün) serbest yüzen küreler pürüzsüz yüzeylere sahip olmalıdır (Şekil 1D). 3D küresel fazın 12-15. günlerde sürdürülmesi, kültürlerin ENS soylarına aşağı akış farklılaşması için ENC'lerin saflığını iyileştirmek için genellikle yeterlidir. Bununla birlikte, erken ve saf ENC progenitör hücre popülasyonları gerektiren çalışmalar için, CD49D kullanılarak FACS önerilir. CD49D, SOX10:hPSC'den türetilmiş NC soyları için spesifik bir yüzey işaretleyicidir vehücre hatları 13,14 boyunca başarıyla kullanılmıştır. FACS kullanarak CD49D + hücrelerinin izole edilmesi hakkında daha fazla bilgi ve geçit stratejisi okuyucuları hakkında öneriler için Barber ve ark, Şekil 2D, Kutu 1 ve Ek Şekil 614 tarafından hazırlanan makaleye başvurulur. Dördüncüsü, verimliliği en üst düzeye çıkarmak için, farklılaşma, hPSC kültürleri tek katmanlı ve ~%80 birleşik olduğunda başlamalıdır. Bu, 2. günde tamamen uyumlu bir kültüre sahip olmak anlamına gelir. Daha düşük birleşme, verimliliği olumsuz etkiler ve çok yoğun kültürler daha yüksek hücre ölümü oranına sahip olma eğilimindedir ve potansiyel olarak istenmeyen farklılaşmış hücrelerin ortaya çıkmasına neden olabilir.
Hücrelerin 15. günde yeniden kaplanması bu protokolde önemli bir adımdır. Bu, tek katmanlı bir nöronal kültür için son hücre transfer adımıdır ve bu nedenle plaka düzeni planlanan tahlillere göre seçilmelidir. Her bir oyuğa aktarılan hücre sayısı, nöronal çeşitliliği ve kuyucukların yüzeyine bağlı kalan eski nöronları önemli ölçüde etkileyebilir. Genel olarak,cm2 başına 250.000-350.000 hücre aralığında bir hücre yoğunluğu (96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına yaklaşık 75.000-100.000 hücre veya 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 500.000-700.000) arzu edilir. 30-40. günden başlayarak, özellikle daha uzun nöron kültürleri için planlanan hücreler için nöronların ayrılmasını prospektif olarak önlemek için besleme ortamına (haftada bir defadan fazla olmamak üzere) fibronektin ve laminin eklenmesi düşünülebilir. Bu noktada, besleme sıklığının her 5-7 günde bire düşürülmesi ve ekstra taze ortam eklemeden önce her kuyucukta bir miktar orta bırakılması önerilir. Bu, nöronal projeksiyonlara gereksiz fiziksel stres uygulama şansını azaltır. Ortamın buharlaşması göz önüne alındığında (özellikle plakanın sınırındaki kuyucuklar için) 75 μL çıkarılabilir ve her oyuğa 100 μL taze ortam eklenebilir. Tecrübelere dayanarak, polimer lamel tabanlı görüntüleme plakaları üzerinde yetiştirilen kültürler, kuyu yüzeyine daha uzun süre yaşama ve bağlı kalma eğilimindedir. Bu nedenle, diğer hücre tipleri ile ko-kültürler gibi çok eski nöronal kültürler gerektiren deneyler için polimer lamel alt görüntüleme plakalarının dikkate alınması önerilir. Havayla kurutulmuş PO / FN / laminin kaplı plakalar hala verimli bir farklılaşma sağlayabilse de, bu, bu protokolün amacı için sistematik olarak test edilmemiştir. Bu nedenle, yeni kaplanmış plakaların kullanılması tavsiye edilir.
