Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Sanal laboratuvarda, deniz yumuşakçası Plegia californica'dan nöron hücreleri kültürü yapıyoruz. Bu nöronlar, büyüme konilerinin oldukça büyük olması nedeniyle, özellikle hücre iskeleti dinamiklerinin analiz edildiği büyüme konisi hareketliliği ve yönlendirmesinin yüksek çözünürlüklü çalışmaları için çok iyi bir model sistemi oluştururlar. Bu videoda, Plegia diseksiyonunun ve nöron hücre kültürü işleminin nasıl gerçekleştirileceğini gösteriyoruz.

Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Daniel Suter. Bugün sizlere glia hücreli nöronların diseksiyonu, kültürü ve görüntülenmesi prosedürünü göstereceğiz. Cerea hapia CAA'dan elde edilen nöronlar, öğrenme ve bellek çalışmaları için yaygın olarak kullanılmıştır.

Apia basit bir sinir sistemine ve elektrofizyoloji için uygun büyük nöronlara sahiptir. Laboratuvarımızda bu nöronları kullanmaktayız çünkü büyüme konileri büyüktür ve büyüme koni motilitesi ile yönlenmesiyle ilgili protein dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için oldukça uygundur. Tüm prosedür şu adımları içermektedir.

Birinci günde, abdominal ganglionları elde etmek için hayvan sakrifiye edilir ve diseke edilir. İkinci günde, kültür plakları hazırlanır. Sırt hücresi kümeleri diseke edilir ve münferit nöronlar plaklara ekilir.

Üçüncü günde, hücrelerin DIC diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi ile zaman ayarlı görüntülemesi için bir görüntüleme odası inşa edilmekte, yöntem gösterilmekte ve anlatılmaktadır. Bugünkü prosedür, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi iTune Lee tarafından gerçekleştirilecektir. Kendisi şimdi size arka beyin hücre nöronlarının nasıl hazırlanacağını gösterecektir.

Başlayalım. Arka hücre nöronları, plegia sinir sisteminin abdominal ganglionunun bir parçasıdır, bu nedenle enzimatik sindirim için abdominal ganglionun tamamını diseke edeceğiz. Daha sonra iki torba hücre kümesini ganglionun geri kalanından ayıracağız.

Bağ dokularını gevşetmek için abdominal ganglion, bu faz iki çözeltisi içerisinde 15 ila 16 saat boyunca sindirilecektir. Şimdi, hayvanı sakrifiye etmek için 0,5 molar magnezyum klorür ile doldurulmuş büyük bir 60 mililitrelik şırınga ile temiz diseksiyon araçlarını; bir pens diseksiyon, makas ve büyük makas hazırlamamız gerekiyor. Kaliforniya kıyılarından gelen, yaklaşık 150 gram ağırlığında olan wild plegia California car kullanıyoruz.

Hayvanları ıstakoz tankında en fazla üç ila dört hafta tutuyoruz. Magnezyum klorür çözeltisi, hayvanın baş bölgesine yakın bir noktadan vücut boşluğuna enjekte edilir. Hayvanın ovulması, çözeltinin yayılmasına yardımcı olur ve kasılmasını önler.

Hayvanı, şırınga iğneleri kullanarak baş ve kuyruk kısımlarından strafor bir levhaya sabitleyin. Vücut duvarı kasını bir pensle kaldırın ve vücut boşluğunu büyük bir makasla kesin. Ardından vücut duvarını yan taraftan baş kısmından kuyruk kısmına kadar kesin ve kası levhaya iğneleyin.

Ardından, fırça benzeri sarımsı bir organ olan yumurtalığın altında abdominal ganglion bulunmalıdır. Abdominal ganglion tespit edilebilir. Ganglionun ön ve arka tarafındaki sinirleri diseksiyon makasıyla keserek ganglionu ayırın.

Ardından ganglionu, bir mililitre yer değiştirme çözeltisi içeren bir deney tüpüne aktarın ve 22 °C'lik bir su banyosunda 15,5 saat bekletin. Bu inkübasyon sırasında, bağ dokusu arka hücre kümelerinin kolayca ayrılabileceği bir noktaya kadar gevşeyecektir. Arka hücre kültürüne başlamadan önce, nöronların kültüre edileceği lamel camları hazırlayacağız.

Sırt hücre nöronlarını, 35 milimetrelik Petri kapları içindeki laminin kaplı lameller üzerinde kültüre ediyoruz. Ardından hücreler, yüksek tuz içerikli bir kültür ortamı olan L 15 A SW ortamına daldırılır. Bu tip hücreler için, hayvan başına genellikle lamelli sekiz ila 10 Petri kabı hazırlıyoruz.

