Name: Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Keşfedin tek moleküllü görüntüleme ile biyomoleküler kondensatlarda protein etkileşim dinamiğini. Bu yöntem, canlı insan hücrelerinde protein bağlanma sürelerini nicelendirerek transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından Hibe No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Ödülü (S.C.), Searle Scholar Ödülü (S.C.), Shurl ve Kay Curci Vakfı Araştırma Bursu (S.C.), Merkin İnovasyon Tohum Hibesi (S.C.), Mallinckrodt Araştırma Bursu (S.C.) ve Margaret E. Erken Tıbbi Araştırma Vakfı 2024 Hibesi (SC). SC ayrıca NIH/NCI tarafından P30CA016042 Numaralı Ödül altında desteklenmektedir.

1. Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi
<ol><li>İstenilen hücre hattında HaloTag ile kaynaşmış ilgilenilen proteini ifade edin.</li>
	<li>Halo etiketli H2B'yi, transpozonlar veya viral transdüksiyon kullanarak 1.1'deki ile aynı tip hücrelerde kararlı bir şekilde eksprese edin.</li>
</ol>2. Lamellerin hazırlanması
<ol><li>Hücre kültürü için lamelleri kullanmadan önce, otofloresan kirleticileri gidermek için lamelleri temizleyin.<ol><li>25 mm çapında, #1.5 lameller seramik bir boyama rafına monte edin ve bir polipropilen kaba yerleştirin.</li>
		<li>Lamelleri 1 M'lik bir KOH çözeltisine tamamen daldırın ve 1 saat boyunca sonikleştirin.</li>
		<li>Lamelleri çift damıtılmış su (ddH2O) ile üç kez durulayın.</li>
		<li>Lamelleri tamamen% 100 etanole daldırın ve 1 saat boyunca sonikat yapın.</li>
		<li>Lamelleri ddH2O ile seyreltilmiş etanole tamamen daldırın ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması
NOT: Hücrelerin kirlenmesini önlemek için bu bölümdeki adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
<ol><li>Temizlenmiş lameller üzerindeki plaka hücreleri. Halo etiketli proteinin geçici olarak eksprese edilmesi gerekiyorsa görüntülemeden 2 gün önce gerçekleştirin. Halo etiketli proteinin stabil veya endojen olarak eksprese edilip edilmediğini görüntülemeden 1 gün önce gerçekleştirin.<ol><li>Lamelleri 6 oyuklu bir plakaya (hücre numunesi başına bir lamel/kuyucuk) yerleştirmek için steril forseps kullanın ve artık etanolün buharlaşmasına izin verin.</li>
		<li>Görüntüleme sırasında% 70 birleşme elde etmek için her bir kuyucuğu uygun sayıda hücre ile kaplayın. Aynı hedef birleşme ile H2B-Halo'yu stabil bir şekilde eksprese eden hücrelerle ek bir kuyu kaplayın.</li>
		<li>Bu adımı, yalnızca ilgilenilen Halo etiketli proteini geçici olarak ifade ediyorsanız izleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin. Daha sonra, uygun transfeksiyon reaktiflerini kullanarak ve üreticinin yönergelerini izleyerek, ilgilenilen etiketli proteini kodlayan plazmid ile hücreleri transfekte edin.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>İlgilenilen Halo etiketli proteini eksprese eden hücreleri, hem fotoaktif olmayan bir Halo ligandı (örneğin, JFX549) hem de fotoaktif hale getirilebilir bir Halo ligandı (örneğin, PA-JF646) ile boyayın. Sadece fotoaktive olabilen Halo ligandı ile H2B-Halo eksprese eden hücreleri boyayın. NOT: Burada listelenen Halo ligandlarının konsantrasyonları bir başlangıç noktası olarak kullanılmalıdır; Optimal konsantrasyon, ilgilenilen proteinin ekspresyon seviyesine ve kondensat içi lokal konsantrasyonuna bağlı olacaktır.<ol><li>İlgilenilen Halo etiketli proteini eksprese eden her hücre örneği için, 100 μL uygun hücre ortamında 100 nM JFX549 Halo ligand35 ve 20 nM PA-JF646 Halo ligand36'yı seyreltin. H2B-Halo eksprese eden her numune için, 500 μL uygun hücre ortamında sadece 20 nM PA-JF646 Halo ligandını seyreltin.</li>
		<li>Her kuyucuk için mevcut ortamı aspire edin, 2 mL 1x PBS ekleyin, ardından PBS'yi aspire edin (bu, protokolün geri kalanı için "durulama" olarak adlandırılır) ve uygun Halo ligandlarını içeren ortamla değiştirin.</li>
		<li>37 °C ve% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>PBS ile dört kez durulayın ve Halo ligandları içermeyen taze ortamla değiştirin.</li>
		<li>37 °C ve% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını üç kez tekrarlayın (toplam dört durulama-inkübasyon döngüsü).</li>
		<li>Hücrelerle birlikte lameli mikroskop aşamasıyla uyumlu bir hücre kültürü lamel odasına aktarmak için steril forseps kullanın.</li>
		<li>Hazneye fenol kırmızısı içermeyen ortam ekleyin ve görüntülemeye devam edin. İhtiyaç duyulana kadar 37 °C ve% 5 CO2 'de hemen görüntülenmeyen numuneleri inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tek moleküllü görüntüleme
NOT: Hem H2B'nin hem de ilgilenilen proteinin kalma sürelerini ölçen bağımsız deneyler, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için birden fazla (≥3) gün boyunca yapılmalıdır. Hücre örneklerini mikroskopta görüntülemeden önce, iki kamerayı 0,1 μm lekeli mikro küreler (Malzeme Tablosu) veya benzer bir kalibrasyon standardı kullanarak hizalayın.