Burada açıklanan protokol, Barber ve ark.14 tarafından daha önce yayınlanmış bir protokole dayanmaktadır. Serum replasman faktörleri (örneğin, KSR)13,14 içeren besiyerlerini kullanan eski ENC indüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mevcut protokol besiyeri koşulları kimyasal olarak tanımlanmıştır. Bu, daha tutarlı farklılaşmalara karşı avantajlıdır ve kültür koşullarını manipüle ederek daha kesin gelişimsel çalışmalara izin verir. Bu sağlam protokol, H9, UCSF4 ve WTC11 gibi test edilmiş bağımsız indüklenmiş ve embriyonik kök hücre hatlarından tekrarlanabilir bir şekilde enterik nöron kültürleri üretir. Sunulan protokolün güçlü bir yönü, insan ENS'sinde bulunanlara benzeyen çeşitli ENS nöronal alt tipleri üretme kapasitesidir. Örneğin, farklı ENS nörokimyasal kimlikleri için spesifik belirteçlerin ekspresyonu, akış sitometrisi ve floresan görüntüleme ile kontrol edilebilir (Şekil 1F,G). Nitrik oksit sentaz 1 (NOS1) için pozitif olan hPSC'den türetilmiş enterik nöronal popülasyonların tipik aralığı %5-20'dir; kolin O-asetiltransferaz (CHAT)% 40 -% 60'tır; gama-aminobütirik asit (GABA) %15-%30 ve serotonin (5-HT) %15-%30'dur. Bununla birlikte, bu alt tipler arasındaki in vitro yapısal ve işlevsel bağlantının in vivo hücresel ağları ne ölçüde doğru bir şekilde modellediği daha fazla çalışma gerektirmektedir. Ek olarak, bireysel alt tiplerin transkripsiyonel profilini genişletmek için yapılan tek hücre analizleri, yalnızca in vivo ve in vitro hücresel kimliklerin daha iyi karşılaştırılmasına yardımcı olmakla kalmayacak, aynı zamanda ilaç keşfi ve rejeneratif tıp için spesifik alt tipleri zenginleştirmeye yönelik gelişimsel ve moleküler çalışmaların yanı sıra gelecekteki protokol optimizasyonlarına da fayda sağlayacaktır.
Farklı nöronal ve daha eski kültürlerde glial hücreler içeren kültürlere rağmen, bu protokol kas hücreleri, epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi ENS'nin in vivo nişinde doğal olarak bulunan diğer hücre tiplerini üretmez. ENS'nin bu hücre tipleri ile sağlık ve hastalık bağlamında etkileşimini incelemek, ko-kültür ve bağırsak organoid sistemlerini optimize etmeye yatırım yapmayı gerektirir. Genel olarak, in vitro olarak hPSC'lerden ENS'nin farklı alt tiplerini oluşturmak için güçlü bir yöntem burada açıklanmaktadır. Ölçeklenebilir kültürler, insan ENS'sinin gelişimsel çalışmaları, ilaç tedavileri geliştirmeyi ve enterik nöropatileri tedavi etmek için nakledilebilir hücreler sağlamayı amaçlayan toksikoloji testleri ve hastalık modelleme deneyleri için uygundur.