Şimdi torba hücre nöronlarının ekimi için kullanılan araçları inceleyelim. Torba hücre kümelerinin diseksiyonu için, L 15 A SW ile doldurulmuş lamine olmayan üç petri kabı, alkolle sterilize edilmiş ince pens ve makas ile bir P 20 pipete takılmış bükülmüş sarı uç gereklidir. Sarı uç, bir bunzen beki alevi üzerinden hızla geçirilerek yakılır ve pens kullanılarak bükülür.

Bükülme kısmını ezmemeye dikkat edin. Aksi takdirde, torba hücre kümesi daha sonra orada sıkışabilir. Plegia torba hücrelerinin diseksiyonu ve ekimi, oda sıcaklığında diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.

Şu an 15,5 saatlik enzim inkübasyonu sona ermiştir ve abdominal ganglionu disk alanından L 15 A SW ortamı içeren çalışma kaplarından birine aktarabiliriz. Bag hücrelerinin nasıl izole edildiğini göstermeden önce, şemaya göz atalım. Abdominal ganglionun nasıl diseke edildiğini görselleştirmek için, önce abdominal ganglionu merkezden kesiyoruz.

Bu çizgiden görebileceğiniz üzere, ardından arka kısmın ön ve arka tarafında iki kesik oluştururuz. Böylece burada gördüğünüz gibi bir küme oluşur.

Şimdi stereoskopla bakıldığında, abdominal ganglionun merkezinden kesildiği ve iki kesinin bag hücre kümesinin ön ve arka kısımlarına yapıldığı görülebilir. Ardından, bağ dokuda bir açıklık bulmak için pens kullanılır ve bag hücre kümesini çevreleyen bağ doku kılıfı nazikçe aşağı itilir. Diseksiyon makası kullanılarak, mümkünse bağ doku kümeden tek parça halinde çıkarılır.

Ancak kese hücre kümesine zarar vermemeye dikkat edin. Bükülmüş uçla alınan bir ortam ile kese hücre kümesini nazikçe başka bir çalışma kabına aktarın. Kümeden tekil kese hücrelerini ayırmak için kese hücre kümesini sarı uçla nazikçe dağıtın.

Bunu yapmak için, kümeyi pipet ucuna alın ve herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan dışarı itin. Canlı hücreleri kümeden, poly kaplı lameller içeren kaplara aktarın. Ölü hücreler merkezde siyah görünürken, canlı hücreler beyaz görünür.

Mikroskopi için hücrelerin lamelin merkezine yerleştirilmesi ve hücre kalıntılarının ve ölü hücrelerin mümkün olan en kısa sürede uzaklaştırılması önemlidir. İstenmeyen materyallerin toplanması veya üflenerek uzaklaştırılmasıyla, sağlıklı hücreler polilizin plakaya hızla tutunacaktır. Her lamel üzerine yaklaşık 15 ila 25 hücre yerleştirilmelidir.

İlk kümedeki tüm hücreler yerleştirildiğinde, ikinci kümenin bağ dokusu uzaklaştırılır ve aynı hücre ekim prosedürüne devam edilir. Tüm plakalar tamamlandıktan sonra, hücrelerin titreşimden uzak bir ortamda düzgün şekilde yapışabilmeleri için plakaları oda sıcaklığındaki tezgahta en az iki saat bekletin. Ardından, kapları strafor veya plastik bir tepsiye yerleştirip daha sonra kullanmak üzere 14 derece inkübatöre aktarın.

Plejia büyüme konilerini genellikle ekimden bir veya iki gün sonra görüntülüyoruz. Nöronal büyüme konisi dinamiklerinin zaman ayarlı görüntülemesi için, plastik ara parçalarla ayrılmış iki lamelden oluşan küçük bir görüntüleme odası hazırlıyoruz. Alt lamel üzerine nöronlar tutunmuş durumdadır.

Kolay ortam değişimi sağlamak amacıyla, üst lamı bir elmas kalemle daha kısa olacak şekilde kesilir. Daha sonra mikroskop tablasında, lam sandviçi mikroskoba monte edilmek üzere özel yapım bir tutucuya yerleştirilir. Ortam sızıntısını önleyerek hazne bileşenlerini bir arada tutmak için tabla yüksek vakum gresi kullanılır. Küçük bir şırınga yardımıyla üst örtü camına yüksek vakum gresi uygulanır, ardından pensler kullanılarak aralıklar konumlandırılır ve üzerine bir miktar vakum gresi sürülür.