<ol><li>Mikroskobu hazırlayın.<ol><li>Mikroskobu ve mikroskobu kontrol eden bilgisayarı açın.</li>
		<li>Mikroskopta canlı hücre inkübasyon bileşenlerini (ısıtıcı ve CO2) açın ve 37 ° C ve% 5 CO2 'ye ayarlayın. Sistemin dengelenmesine izin verin.</li>
		<li>Mikroskop üzerinde 100x TIRF yağa daldırma objektifine uygun yağdan bir damla damlatın ve hücre örneğini mikroskop aşamasına yükleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntülenecek bir hücreyi tanımlayın.<ol><li>Hücre örneğini parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin ve hücreler odaklanana kadar z konumunu ayarlayın.</li>
		<li>Sağlıklı hücrelerin morfoloji özelliklerini sergileyen bir hücreyi tanımlayın.</li>
		<li>Görüş alanını (FOV) yalnızca hedef hücre çekirdeğini yakalayacak şekilde kırpın.</li>
		<li>Lazer aydınlatmayı kullanın ve tek moleküllerin optimum sinyal-gürültü oranına sahip HILO aydınlatması41 elde edilene kadar TIRF açısını ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücrelerde H2B-Halo görüntüsü. NOT: Bu bölümde kullanılan lazer güçleri bu deneye özeldir ve örnek olarak dahil edilmiştir. Tartışmada listelenen kriterlere göre uygun lazer güçleri seçilmelidir.<ol><li>Aşağıdaki gibi bir alım yapılandırması ayarlayın. Pozlama süresini 500 ms olarak ayarlayın. Her 500 ms maruziyet sırasında, PA-JF646 etiketli H2B-Halo moleküllerini 9.1 mW, 640 nm ışınla uyarın. Çerçeveler arasındaki ölü zamanda (burada kullanılan görüntüleme sisteminde 158.01 μs), molekülleri 111 μW, 405 nm ışınla fotoaktive eder.</li>
		<li>Bu ayarlar altında sürekli olarak 2000 kare yakalayın. Fotoaktif moleküllerin sayısı yetersiz hale geldiğinde, edinme boyunca 405 nm ışının gücünü kademeli olarak artırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücrelerde ilgilenilen Halo etiketli proteini görüntüleyin.<ol><li>Emisyon dalga boylarını iki kamera arasında bölmek için uzun geçişli bir dikroik ayna kullanın, biri PA-JF646'yı ve diğeri JFX549'u algılamak için. Kameraların önünde uygun emisyon filtreleri kullanın.</li>
		<li>Aşağıdaki değişiklikle 4.3.1'de açıklanan aynı alma yapılandırmasını kullanın. Halo etiketli protein kondensatlarının zaman içindeki konumlarını izlemek için ek bir JFX549 kanalı ekleyin. Her 10 saniyede bir, PA-JF646 kanalının alımını korurken JFX549 kanalında bir kare (500 ms, 2,1 mW, 561 nm uyarma) elde edin. Bu, satın alma sonrası veri analizinde halledilecek olan PA-JF646 kanalına sızıntıya neden olacaktır.</li>
		<li>Bu ayarlar altında sürekli olarak 2000 kare yakalayın. Fotoaktif moleküllerin sayısı yetersiz hale geldiğinde, edinme boyunca 405 nm ışının gücünü kademeli olarak artırın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi
NOT: Bölüm 5 boyunca kullanılan parametreler bu deneye özeldir ve örnek olarak dahil edilmiştir. Tartışmada listelenen kriterlere göre uygun parametreler seçilmelidir.