Enterik sinir sistemi (ENS), periferik sinir sisteminin en büyük bileşenidir. ENS, gastrointestinal sistem içinde yer alan ve bağırsağın neredeyse tüm fonksiyonlarını kontrol eden 400 milyondan fazla nöron içerir1. ENS gelişimi ve fonksiyonu ile enterik nöropatilerdeki kusurlarının moleküler olarak anlaşılması, güvenilir ve otantik bir enterik nöron kaynağına erişim gerektirir. İnsan primer dokusuna erişim sınırlıdır ve hayvan modelleri birçok enterik nöropatide anahtar hastalık fenotiplerini özetlemekte başarısız olmaktadır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) teknolojisinin, özellikle birincil kaynaklardanizole edilmesi zor olanlar olmak üzere, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir kaynağını sağlamada son derece faydalı olduğu kanıtlanmıştır 2,3,4,5,6,7. Burada, hPSC'lerden ENS kültürleri elde etmek için aşamalı ve sağlam bir in vitro yöntemin ayrıntılarını sunuyoruz. Bu ölçeklenebilir hPSC'den türetilmiş kültürler, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi ve yüksek verimli ilaç taraması için yollar açar ve rejeneratif tıp için nakledilebilir hücreler sağlayabilir.
Enterik nöron soyları, embriyogenez sırasında ENS gelişim yolunu izleyen nöral krest (NC) hücrelerinden türetilir. Embriyolarda, NC hücreleri katlanan nöral plakanın kenarları boyunca ortaya çıkar. Çoğalırlar, göç ederler ve duyusal nöronlar, Schwann hücreleri, melanositler, kraniyofasiyal iskelet ve enterik nöronlar ve glia 8,9,10 dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipine yol açarlar. Hücre kaderi kararı, NC hücrelerinin çıktığı ön-arka eksen boyunca farklı bölgeye, yani kraniyal NC, vagal NC, gövde NC ve sakral NC'ye bağlıdır. ENS, vagal ve sakral NC hücrelerinden gelişir ve birincisi, bağırsağın uzunluğu boyunca geniş göç ve bağırsağı kolonize etmesi nedeniyle enterik nöronların popülasyonuna hakimdir11.
NC hücrelerinin PSC'lerden türetilmesi genellikle ikili SMAD inhibisyonu ve WNT yolu aktivasyonunun bir kombinasyonunu içerir12,13. Yakın zamana kadar, tüm NC indüksiyon protokolleri, kültür koşullarında serum ve diğer hayvansal ürün katkı maddelerini içeriyordu. Kimyasal olarak tanımlanmamış ortamlar sadece NC indüksiyonunun tekrarlanabilirliğini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda mekanik gelişimsel çalışmalara da meydan okur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Barber ve ark.14, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarını kullanarak bir NC indüksiyon protokolü geliştirdi ve bu nedenle serum replasman faktörlerine (örneğin, KSR) dayanan alternatif yöntemlere göre avantajlıydı13,14. Bu, bazal medya replasmanları ve orijinal olarak Fattahi ve arkadaşları tarafından hPSC'lerden enterik NC hücreleri türetmek için sunulan bir protokolün optimize edilmesiyle elde edildi. Bu geliştirilmiş sistem, burada sunulan hPSC farklılaşma protokolünün temelidir. Retinoik aside (RA) ek olarak BMP, FGF, WNT ve TGFβ sinyallerinin hassas modülasyonu ile 15 günlük bir süre içinde enterik nöral krest (ENC) hücrelerinin indüksiyonu ile başlar. Daha sonra, hücreleri glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF) ile tedavi ederek ENS soylarını türetiriz. Tüm besiyeri bileşimleri kimyasal olarak tanımlanır ve 30-40 gün içinde sağlam enterik nöronal kültürler verir.
Burada tarif edilen tek katmanlı hücre kültürü sistemine ek olarak, serbest yüzen embriyoid cisimciklerini kullanan alternatif NC indüksiyon yaklaşımları geliştirilmiştir 15,16. Bu kültürlerdeki göçmen hücrelerin, vagal NC'yi temsil eden bir alt küme ile NC belirteçlerini eksprese ettiği gösterilmiştir. Primer barsak dokusu ile ko-kültürler, bu kültürlerde enterik NC öncüllerini zenginleştirmek için kullanılmıştır. Bu çalışmalardaki medya kompozisyonları, sinir büyüme faktörü, NT3 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör gibi farklı faktörlerin bir kombinasyonunu içerir. Bu aşamada, bu faktörlerin enterik nöron öncü bağlılık kimliklerini nasıl etkileyebileceği tam olarak açık değildir. Tek tabakalı enterik NC indüksiyonunun ve embriyoid-vücut bazlı kültürlerin etkili bir şekilde karşılaştırılması için daha fazla veri gereklidir. Bu stratejilerdeki farklı kültür düzenleri göz önüne alındığında, her bir yöntemin kullanımı göz önünde bulundurularak belirli bir uygulamaya göre dikkate alınmalı ve optimize edilmelidir.
Burada sunulan protokol tekrarlanabilir ve biz ve diğerleri tarafından farklı hPSC (indüklenmiş ve embriyonik) hatları kullanılarak başarıyla test edilmiştir 8,14,16.

