Name: Arabidopsis thaliana ve Brassica napusta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla tüylü kök dönüşümü ve rejenerasyon protokolünü. Bu yöntem, transgenik bitki genetiği araştırmalarında hızlı analiz olanağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jiří Macas'a (Biyoloji Merkezi CAS, České Budějovice, Çek Cumhuriyeti) agrobakteriyel suşu sağladığı için teşekkür ederiz. CEITEC MU'nun Çekirdek Tesis Bitki Bilimleri, teknik desteği için kabul edilmektedir. Bu çalışma, Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu-Projesi "SINGING PLANT" ile desteklenmiştir. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) ve INTER-COST projesi LTC20004.

Bitkilerde Agrobakteri Aracılı Tüylü Kök İndüksiyonu ve Rejenerasyonu

<ol><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li>
<li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation%3A+the+Biology+behind+the+%E2%80%9CGene-Jockeying%E2%80%9D+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li>
<li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+transformed+roots%3A+from+plant+disease+to+biotechnological+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures%E2%80%94a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+planta+hairy+root+transformation%3A+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044(2022).</li>
<li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+extension+of+the+opine+concept%3A+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li>
<li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzyigit%2C+II+%22Crop+improvement%22">Crop improvement</a>. , Springer. Boston, MA. (2013).</li>
<li>Jedličková, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR%2FCas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290(2022).</li>
<li>Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li>
<li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromeres+off+the+hook%3A+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li>
<li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22(2023).</li>
<li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+kale+%28Brassica+oleracea+var.+acephala%29%2C+rape+%28B.+napus%29+and+turnip+%28B.+campestris+var.+rapifera%29+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li>
<li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+%28Brassica+oleracea+and+B.+campestris%29+via+Ri-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler.

B. napus ve A. thaliana'da tüylü kök transformasyonu ve ardından rejenerasyon için basit bir protokol geliştirdik. Bu işlem, hipokotil (B. napus) veya birincil çiçeklenme sapında (A. thaliana) enjeksiyon bazlı tüylü kök indüksiyonunu içerir. Bu çalışmada sunulan Brassicaceae üyelerinin yanı sıra, hipokotilin bir Ri plazmidi taşıyan agrobakteriyel suşu C58C1 ile enjekte edilmesi yöntemi, Fabaceae familyasında10,11 de etkili olmuştur.
Enjeksiyon bazlı yönteme bir alternatif, eksplantın bir bakteri süspansiyonuna daldırılmasından ve ardından eksplantın agrobakterilerle birlikte yetiştirilmesinden oluşan daldırma bazlı dönüşümdür. Enjeksiyon bazlı yöntemin daldırma yöntemine göre avantajı, bazı protokol adımlarının yokluğundan tasarruf edilen zamandır: eksplant hazırlama, birlikte yetiştirme süresinin bir testi ve tüylü köklerin indüksiyonu için hormon içeren bir ortam üzerinde kültür. Her iki yaklaşım da tüylü kök indüksiyonu için etkili olmakla birlikte, enjeksiyon bazlı yöntemle bazı türlerde eksplant daldırmaya göre daha yüksek transformasyon etkinliği gözlenmiştir12,13. Ayrıca, enjeksiyona dayalı dönüşüm, kompozit bitkiler (transgenik tüylü kökler ve yabani tip sürgünler) üretmek için de yararlıdır. Dönüştürülen bitkinin orijinal kökleri kesildikten sonra, tüylü kökler bitki büyümesini destekler ve transgen tüm bitki bağlamında incelenebilir.
Tüylü kök indüksiyonunun kritik adımı, inokulumun hipokotil veya birincil çiçeklenme sapına enjekte edilmesidir. B. napus'un hipokotilleri kırılabilir ve tüm hipokotilin kesilmesi kolayca gerçekleşebilir. Aynısı, çiçeklenme sapı inceliği nedeniyle A. thaliana ile de gözlemlenebilir. Farklı türlerin/çeşitlerin dönüşüm verimliliğinin karşılaştırılması gerekiyorsa, bitkileri enjekte etmede manipülasyon ve becerinin neden olduğu hatayı önlemek için tüm deneyleri bir kişinin yapmasını öneririz.
B. napus DH12075 ve A. thaliana Col-0'da tüylü kök rejenerasyonu için etkili bir protokol geliştirdik. Rejenerasyon oldukça değişken bir süreç olduğundan, tercih edilen bir türe veya çeşide bazı protokol değişiklikleri uygulanabilir. Örneğin, tüylü kök kaynaklı sürgünler, B. oleracea14'te farklı bir oksin/sitokinin oranı (1:1) ile ortaya çıkarılabilir. Alternatif olarak, B. campestris tüylü köklerdeolduğu gibi BAP yerine sitokinin tidiazuron kullanılabilir 15.
Ri plazmid T-DNA'nın bitki genomuna çoklu eklenmesi, tüylü kök transformasyonu ve rejenerasyon sisteminin potansiyel bir sınırlamasını temsil eder. Bu gibi durumlarda, T1 fidelerinin segregasyon analizinden sonra Ri plazmidinden TL/TR içermeyen hiçbir bitki ortaya çıkarılmaz. Bu nedenle, her transgen için birkaç bağımsız tüylü kök hattı oluşturmanızı öneririz.
Tüylü kök kültürleri, hızlı kurulumları ve ucuz bakımları nedeniyle (yetiştirme ortamında hormon gerekmez) gen fonksiyonel çalışmaları için son derece güçlü bir araçtır. Bu protokol, B. napus ve A. thaliana'da tüylü kök indüksiyonu ve rejenerasyonu için yöntemleri kapsar ve bu, ilgilenilen transgeni doğrudan tüylü kök kültürlerinde, kompozit bitkiler kullanılarak tüm bitki bağlamında veya transgenik bitkilerin rejenerasyonundan sonra incelemek için kullanılabilir.