<ol><li>Ham görüntüleme verilerini işlenmek üzere hazırlayın.<ol><li>İlgilenilen proteinin verileri için, ham görüntüleme veri dosyasındaki her kanalı ImageJ veya benzeri bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bağımsız bir .tif dosyasına dönüştürün. H2B verileri için, ham görüntüleme veri dosyasındaki tek kanalı aynı şekilde bir .tif dosyasına dönüştürün. NOT: Kullanılan toplama yazılımına bağlı olarak, her 10 saniyede bir yalnızca bir yoğuşma izleme karesi alındığından, yoğuşma filminde boş kareler olabilir. Boş çerçeveler en son yoğuşma çerçevesi ile doldurulmalıdır (bazı toplama yazılımları bunu otomatik olarak yapar). Ek olarak, bu yoğuşma izleme çerçeveleri sırasında yoğuşma (JFX549) kanalından tek moleküllü (PA-JF646) kanala önemli bir sızıntı varsa, karşılık gelen tek moleküllü çerçeveler en son tek moleküllü çerçeve ile değiştirilmelidir.</li>
		<li>Yukarıdaki nedenlerden dolayı her iki filmde de değiştirilmesi gereken kareler varsa, Chong ve ark.1'de bulunan bir ImageJ makrosu olan pretracking_comb.txt'yi değiştirerek (gerekirse) ve çalıştırarak ve istemleri izleyerek bunları o filmden en son kareyle değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir SPT yazılımı kullanarak tek parçacıklı yörüngeler oluşturun, örneğin, SLIMfast39, Teves ve ark.42'de bulunan MTT algoritmasının38 bir GUI uygulaması.<ol><li>Tek moleküllü filmi içeren dosyayı 5.1.2'den SLIMfast'&gt; Yükle'ye tıklayarak yükleyin.</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (yerelleştirme hata oranı: 10-6; deflasyon döngüleri: 3) OPT &gt; Sayfa: Yerelleştirme'ye tıklayarak yerelleştirme için.</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (tepe emisyonu: 664 nm; gecikme süresi: 500 ms) OPT &gt; Sayfa: Edinme'ye tıklayarak edinme için.</li>
		<li>Seçilen parametrelerin uygun olduğundan emin olmak için tüm moleküllerin lokalizasyonlarını tek bir çerçevede görselleştirin (TEST LOC). Uygun değilse, 5.2.2 ve 5.2.3 adımlarındaki parametreleri değiştirin ve bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Her karedeki tüm moleküllerin lokalizasyonlarını içeren bir dosya oluşturun (LOC ALL).</li>
		<li>SLIMfast'&gt; Parçacık Verilerini Yükle'ye tıklayarak dosyayı 5.2.5'ten SLIMfast'&gt; yükleyin.</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (beklenen maksimum difüzyon katsayısı: 0,1 μm2/s; maksimum yarışmacı sayısı: 5) OPT &gt; Sayfası: İzleme'ye tıklayarak yörünge oluşturma için.</li>
		<li>Tüm moleküllerin yörüngelerini içeren bir dosya oluşturun (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Yapay olarak kısa yörüngelerle sonuçlanan izleme hatalarını hesaba katmak için Drosopoulos ve ark.43'te bulunan evalSPT39'u kullanarak tmin, 2,5 s'den daha kısa yörüngeleri filtreleyin.<ol><li>Dosyayı 5.2.8'den evalSPT'ye yükleyin (+ 5.2.8'den &gt; OK'den &gt; dosya).</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (min: 5 kare; Maks: 5.2.8'den itibaren dosya için maksimum yörünge uzunluğu) 2.5 s'den kısa yörüngeleri filtrelemek için.</li>
		<li>Filtrelenmiş tüm yörüngeleri içeren bir dosya oluşturun (VERİLERİ DIŞA AKTAR).</li>
	</ol></li>
	<li>Bu adımı yalnızca ilgilenilen proteinin yörüngeleri için izleyin. Yörüngeleri kondensatlarda ve kondensatlarda olanlara göre sıralayın, ardından ortalama kondens içinde kalma süresini çıkarın. NOT: Bu bölümdeki tüm kodlar Chong ve ark.1'de mevcuttur.<ol><li>ImageJ makrosunu, çekirdeğini ve küme mask_v2.txt çalıştırarak ve istemleri izleyerek yoğunlaşma konumlarını vurgulayan zaman atlamalı bir film oluşturmak için JFX549 kanalında alınan filmin tüm karelerini eşikleyin.</li>
		<li>5.3.3'te oluşturulan tek moleküllü yörüngeleri yeniden biçimlendirin. MATLAB komut dosyasını, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; Çözünürlük, 0,16 μm/piksel).</li>
		<li>Yörüngeleri, belirli bir molekülün bir kondensatta (F) geçirdiği ömrün kesirine göre, MATLAB komut dosyasını (categorization_v4.m) kullanarak ve dosya adlarını ve yolları gerektiği gibi ayarlayarak sıralayın.</li>
		<li>Yalnızca yoğuşma yörüngelerini kullanarak devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>kobs,s ve kpb'yi çıkarın ve düzeltilmiş ortalama kalış süresini hesaplayın, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>MATLAB komut dosyasını, PLOT_ResidenceHist_css.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak ilgilenilen yörüngelerin kondensat proteininden kobs,s'yi çıkarın. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; StartFrameForFit, 5 kare).</li>
		<li>MATLAB komut dosyasını, PLOT_ResidenceHist_css.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak H2B yörüngelerinden kpb'yi çıkarın. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; StartFrameForFit, 5 kare).</li>
		<li>İlgilenilen proteinin özellikle kondensatlarına bağlı düzeltilmiş ortalama kalış süresini hesaplayın, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> NOT: 300 ms ve 800 ms gibi hareketli parçacıkları bulanıklaştırmak için yeterince uzun olan farklı maruz kalma sürelerinin, ilgilenilen proteinin aynı ortalama kalma süresiyle sonuçlandığını doğrulamak için kontroller yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada sunulan protokol, Irgen-Gioro ve ark.40'ta araştırılanlar gibi sistemler için tasarlanmıştır. Uygulamaya bağlı olarak, protokolün bazı bileşenleri değiştirilebilir, örneğin, floresan etiketli hücre hatları oluşturma yöntemi, floresan etiketleme sistemi ve kullanılan lamel stili. Bir hücredeki bir proteinin halo etiketlemesi, belirli bir deney için hangisinin daha uygun olduğuna bağlı olarak iki strateji kullanılarak yapılabilir. 1) Eksojen ekspresyon: ilgilenilen proteinin bir HaloTag ile kaynaştırılması ve füzyonun bir hedef hücre hattında transfeksiyon kullanılarak geçici olarak veya transpozonlar veya viral transdüksiyon kullanılarak stabil olarak eksprese edilmesi. 2) Genom düzenleme: Genom düzenleme tekniklerini, örneğin CRISPR44'ü kullanarak bir hedef hücre hattında ilgilenilen endojen proteini kodlayan gen lokusuna bir HaloTag vurun. Her birinin yararları ve sakıncaları başka bir yerde tartışılmaktadır45, ancak kısaca, dışsal ekspresyon stratejisi daha az zaman alıcıdır, ancak genellikle fizyolojik olmayan geniş bir ekspresyon seviyesi aralığına sahip bir hücre popülasyonu üretir. Genom düzenleme stratejisi çok daha uzun sürer, ancak endojen olarak ifade edilen proteinleri doğal ekspresyon seviyelerinde etiketler.