<table><tbody><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi (serum içermez, eksi A vitamini)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Bodrum membran matrisi, Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A14133-2</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D sistemleri</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü santrifüjü</td><td>Eppendorf, model no. 5810R</td><td>02262501</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ayırma çözümü, Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler</td><td>ABD bilimsel</td><td>1475-0511, 1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Farklılaşma temel ortamı, Temel 6</td><td>Yaşam Teknolojiler</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 glutamin içermez</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Besleyicisiz hPSC bakım ortamı, Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D sistemleri</td><td>233-FB / CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>İnsan pluripotent kök hücreleri, H9 ESC</td><td>WiCell</td><td>RRID: Kontrollü</td> nem, sıcaklık ve CO2 ile CVCL_1240 <td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Herralcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1300 serisi sınıf II, tip A2</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cultrex</td><td>3400-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin takviyesi, Glutagro</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAAs</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Çok kuyulu plakalar, Falcon</td><td>BD</td><td>353934, 353075</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi</td><td>CTS</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Orta Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca ve Mg içermez)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet dolgusu</td><td>Eppendorf</td><td>Z768715-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>ABD bilimsel</td><td>1111-2830</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E, 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>PO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>polimer lamel alt görüntüleme plakaları, ibidi</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R& D sistemleri</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi leke, %0,4</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra düşük bağlantı plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>R& D sistemleri</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