Bitki dönüşümü, bitki biyolojisindeki herhangi bir genetik çalışmanın darboğazıdır. Toprak kaynaklı bir bakteri olan Agrobacterium tumefaciens, transformantlar üretmek için çiçek daldırma veya doku kültürü yoluyla gen iletimi için bir araç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. A. tumefaciens, bir yaralama bölgesindeki bitkileri enfekte eder ve T-DNA'nın bir Tümör indükleyici (Ti) plazmidden konakçı bitki genomuna aktarılması ve entegrasyonu nedeniyle tümörlere neden olur. Yabani tip T-DNA içermeyen modifiye Ti plazmidli tasarlanmış A. tumefaciens suşları ve ilgilenilen bir geni eklemek için yapay T-DNA ve klonlama bölgelerine sahip bir ikili vektör, verimli bir bitki dönüşüm sistemi olarak yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, birçok model tür ve mahsul, çiçek daldırmasına veya in vitro bitki rejenerasyonuna karşı inatçıdır veya bu dönüşüm sisteminin verimliliğini etkileyen uzun büyüme döngülerine sahiptir.
Agrobacterium rhizogenes, bir konakçı bitkiyi enfekte ettikten sonra yaralama bölgesinde maceracı köklerin veya tüylü köklerin oluşumunu indükler. A. tumefaciens'e benzer şekilde, A. rhizogenes, bir T-DNA'sını Kök indükleyici (Ri) bir plazmitten konakçı bitki genomuna aktararak transgenik tüylü köklerin gelişmesine neden olur. Bu süreç esas olarak kök onkojenik lokus (rol) genleri 2,3 tarafından kontrol edilir. Hem Ri plazmidini hem de ilgilenilen bir geni kodlayan yapay bir ikili vektörü taşıyan agrobakteriyel suşlar kullanılarak, rekombinant proteinler üretmek, promotörlerin veya genlerin işlevini analiz etmek veya Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR'ler)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9)4,5,6.
Protokolümüz, Ri plazmidi pRiA4b7'yi taşıyan transkonjugan Ti-less A. tumefaciens C58C1 suşunu kullanır. Ri plazmidinin T-DNA'sı, bitki genomuna bağımsız olarak entegre olabilen sağ ve sol T-DNA (SIRASIYLA TR-DNA ve TL-DNA) olmak üzere iki bölgeden oluşur8. Bu sistemden yararlanılarak, Brassica napus DH12075 çeşidindeki uzun eksplant dönüşüm süreci optimize edildi9. Aşağıda ayrıntıları verilen protokol, seçilen tüylü kök hatlarının yenilenmesine ve ilgilenilen transgeni taşıyan ve rol genlerinden arınmış T1 bitkilerinin yaklaşık 1 yıl içinde elde edilmesine izin verir. Enjeksiyon bazlı tüylü kök dönüşümü, Arabidopsis thaliana Col-0'ın dönüştürülmesiyle gösterildiği gibi diğer Brassicaceae türlerinde kullanılabilir. Hipokotil, B. napus'u dönüştürmek için kullanılırken, A. thaliana birincil çiçeklenme gövdesine enjekte edilir.