Ek olarak, bu protokol özellikle bir HaloTag kullanımını gerektirmez; daha ziyade, hücrede aynı proteinin aynı anda tek molekül ve topluluk etiketlemesini sağlayan herhangi bir etiketle uyumludur. Böylece protokol, SNAP-tag46 gibi diğer kendi kendini etiketleyen etiketlerle kullanılmak üzere değiştirilebilir. Son olarak, MatTek kapları (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C) gibi hücre kültürü için önceden temizlenmiş, ticari cam tabanlı kaplar, mikroskop objektifi ve daldırma yağı ile uyumlu olmaları koşuluyla lamel odaları yerine kullanılabilir; Bununla birlikte, lameller kullanımdan hemen önce daha kapsamlı bir şekilde temizlenebilir, bu nedenle tercih edilir.
Protokolde yapılan yukarıdaki değişiklikler isteğe bağlı olsa da, optimize edilmesi gereken deneysel ve analiz parametreleri vardır, yani HaloTag ligandlarının konsantrasyonları, lazer güçleri, lokalizasyon ve izleme parametreleri ve tmin. Fotoaktif olmayan HaloTag ligandının konsantrasyonu, kondensin maske oluşumunu sağlayacak kadar yoğun bir şekilde etiketleneceği şekilde seçilmelidir. Fotoaktive edilebilir HaloTag ligandının konsantrasyonu ve fotoaktivasyon lazer gücü, protein molekülleri kaliteli tek parçacıklı yörüngeler oluşturmak için yeterince seyrek olarak etiketlenecek ve fotoaktive edilecek şekilde seçilmelidir, çünkü her çerçevede fazla lokalizasyon yanlış yörünge oluşumuna neden olacaktır. Temsili sonuçlarda gösterilen deneyler için, genellikle kare başına beşten az yerelleştirme vardı. Uyarma lazer gücü, hızlı foto ağartmayı en aza indirecek kadar düşük, ancak tek molekülleri tam olarak lokalize edecek kadar yüksek tutulmalıdır. Tek molekül lokalizasyonu ve izleme parametreleri, uyarmaların yoğunluğuna ve ilgilenilen proteinin beklenen difüzyon dinamiklerine bağlı olarak ayarlanmalıdır. Son olarak, değerleri <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;"> tdk aralığında hesaplanmalıdır (0 s'den başlayarak ve maruz kalma süresindeki artışlarla artarak). değerleri, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;"> tmin'lik bir eşiğin üzerinde birleşmelidir; bu tmin , adım 5.3'te kullanılmalıdır.
Burada özetlenen yöntem, kondensatlar içindeki proteinlerin etkileşim dinamiklerini geleneksel tekniklerin erişemeyeceği bir hassasiyetle ölçer. Ek olarak, minimum numune pertürbasyonu ile canlı hücrelerde bunu yapabilir. IDR'lerin kondens oluşumu da dahil olmak üzere etkileşim davranışları büyük ölçüde yerel ortamlarına bağlı olduğundan, bu kritik öneme sahiptir40.
Irgen-Gioro ve ark.40'tan elde edilen temsili sonuçlar, bu yöntemin kendi kendine bir araya gelen LLPS kondensatlarına bağlanan proteinler için kalma sürelerini çıkarma yeteneğini göstermektedir. Daha da önemlisi, bu yöntem, homotipik veya heterotipik etkileşimler yoluyla herhangi bir kondensata bağlanan herhangi bir proteine kolayca genişletilebilir. Ayrıca, LLPS'ye tabi tutulan proteinlerin etkileşim dinamiklerini ölçmekle sınırlı değildir. Ewing Sarkomuna neden olduğu bilinen füzyon onkoproteini EWS::FLI1'in, transkripsiyonel aktivasyonunda ve onkojenik dönüşüm fonksiyonlarında önemli bir rol oynayan lokal, yüksek konsantrasyonlu merkezler oluşturduğu gösterilmiştir 1,2. Bu merkezlerin oluşumu EWS::FLI1'in geçici, seçici ve çok değerlikli IDR-IDR etkileşimleri tarafından yönlendirilse de, şimdiye kadar bunların iyi niyetli LLPS kondensatları 1,2 olduğuna dair ikna edici bir kanıt yoktur. Buna rağmen, EWS::FLI1'in merkezlerinde ortalama kalma süresini ölçmek için burada sunulan yöntemi kullandık ve spesifik kalıntıların mutasyonunun ve IDR'sinin silinmesinin EWS::FLI1'in göbeklerinebağlanmasını önemli ölçüde istikrarsızlaştırdığını gösterdik 1.