Ardından tüm düzeneği kaldırıp ters çeviriyoruz ve hücrelerin hâlâ kabın içinde olduğu lam üzerine nazikçe bastırıyoruz. Lamları hizalamak ve üst lamı kırmadan aşağı doğru bastırmak için kulak çubukları kullanın. Sonra "sandviç" yapısını kaptan dikkatlice çıkarıyoruz, fazla besiyerini siliyoruz ve tutucunun tabanına yerleştiriyoruz.

Sandviçi, lamelleri baskıyla kırmadan tutucuya yerleştirin. Her iki lamelini de bir pamuklu çubuk yardımıyla sparkle cam temizleyici ile temizleyin; camda daha az iz bıraktığı için sparkle kullanmayı tercih ediyoruz. İz kalmasını önlemek için lamelini merkezden dışa doğru dairesel hareketlerle temizleyin ve hemen ardından kuru bir pamuklu çubukla üzerinden geçin.

Özellikle DIC optikleri ile çalışırken, yüksek kaliteli görüntüleme için kapak camının temiz olması çok önemlidir. Plegia arka hücre nöronal kültürleri düşük yoğunluklu kültürlerdir; bu nedenle, farklı hücreler arasında kolayca geçiş yapabilmek için mikroskobunuzun sahne konumlandırma fonksiyonlarına sahip olması çok faydalı olacaktır. Artık büyüme konisi morfolojisini ve motilitesini gözlemlemeye hazırız.

Büyümeyi, morfoloji ve hareketlilik açısından yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrastı, DIC zaman atlamalı görüntüleme ile görselleştiriyoruz. DIC görüntüleme, bu 60 X DIC zaman atlamalı filmde büyüme konisinin yapısının yüzey görünümünü sağladığı için bu uygulama için kullanışlıdır. Tipik bir büyüme konisinin üç alanı net bir şekilde görülebilir.

Periferik bölge; lamelipodial ve filopodial yapıların yoğun olduğu kısımdan oluşur. Geçiş bölgesi, kıvrımlanma (ruffling) aktivitesi ile karakterize edilir ve merkezi bölge ise ağırlıklı olarak mikrotübülleri ve organelleri içerir. Büyüme konisi yönlendirme mekanizmalarını incelemek amacıyla, bu çalışmada kısıtlanmış boncuk etkileşimi (RBI) analizini geliştirdik.

Hücresel hedef substratlarını taklit etmek için artesin proteinleri ile kaplanmış mikroboncuklar kullanılır. DIC zaman atımlı videoda, boncuk bir mikroiğne yardımıyla büyüme konisinin periferik alanına yerleştirilmiştir. Merkezi alanda retrograd hareket eden dalgalarla retrograd etki ve akış gözlemlenebilir.

Organeller mikrotübüller üzerinde hareket eder. Önemli bir değişikliğin gerçekleşmediği başlangıç süresinin ardından, merkezi alan sınırının kısıtlanmış boncuğa doğru ani bir ileri hareketi gözlemlenebilir. Önde gelen kenarın büyümesi ve gerilimin artışına ek olarak, özellikle boncuk etkileşim ekseni boyunca akış sönümlenmesi ve mikrotübül uzaması etkileri de görülebilir.

Büyüme konilerindeki hücre iskeleti dinamiklerini analiz etmek için floresan benekli mikroskopi kullanıyoruz. Nöronal hücre gövdesine floresan işaretli tübülin ve aktin probları mikroenjeksiyon ile enjekte ediyor ve zaman ayarlı videolar çekiyoruz. Hücre iskeletinin dinamik hareketlerinden, kırmızı ile gösterilen aktin, ön kenar boyunca birleşmekte, retrograd akışla geriye doğru taşınmakta ve geçiş bölgesinde geri dönüştürülmektedir.

Yeşil renkte gösterilen dinamik mikrotübüller, birleşim ve yer değiştirme davranışlarının kombinasyonuyla büyüme konisinin çevresini keşfetmiştir. Düşük miktardaki etiketleme, benekli bir desen oluşturarakle sitoskeletal dinamiğin çeşitli parametrelerini nicel olarak analiz etmemize olanak tanır. Nöronal büyüme konilerinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini yapmak isterseniz, size plesiyomorfik hücre diseksiyonunu, kültürünü ve görüntülemesini nasıl yapacağınızı göstermiş bulunmaktayız.

Büyüme konilerinin büyük boyutu, tanımlanmış sitoplazmik bölgeleri ve iyi tanımlanmış hücre iskeleti nedeniyle gerçekten kullanılması gereken sistem budur. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.