<table><tbody><tr><td>1.50 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>125.215</td><td></td></tr><tr><td>%10 ticari ağartıcı çözeltisi&nbsp;</td><td>SAVO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-naftalinasetik asit (NAA)&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td>Nasır rejenerasyon ortamı</td></tr><tr><td>2.0 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>108.132/108.078</td><td></td></tr><tr><td>3M mikro gözenekli bant</td><td>Mikro gözenekli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurin (BAP)&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>B0904</td><td>Nasır rejenerasyon ortamı, Sürgün uzama ortamı&nbsp;</td></tr><tr><td>% 70 etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bakteriyolojik agar</td><td>HiMedia</td><td>RM201</td><td>LB ortamı</td></tr><tr><td>Bakteriyolojik pepton</td><td>Oksoit</td><td>LP0037</td><td>LB ve YEB ortamı</td></tr><tr><td>Sığır özü</td><td>Roth</td><td>X975.1</td><td>YEB orta</td></tr><tr><td>Şişeler</td><td>DURAN</td><td>L300025</td><td></td></tr><tr><td>Sefotaksim sodyum</td><td>Duchefa</td><td>C0111</td><td>Tüylü kök büyütme ortamı, Nasır rejenerasyon ortamı, Sürgün uzama ortamı, Kök indüksiyon ortamı</td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Serva</td><td>3955301</td><td></td></tr><tr><td>CTAB Hekzadesiltrimetilamonyum bromür</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraasetik Asit, Disodyum Tuzu, Dihidrat</td><td>Sigma</td><td>ES134-250G</td><td></td></tr><tr><td>elctroporation küvet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elektroforez agar, peqGOLD evrensel</td><td>VWR</td><td>732-2789</td><td></td></tr><tr><td>elektroforez odası</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>elektroforez jel okuyucu</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>elektroporatör GenePulser Xcell</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etidyum bromür</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser elektroporasyon küvetleri, 0,2 cm boşluk</td><td>BIO-RAD</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gen Cetveli DNA merdiven karışımı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>Gibberellic asit (GA3)</td><td>Duchefa</td><td>G0907</td><td>Sürgün uzama ortamı&nbsp;</td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (2- (4- (2-hidroksietil) -1-pirerazinil) -ethansulfonique</td><td>Merck</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>indol-3-bütirik asit (IBA)</td> <td>Duchefa</td><td>I0902</td><td>Kök indüksiyon ortamı</td></tr><tr><td>kanamisin monosülfat</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Macenta GA-7 Kapaklı Bitki Kültürü Kutusu</td><td>Bitki Ortamı</td><td>V8505-100</td><td></td></tr><tr><td>Ölçüm silindiri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohidrat</td><td>Duchefa</td><td>M1503</td><td>Tüylü kök yetiştirme ortamı, Nasır rejenerasyon ortamı, Sürgün uzama ortamı, Kök indüksiyon ortamı, Çimlenme ortamı, Bitki yetiştirme ortamı</td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog ortamı (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0237</td><td>Çimlenme ortamı, Bitki yetiştirme ortamı</td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog ortamı (MS) + B5 vitaminleri&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>M0231</td><td>Tüylü kök yetiştirme ortamı, Nasır rejenerasyon ortamı, Sürgün uzama ortamı, Kök indüksiyon ortamı</td></tr><tr><td>iğnesi Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td>Nasır rejenerasyon ortamı, Kök indüksiyon ortamı, Çimlenme ortamı</td></tr><tr><td>PVP 40 (polivinilpirolidon Mr 40000)</td> <td>Sigma</td><td>9003-39-8</td><td></td></tr><tr><td>Redtaq DNA Polimeraz, İnert boya ile rutin PCR için Taq, 10X tampon dahil</td><td>Sigma</td><td>D4309-250UN</td><td></td></tr><tr><td>Retsh değirmeni</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Lachner</td><td>30093-APO</td><td>LB orta</td></tr><tr><td>kare Petri Kapları</td><td>Corning</td><td>GOSSBP124-05</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Penta</td><td>24970-31000</td><td>Tüylü kök yetiştirme ortamı, Nasır rejenerasyon ortamı, Sürgün uzama ortamı, Kök indüksiyon ortamı, Çimlenme ortamı, Bitki yetiştirme ortamı</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Carl Roth</td><td>P666.1</td><td>Rotylabo şırınga filtreleri 0.22 ve mikro; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td></td><td>termomikser Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ticarcillin disodyum</td><td>Duchefa</td><td>T0180</td><td>Tüylü kök yetiştirme ortamı</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Serva</td><td>3719003</td><td></td></tr><tr><td>ultra saf su</td><td>Millipore Milli-Q arıtılmış su&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Duchefa</td><td>Y1333</td><td>LB orta</td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana ve brassica napus'ta tüylü kök dönüşümü ve rejenerasyonu