Bu yöntemin kondensatlar içindeki proteinlerin bağlanma dinamiklerini karakterize etmedeki çok yönlülüğüne rağmen, belirli bağlamlarda protein bağlanması için model seçilirken dikkatli olunmalıdır. Mevcut biyokimyasal veriler, iki bileşenli bir üstel dağılımın genellikle birçok sistem için uygun bir model olduğu fikrini desteklemektedir 1,37,40,42, ancak aynı dağılımın, üç bileşenli üstel 47,48,49 ve güç yasası dağılımları50 gibi alternatif modellerin bulunduğu diğer sistemlerde protein bağlanmasının uygunsuz bir temsili olduğu da gösterilmiştir deneysel gözlemlerle daha iyi eşleşir. Yanlış sonuçlar çıkarmaktan kaçınmak için, bir modeli dikkatlice seçmeli ve motive etmeli, uyum kalitesinin modelin kullanımını desteklediğini doğrulamalı ve sonuçları makul bir şekilde yorumlamalıdır.

Giderek artan sayıda çalışma, biyomoleküler kondensatların hücresel organizasyonda ve çok sayıda hücresel fonksiyonda önemli bir rol oynadığını göstermektedir, örneğin, transkripsiyonel düzenleme 1,2,3,4,5, DNA hasar onarımı 6,7,8, kromatin organizasyonu 9,10,11,12, X-kromozomu inaktivasyon 13,14,15 ve hücre içi sinyal 16,17,18. Ek olarak, biyomoleküler kondensatların düzensizliği, kanserler 19,20,21 ve nörodejeneratif bozukluklar 22,23,24,25,26 dahil olmak üzere birçok hastalıkta rol oynar. Kondens oluşumu genellikle geçici, seçici ve çok değerlikli protein-protein, protein-nükleik asit veya nükleik asit-nükleik asit etkileşimleri tarafından yönlendirilir27. Belirli koşullar altında, bu etkileşimler, zarsız damlacıklardaki spesifik biyomolekülleri yerel olarak zenginleştiren bir yoğunluk geçişi olan sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) yol açabilir. Bu tür çok değerlikli etkileşimlere genellikle proteinlerin içsel olarak düzensiz bölgeleri (IDR'ler)aracılık eder 1,28,29. Bu etkileşimlerin moleküler düzeyde biyofiziksel karakterizasyonu, kondensatların bunlar arasındaki yaygınlığı göz önüne alındığında, çok sayıda sağlıklı ve anormal hücresel fonksiyonu anlamamız için kritik öneme sahiptir. Konfokal floresan mikroskobuna dayalı teknikler, örneğin fotoağartma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP)30,31,32, kondensatlar ve çevredeki hücresel ortam arasındaki moleküler değişimlerin dinamik olduğunu kalitatif olarak göstermek için yaygın olarak kullanılmış olsa da, kondensatlar içindeki spesifik biyomoleküllerin etkileşim dinamiklerini ölçmek genellikle geleneksel konfokal mikroskopi veya tek molekül kullanılarak mümkün değildir özel veri analizi yöntemleri olmadan mikroskopi. Bu protokolde açıklanan tek parçacık izleme (SPT) tekniği, canlı hücreli tek moleküllü mikroskopiye33 dayanır ve kondensatlar içindeki spesifik proteinler arasındaki etkileşim dinamiklerini ölçmek için benzersiz derecede güçlü bir araç sağlar. Bu tür bir ölçüm için SPT'nin okunması, ilgilenilen bir proteinin kondensatlarda ortalama kalma süresidir.