enterik sinir sistemi soylarının İnsan pluripotent kök hücrelerinden farklılaşması

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan enterik sinir sistemi, ENS, dikkate değer nörotransmitter çeşitliliğine sahip geniş bir glial ve nöronal hücre tipleri ağıdır. ENS bağırsak hareketliliğini, enzim sekresyonunu ve besin emilimini kontrol eder ve bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu ile etkileşime girer. Sonuç olarak, ENS'nin gelişimsel ve edinilmiş kusurları birçok insan hastalığından sorumludur ve Parkinson hastalığının semptomlarına katkıda bulunabilir. Hayvan model sistemlerindeki sınırlamalar ve birincil dokuya erişim, insan ENS çalışmalarında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) ENS soylarının etkili in vitro türetilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Protokolümüz, 15 gün içinde hPSC'lerin enterik nöral krest hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ile başlar ve 30 gün içinde fonksiyonel enterik nöronların çeşitli alt tiplerini verir. Bu platform, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif uygulamalar için ölçeklenebilir bir kaynak sağlar.

Bu protokol, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöral krest ve enterik nöronlar türetmek için bir yöntem sağlar (Şekil 1A-B). Yüksek kaliteli nöronların üretilmesi, verimli bir enterik nöral krest indüksiyon adımına bağlıdır. Bu, Şekil 1C'de görüldüğü gibi yaklaşık 0,1 - 0,4 mm boyutunda pürüzsüz yüzeylerle yuvarlak görünmesi gereken serbest yüzen kürelerin morfolojisi kontrol edilerek görsel olarak değerlendirilebilir. Bu sferoidler, Şekil 1D'de görülebileceği gibi, nöral krest işaretleyici SRY-Box transkripsiyon faktörü 10 (SOX10)17,18'i de ifade etmelidir. Enterik nöron indüksiyon fazı sırasında, nöritler 25-30. gün gibi erken bir sürede görünür hale gelebilir (Şekil 1E). Bununla birlikte, istenmeyen mezenkimal hücre kontaminasyonlarını içeren daha düşük verimliliğe sahip farklılaşmalarda bu gecikebilir. İnsan enterik sinir sistemi, farklı nörotransmiterleri ifade eden çeşitli nöronların bir koleksiyonudur. Bu heterojenlik, sağlanan in vitro protokolde özetlenir ve anahtar belirteçlerin ekspresyonu, daha önce açıklanan protokoller13,14,19,20,21'e göre immünofloresan görüntüleme ve akış sitometrisi gibi hücre boyama yöntemleri ile değerlendirilebilir (Şekil 1F,G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66133/66133fig01v2.jpg"> Şekil 1: İnsan ENC hücrelerinin ve enterik nöron alt tiplerinin hPSC'lerden türetilmesi. (A) hPSC'den enterik nöral krest (ENC) indüksiyonu. hPSC'lerden ENC hücreleri türetmek için ortam bileşimlerini gösteren protokol (0-12. günler). (B) ENC sferoid oluşumu ve ENC'den enterik nöron indüksiyonu. ENC sferoid oluşumu için ortam bileşimini gösteren protokol (12-15. günler). Daha sonra enterik nöronlar, GDNF ve AA içeren bir besiyeri ile muamele edilerek üretilir ve olgunlaştırılır. (C) Protokolün farklı zaman noktalarında farklılaşan hPSC'lerin temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu: 1000 μM. (D) SOX10::14. günde H9 iPSC'den türetilmiş ENC sferoidlerini eksprese eden GFP. Ölçek çubuğu: 1000 μm. (E) 33. gün nöronlarının faz sözleşmesi görüntüsü. Ölçek çubuğu: 400 μm. (F-G) 40. gün nöronlarında nörotransmitter belirteçlerinin immünofloresan görüntüleme (F) ve akış sitometrisi (G). Ölçek çubuğu: 50 μm. Kısaltmalar: BMP4 = rekombinant insan BMP4 proteini; RA = retinoik asit; FGF2 = rekombinant insan FGF temel; GDNF = rekombinant insan glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör; AA = askorbik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66133/66133fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.

Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

Burada, tam olarak tanımlanmış koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerinden insan enterik nöronlarının üretilmesi için bir yöntem sunuyoruz ve bu hücreleri insan enterik sinir sistemi gelişimini ve işlevini anlamak için kullanıyoruz. Bu yüzden insan enterik sinir sistemi gelişiminin, fizyolojisinin ve patofizyolojisinin büyük bir zorluk olduğunu düşünüyorum ve bunun nedeni enterik sinir sistemi hücrelerinin nadir olması ve nöral krest progenitörlerinin geçici doğası ve dokuya erişim ve dokunun izolasyonundaki zorluktur. Bu, HPSC'lerden otantik ve işlevsel insan enterik nöronları üretmek için sağlam bir platformdur ve doku erişiminde uzun süredir devam eden teknik zorlukların üstesinden gelerek, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve ENS gelişmelerini ve işlevini incelemek için enterik sinir sistemi bileşenlerinin ölçeklenebilir kültürlerini sağlar.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Bu video, transgenik olmayan ve transgenik insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) nöral progenitör hücrelerin oluşumunu göstermektedir. hPSC'ler, bir nöronal farklılaşma ortamı kullanılarak nöral progenitör hücrelere farklılaştırılır. Farklılaşma, küçük moleküller kullanılarak transgenik olmayan hücrelerde indüklenirken, transgenik hPSC'ler, nöronal farklılaşmaya özgü bir transkripsiyon faktörü için promotörü indükleyen bir antibiyotik eklenerek farklılaştırılır.

Transgenik Olmayan ve Transgenik İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Nöral Progenitör Hücrelere Ayırt Edilmesi

Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSC) türetilmiş nöral krest (NC) hücreler, insan gelişimi ve hastalık modelleme ve hücre replasman tedavileri için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, şu anda yaygın olarak kullanılan bir besleyici ücretsiz...

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Doğal insan bağırsağının yapısını ve işlevini daha iyi özetlemek için insan bağırsak organoidleri innerve edilmelidir. Burada, bir enterik sinir sistemini bu yapılara dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan Bağırsak Organoidlerinin İnnervasyonu

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden enterik sinir sistemi soylarını farklılaştırma yöntemini. Bu protokol, hastalık modelleme ve rejeneratif tıp için ölçeklenebilir fonksiyonel nöron üretimi sağlar.

Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması

Daha fazla video keşfet