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Tüylü kök dönüşümü, çeşitli türlerde bitki biyoteknolojisi için çok yönlü bir araçtır. Kök indükleyici (Ri) plazmid taşıyan bir Agrobacterium suşu tarafından enfeksiyon, T-DNA'nın Ri plazmidinden bitki genomuna aktarılmasından sonra yaralama bölgesinde tüylü köklerin oluşumunu indükler. Protokol, Brassica napus DH12075 ve Arabidopsis thaliana Col-0'da enjeksiyon bazlı tüylü kök indüksiyonunun prosedürünü ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Tüylü kökler, ilgilenilen bir transgeni analiz etmek için kullanılabilir veya transgenik bitkilerin üretimi için işlenebilir. Sitokinin 6-benzilaminopurin (5 mg/L) ve oksin 1-naftalinasetik asit (8 mg/L) içeren rejenerasyon ortamı, her iki türde de başarılı bir şekilde sürgün oluşumunu ortaya çıkarır. Protokol, ilgilenilen bir transgen taşıyan ve Ri plazmidinden T-DNA içermeyen bitkiler elde etmek için rejenerantların ve T1 bitkilerinin genotiplenmesini ve seçimini kapsar. Kompozit bir tesisin oluşumuna yol açan alternatif bir süreç de tasvir edilmiştir. Bu durumda, tüylü kökler sürgünde tutulur (doğal kökler yerine), bu da tüylü kök kültürlerinde bir transgenin tüm bitki bağlamında incelenmesini sağlar.