Protokol iki bölüme ayrılabilir - veri toplama ve veri analizi. Görüntüleme verilerinin toplanmasının ilk adımı, hücrelerde bir HaloTag34 ile kaynaşmış bir proteini ifade etmektir. Bu, ilgilenilen proteinin, protein moleküllerinin çoğunluğunun fotoaktif olmayan bir florofor (örneğin, JFX549 Halo ligand35) ile etiketleneceği ve bunların küçük bir kısmının spektral olarak farklı, fotoaktif bir florofor ile etiketleneceği iki florofor ile etiketlenmesini sağlar (örneğin, PA-JF646 Halo ligand36). Bu, hücredeki tüm kondensat konumlarının aynı anda elde edilmesine ve kondensatlara bağlanan ve bağlanmayan ilgilenilen proteinin tek moleküllü filmlerinin elde edilmesine izin verir. Bu arada, aynı tip hücreler, kromatin üzerinde büyük ölçüde hareketsiz olan bir histon olan Halo etiketli H2B'yi kararlı bir şekilde eksprese etmek için modifiye edilir. Hücreler daha sonra H2B'nin tek moleküllü görüntülenmesini sağlamak için PA-JF646 Halo ligandı ile boyanır. Aşağıda ayrıntılı olarak tartışılacağı gibi, bu deney, ilgilenilen proteinin etkileşim dinamiklerinin kesin olarak ölçülmesini sağlamak için foto ağartmanın katkısını açıklar. Görüntüleme deneyleri için hücreler daha sonra temiz lameller üzerinde kültürlenmeli, HaloTag ligand(lar)ı ile boyanmalı ve canlı hücre görüntüleme odasına monte edilmelidir. Oradan, numune, iki kanallı görüntüleme ve tek molekül algılama yeteneğine sahip bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu üzerinde oldukça eğimli ve lamine optik levha (HILO) aydınlatması altında görüntülenir. Emisyon daha sonra iki kameraya bölünür, biri kondensat konumlarını izler ve diğeri tek molekülleri izler. Edinim, serbestçe yayılan proteinleri bulanıklaştırmak ve yalnızca hücredeki kararlı yapılara bağlanma nedeniyle daha az hareketli olan proteinleri yakalamak için uzun bir entegrasyon süresiyle (yüzlerce ms mertebesinde) gerçekleştirilir37.
Veri analizinin ilk adımı, filmin her karesinde tek tek protein moleküllerini lokalize etmek ve lokalizasyonları tespit edilebilir ömrü boyunca her molekül için bir yörüngede birleştirmek için yerleşik bir tek parçacık izleme (SPT) algoritması38,39 kullanmaktır. Yörüngeler daha sonra, moleküllerin yörüngeleri boyunca lokalizasyonlarını, karşılık gelen zamanlarda tüm kondensatların lokalizasyonlarıyla karşılaştırarak, kondensatların içindeki molekülleri temsil edenler ve kondensatların dışındaki molekülleri temsil edenler olarak sıralanır1.
Daha sonra, tüm yoğuşma yörüngelerinin uzunlukları kullanılarak bir hayatta kalma eğrisi (1 - CDF) oluşturulur. Moleküllerin görünen ortalama kalış süresi daha sonra hayatta kalma eğrisinin aşağıdaki iki bileşenli üstel protein bağlanma modeline uydurulmasıyla çıkarılır,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
spesifik olarak bağlı olmayan moleküllerin fraksiyonu olarak A ile ve sırasıyla spesifik olarak bağlı olmayan ve spesifik olarak bağlı moleküllerin gözlenen ayrışma oranları olarak kobs,ns ve kobs,s ile. Buradan sonra sadece kobs,s dikkate alınır. Hem protein ayrışmasının dinamikleri, ktrue,s, hem de floroforun fotoağartılması, kpb, kobs,s
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
bu nedenle, protein ayrışmasının etkilerini izole etmek için, daha önce bahsedilen hücre hattındaki H2B-Halo'nun spesifik ayrışma hızı ölçülür.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B, kromatine kararlı bir şekilde entegre edilmiş ve tek moleküllü bir film ediniminin zaman ölçeğinde minimum ayrışma yaşayan bir proteindir37. Spesifik ayrışma hızı daha sonra PA-JF646 Halo ligandının fotoağartma hızına eşittir veya
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
İlgilenilen proteinin ortalama kondensat içinde kalma süresi, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, o zaman
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Irgen-Gioro ve ark.40'tan elde edilen temsili sonuçlar, bir oligomerizasyon alanının IDR'ye kaynaştırılmasının IDR'nin kondensatlarında daha uzun kalma sürelerine yol açtığını göstermek için bu protokolün uygulandığı gösterilmiştir. Bu sonuç, eklenen oligomerizasyon alanının, LLPS'yi yönlendiren IDR'nin homotipik etkileşimlerini stabilize ettiğini göstermektedir. Prensip olarak, herhangi bir kondensat oluşumuna katılan herhangi bir proteinin homotipik veya heterotipik etkileşimlerini karakterize etmek için hafifçe değiştirilmiş protokollerle aynı yöntem uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>0.1 ve mikro; m TetraSpeck mikroküre</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>Tek moleküllü görüntüleme</td></tr><tr><td>25 mm Çap, #1.5 Lameller</td><td>Marienfeld Superior</td><td>111650</td><td>Lamellerin hazırlanması</td></tr><tr><td>593/40 nm bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Tek moleküllü görüntüleme</td></tr><tr><td>676/37 nm bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-676/37-25</td><td>Tek moleküllü görüntüleme</td></tr><tr><td>6-Kuyulu TC Plate</td><td>Genesee</td><td>25-105MP</td><td>Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması</td></tr><tr><td>Hücre Hattı: U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi</td></tr><tr><td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m</td><td></td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi: Chong ve ark., 2018</td></tr><tr><td>Coverglass Boyama Rafı</td><td>Thomas</td><td>24957</td><td>Lamellerin hazırlanması</td></tr><tr><td>Döteryumlu Janelia Fluor 549 (JFX549)</td><td>Janelia Araştırma Kampüsü</td><td></td><td>Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması</td></tr><tr><td>DMEM, Düşük Glikoz</td><td>Gibco</td><td>10-567-022</td><td>Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi: Kullanılan büyüme ortamı: %5 fetal sığır serumu, %1 penstrep ile DMEM</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2-E Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme</td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Lab Alley</td><td>EAP200-1GAL</td><td>Lamellerin hazırlanması</td></tr><tr><td>evalSPT</td><td></td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi: Drosopoulos ve ark., 2020</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Cytiva</td><td>SH30396.03'te</td> mevcuttur <td>Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi: Kullanılan büyüme ortamı: %5 fetal sığır serumu, %1 penstrep</td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td> ile DMEM <td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi</td></tr><tr><td>Ikon Ultra CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>X-13723</td><td>Tek moleküllü görüntüleme</td></tr><tr><td>Uzun geçişli dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>Di02-R635-25x36</td><td>Tek moleküllü görüntüleme: Kırmızı/Uzak Kırmızı ışın ayırıcı</td></tr><tr><td>LUN-F Lazer Ünitesi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme: 405/488/561/640</td></tr><tr><td>MatTek cam tabanlı tabak</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması: 35 mm, hücre kültürü için #1.5 lamel kabı.</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme: Mikroskop toplama yazılımı</td></tr><tr><td>çekirdek ve küme mask_v2.txt</td><td></td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi: Chong ve ark., 2018</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15-140-122'de</td> mevcuttur <td>Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi: Kullanılan büyüme ortamı: %5 fetal sığır serumu içeren DMEM, %1 penstrep</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td>Hücrelerdeki proteinlerin</td></tr><tr><td>etiketlenmesi Fotoaktif Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td><td>Janelia Araştırma Kampüsü</td><td></td><td>Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması</td></tr><tr><td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td><td></td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi: Chong ve ark., 2018</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Mallinckrodt Kimyasalları</td><td>6984-06</td><td>Hazırlanması lameller</td></tr><tr><td>pretracking_comb.txt</td><td></td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi: Chong ve ark., 2018'de mevcuttur</td></tr><tr><td>SLIMfast</td><td></td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi: Teves ve ark., 2016'da mevcuttur</td></tr><tr><td>Sahne üstü inkübasyon sistemi</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme: Canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>TwinCam çift emisyonlu görüntü ayırıcı</td><td>Cairn Research</td><td></td><td>Tek moleküllü görüntüleme</td></tr><tr><td>Ultrasonik Temizleyici</td><td>Branson</td><td>5800</td><td>Lamellerin hazırlanması</td></tr></tbody></table>

biyomoleküler kondensatlarda protein etkileşim dinamiğinin tek moleküllü Ölçümü

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Sıvı-sıvı faz ayrımı (LLPS) yoluyla oluşan biyomoleküler kondensatlar, hücresel organizasyonda ve artan sayıda hücresel fonksiyonda kritik olarak kabul edilmiştir. Canlı hücrelerde LLPS'yi karakterize etmek de önemlidir, çünkü anormal yoğunlaşma, kanserler ve nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere çok sayıda hastalıkla ilişkilendirilmiştir. LLPS genellikle içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki seçici, geçici ve çok değerlikli etkileşimler tarafından yönlendirilir. LLPS'ye katılan proteinlerin etkileşim dinamikleri büyük ilgi çekicidir ve bunlar, bağlanma kalma sürelerinin (RT), yani kondensatlar içinde bağlı olarak geçirdikleri sürenin ölçümleriyle iyi bir şekilde özetlenmiştir. Burada, kondensatlar içindeki belirli bir proteinin ortalama RT'sini ölçmemizi sağlayan canlı hücreli tek moleküllü görüntülemeye dayalı bir yöntem sunuyoruz. Tek tek protein moleküllerini ve ilişkili oldukları kondensatları aynı anda görselleştiriyoruz, tek moleküllü yörüngeleri çizmek için tek parçacık izleme (SPT) kullanıyoruz ve ardından proteinin ortalama RT'sini çıkarmak için yörüngeleri bir protein damlacık bağlama modeline uyarlıyoruz. Son olarak, bu tek moleküllü görüntüleme yönteminin, bir oligomerleştirici alana kaynaştığında ve kaynaşmadığında LLPS kondensatlarındaki bir proteinin ortalama RT'lerini karşılaştırmak için uygulandığı temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol, LLPS'ye katılan herhangi bir proteinin etkileşim dinamiklerini ölçmek için geniş çapta uygulanabilir.