Daha önce Brassica napus'un üç çeşidinde, yani DH12075, Topas DH4079 ve Westar9'da enjeksiyon bazlı tüylü kök indüksiyonu için bir protokolü optimize etmiştik. Bu dönüşüm protokolünü model tür A. thaliana'ya uygulamak için, 1 aylık bitkiciklerin birincil çiçeklenme saplarına bir agrobakteriyel aşı enjekte edildi. Saçlı kökler 2-4 hafta sonra enjeksiyon bölgesinde ortaya çıktı. Tüylü kökler eksize edildi ve katı ortamda eksize edildi. Yöntemin bu iki türdeki karşılaştırması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Seçilen tüylü kök hatları, sürgün oluşumunu indüklemek için rejenerasyon ortamına aktarıldı. A. thaliana'da, test edilen 10 tüylü kök hattının hepsinde 14 gün içinde sarı calli indüklendi. Rejenerasyon ortamına aktarıldıktan sonraki 3 hafta içinde koyu yeşil lekeler olarak görülebilen ilk sürgün primordia ortaya çıkmıştır (Şekil 2). 4 haftalık kültürden sonra, sürgünler 10 tüylü kök hattının 9'unda (% 90 rejenerasyon verimi) tüylü kökleri kapladı. Bazı durumlarda, nasırdan adventif kökler ortaya çıkmıştır (Şekil 2H). Rejenerasyon besiyerinde 3 ay geçmesine rağmen bir hat yenilenmedi (her 4 haftada bir tüylü kökler taze bir besiyerine aktarıldı). Bu nedenle, A. thaliana tüylü köklerin rejenerasyon etkinliği, B. napus DH120759'un etkinliğine benzer.
B. napus ve A. thaliana'nın tüylü kök rejenerantları, tüylü kök kaynaklı bitkilerin tipik bir özelliği olan bir cüce fenotipi sergiler (Şekil 3)2. Ayrıca yoğun kök sistemleri, buruşuk yapraklar ve çiçeklenme zamanındaki değişiklikleri gözlemledik. Bu sözde tüylü kök (veya Ri) fenotipi, bitki genomuna eklenen Ri plazmidinden gelen rol genlerinden kaynaklanır. Ri T-DNA'nın ve bir ikili vektör üzerinde kodlanan transgenin eklenmesi bağımsız veya bağlantılı olabilir. Bu nedenle, kendi kendine tozlaşma ile oluşturulan T1 dölünün bir ayrışma analizi, ilgilenilen transgeni ifade eden rolsüz bitkilerin belirlenmesine yardımcı olur. T1 bitkilerinin genotiplemesi, TL ve TR'nin ORF'lerine ve ilgilenilen transgene özgü PCR primerleri ile gerçekleştirilir. Agrobakteriyel kontaminasyonun yokluğu, virC primerlerinin PCR ürünlerinin yokluğu ile doğrulanır (Şekil 1).
<img alt="Transformasyon diyagramı, PCR, tüylü kök indüksiyonu, T1 bitki genotiplemesi, fonksiyonel transgen analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: A. thaliana ve B. napus'taki prosedürün özeti. Agrobacterium inokulumunun hipokotil veya birincil çiçeklenme gövdesine enjeksiyonu, tüylü köklerin gelişimini indükler. Tüylü kökler, genotiplenecek ve analiz edilecek kompozit bir bitki oluşturmak için doğal köklerin yerini alabilir (mavi oklar). Kültürlenmiş tüylü kökler T0 bitkilerine dönüştürülebilir, T1 bitkilerinde çoğaltılabilir ve genotiplenebilir (yeşil oklar). Tüylü kökler ayrıca fonksiyonel analiz için alt kültüre alınabilir (siyah ok). Genotipleme sonuçlarına örnekler sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Bitki doku kültürü büyüme aşamaları; Morfolojik değişiklikleri gösteren dört hafta boyunca mikroskop görüntüleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: A. thaliana'da tüylü köklerin yenilenmesi. (A) Tüylü kök kültürü plakalara aktarıldıktan 1 gün sonra. (B, C) Çallı, rejenerasyon ortamında kültürden 2 hafta sonra gelişti. (D, E) Shoot primordia 3 haftalık kültürden sonra ortaya çıktı. (G, H) Sürgünler 4 hafta sonra oluşur. (H) Nasırdan gelişen maceracı kökler. (C, F, I) Yenileyici olmayan tüylü kök çizgisi. Ölçek çubukları 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">cm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Arabidopsis ve Brassica napus rejenerasyon karşılaştırması; yabani tip ve tüylü kök türevli bitkiler." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: B. napus ve A. thaliana yabani tip bitkilerin ve tüylü kök kaynaklı rejenerantların (T0 bitkileri) temsili fotoğrafları. Rejenerantların Ri fenotipine dikkat edin. Ölçek çubukları 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">cm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Protokol , Arabidopsis birincil çiçeklenme sapları ve Brassica napus hipokotilleri kullanılarak tüylü kök indüksiyonunu açıklar. Tüylü kökler kültürlenebilir ve transgenik bitkileri yenilemek için eksplant olarak kullanılabilir.

Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Araştırmamız, Brassicaceae'de verimli bir dönüşüm için bir protokol geliştirmeyi amaçladı. Saç kökü bazlı bir dönüşüm kullanarak, araştırmamız için çok önemli olan Brassica napus'ta dönüşüm verimliliğini önemli ölçüde iyileştirdik. Protokolü model türlerde de test ettik Arabidopsis thaliana.Brassica napus'ta DH12075 bahar çeşitleri için protokolü optimize ettik. Bir sonraki zorluk, Brassica napus'un yanı sıra Brassica rapa ve Brassica oleracea'daki kış çeşitlerinin dönüşüm ve yenilenme protokolünü optimize etmektir. Tüylü kökler kolayca çoğaltılabilir ve hızlı büyümeleri, dönüşümden kısa bir süre sonra ilgilenilen genin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar.Sonuç olarak, istenen özelliği sergileyen belirli tüylü kök çizgilerini seçici olarak yenilemek mümkün hale gelir. Örneğin, CRISPR-Cas tarafından tanıtılan bir gen mutasyonu.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Agrobacterium aracılı dönüşümü daldırma çiçek yöntemini kullanarak başarılı bir şekilde Schrenkiella parvulaextremophyte modelinin kararlı transgenik satırları oluşturmak için istihdam edilebilir. Biz bundan farklı büyüme alışkanlıkları ve extremophyte fizyolojik özellikleri dikkate alınarak Arabidopsis thalianaiçin değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Biz Agrobacterium rhizogenestarafından kıllı kökleri indükleyen bir yöntem tarif -Tartary karabuğday aracılı dönüşüm (Fagopyrum tataricum). Bu gen fonksiyonları ve Tartary karabuğday ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için kullanılabilir, herhangi bir genetik dönüşüm için kabul edilebilir, ya da iyileştirme den sonra diğer tıbbi bitkiler için kullanılır.

Agrobacterium rhizogenestarafından Kıllı Kökleri Indükleyen -Tartary Karabuğday Aracılı Dönüşüm (Fagopyrum tataricum)

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Burada, kompozit bitkiler üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği tek adımlı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz.

Agrobacterium rhizogenes Bazlı Tüylü Kök Dönüşümü ile Kompozit Bitkilerin Üretilmesi İçin Verimli ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem

Agrobakteriya aracılı bir Brassicaceae türü olan Rorippa aquatica'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için, kaynak yoğun steril doku kültürü prosedürleri olmadan verimli ve optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Görsel dönüşüm işaretleyicisi ve sürgün yenileme boru hattı kullanılarak yakın klonal transformantlar başarıyla üretildi ve böylece bitkinin su altı ortamına uyum sağlama çalışmalarını ilerletti.

Eşeysiz Amfibi Brassicaceae Türü, Rorippa aquatica'nın Verimli Rejenerasyon Temelli Agrobakteriya Aracılı Dönüşümü

Bu video 14 günlük fide Arabidopsis dokuları bozulmadan protoplast izole etmek için bir prosedür gösterir. Izole protoplast en az 96h bozulmadan kalır ve bir aylık olgun bitkilerin yerine fide izole olduğunu göz önüne alındığında, bu yordamı sağlam protoplast gerektiren testleri hızlandırır.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Bu makale, çiçek-daldırma yöntemi göstermektedir.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

Polar lipid özler bireysel glycerolipids Kompozisyon ve yağ asidi kompozisyonu basit ve sağlam bir lipid profil deneyde belirlenir. Bu amaçla, glycerolipids ince tabaka kromatografisi ile izole edilir ve onların açil grupları transmethylation tabi. Yağ açil methylesters gaz-sıvı kromatografisi ile sayısallaştırılmış.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Öğrenin, Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla tüylü kök dönüşümü ve rejenerasyon protokolünü. Bu yöntem, transgenik bitki genetiği araştırmalarında hızlı analiz olanağı sağlar.

Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu

Daha fazla video keşfet