Burada, iki proteinin kendi kendine bir araya gelen LLPS kondensatlarındaki etkileşim dinamiklerini karşılaştırmak için bu SPT protokolünü kullandığımız Irgen-Gioro ve ark.40'tan temsili sonuçlar sunuyoruz. TAF15 (TATA-kutu bağlayıcı protein ilişkili faktör 15), insan hücrelerinde aşırı ekspresyon üzerine LLPS'ye maruz kalabilen bir IDR içerir. 24 alt birimli bir oligomer oluşturan TAF15 (IDR) ile FTH1 (ferritin ağır zincir 1) arasında kaynaştırmanın, LLPS'yi yönlendiren daha kararlı homotipik protein-protein etkileşimlerine yol açacağını varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, U2OS hücrelerinde Halo-TAF15 (IDR) veya TAF15 (IDR) -Halo-FTH1 füzyonunu geçici olarak eksprese ettik ve yukarıdaki protokolü izleyerek her proteinin iki renkli tek moleküllü görüntülemesini gerçekleştirdik. Bir TAF15(IDR)-Halo-FTH1 filminden temsili bir kare Şekil 1A'da gösterilmektedir. PA-JF646 kanalında tespit edilen moleküller lokalize edildi ve bu lokalizasyonlar yörüngeler halinde birleştirildi. Ortaya çıkan yörüngeler daha sonra, yoğuşma konumlarını vurgulayan ikili bir maske ile karşılaştırılarak yoğuşma suyu içi ve yoğuşma dışı popülasyonlar arasında sıralandı (Şekil 1B). İyi bir görünürlük için yörüngelerin sadece küçük bir kısmını göstersek de, kondensatlara bağlı ve kondensatların dışına bağlı moleküllerin yörüngeleri arasında açık bir ayrım vardır. Daha sonra, iki bileşenli üstel modele karşı yoğuşma içi yörünge uzunluklarının bir hayatta kalma eğrisi yerleştirildi (Şekil 1C). Son olarak, fotoağartma için düzeltmeden sonra ortalama kalış süreleri ekstrakte edildi ve her iki protein için çizildi (Şekil 1D). Halo-TAF15'in (IDR) LLPS kondensatlarında ortalama kalma süresinin 10.23 s ± 1.10 s olduğunu, TAF15 (IDR) -Halo-FTH1'in ise 64.15 s ± 11.65 s olduğunu bulduk. Bu sonuç, oligomerleştirici alanın TAF15'e (IDR) eklenmesinin gerçekten de protein-kondensat bağlanmasını stabilize ettiğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66169/66169fig01.jpg"> Şekil 1: SPT tabanlı yöntem, proteinlerin kondensatlarında kalma sürelerindeki farklılıkları çözer. Bir. TAF15(IDR)-Halo-FTH1'in iki renkli tek moleküllü filminden temsili kareler. Proteinler, kondensatların yerlerini görselleştirmek için daha yüksek konsantrasyonda fotoaktif olmayan boya (100 nM JFX549, sarı) ve daha düşük konsantrasyonda fotoaktif hale getirilebilir boya (20 nM PA-JF646, macenta) kombinasyonu ile etiketlendi. Aynı görüntüleme koşulları altındaki filmler Halo-TAF15 (IDR) için ve tek kanallı, PA-JF646 filmler H2B-Halo için alındı. Beyaz kesikli bir çizgi çekirdeği ana hatlarıyla belirtir. B. Yoğuşma konumu (gri) ve yörüngelerden (çok renkli) oluşan ikili bir maskeyi kaplayan temsili birleştirilmiş görüntü. C. İki bileşenli üstel modele sahip TAF15(IDR)-Halo-FTH1'in temsili hayatta kalma eğrisi. D. Halo-TAF15'in ortalama kalma süresi, ilgili kondensatlarında TAF15 (IDR) -Halo-FTH1'inkinden önemli ölçüde daha kısaydı. Her bir proteinin değeri, üç gün boyunca gerçekleştirilen bağımsız deneylerde ölçülen 20 hücreden ortalama alındı. Hata, ortalamanın standart hatası olarak yayıldı ve yıldız işareti, iki proteinin kalma süresinde önemli bir farkı temsil ediyor (p&lt;0.05, Wilcoxon sıra toplamı testi). Bu rakam Irgen-Gioro ve ark.40'ın izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66169/66169fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

single-molecule-measurement-protein-interaction-dynamics-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Bu protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini araştırmak için kütle fotometrisini yeni bir mikroakışkan sistemle birleştirir. Bu yaklaşım, düşük afiniteli ölçümleri mümkün kılan ve kütle fotometrisinin uygulanabilirliğini genişleten çözelti içindeki yüksek konsantrasyonlu komplekslerin hızlı bir şekilde seyreltilmesine dayanmaktadır.

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Burada, NMR metodolojileri için protokolleri sunuyoruz; bu protokoller, SEmi-katı Manyetizasyon Transferi (CONDENSE-MT) ile GÖRÜNMEZ Türlerin REstricted DIFfüzyonu (REDIFINE) ve SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT) ile CONdensate DEtectioN (CONdensate DEtectioN) için protokoller sunuyoruz; bu protokoller, biyomoleküler kondensatların iki fazlı koşullarda etiketsiz, nicel karakterizasyonunu mümkün kılarak moleküler bölünme, değişim dinamikleri, kondensata hidratasyonu ve damla...

Biyomoleküler yoğunlaşmaları iki fazlı koşullarda karakterize etmek için çözelti NMR kullanımı

Keşfedin tek moleküllü görüntüleme ile biyomoleküler kondensatlarda protein etkileşim dinamiğini. Bu yöntem, canlı insan hücrelerinde protein bağlanma sürelerini nicelendirerek transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Daha fazla video keşfet