Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Muller hücreleri, retinanın başlıca glial hücreleridir. Retinanın metabolik olarak yüksek derecede aktif nöronlarını korumak için çok önemli bir rol oynarlar. Laboratuvarımız, Muller hücrelerini fare gözlerinden izole etmek için bir teknik oluşturdu. Bu teknik, Müller hücrelerinin farklı retina hastalıklarındaki rolünün incelenmesini, hastalıkların patogenezinin anlaşılmasını ve ayrıca terapötik hedeflerin geliştirilmesini sağlayacaktır.

[Ekran Okuyucusu] Fareyi kurumunuzun onayladığı yöntemlere göre etik olarak ötenazi yapın. Proprozuzu indüklemek için orbital alana 5/45 tarzı bir cımbız bastırarak gözleri enüklee edin, ardından cımbızın kollarını gözün arkasına yerleştirerek gözü çıkarın, ardından orbital alandan hafifçe çekin. Gözleri 10 mL'lik Muller hücre göz solüsyonuna yerleştirin ve gece boyunca veya oda sıcaklığında yaklaşık 18 saat bekletin. 18 saat sonra, göz solüsyonunu atılacak tüpten dökerek boşaltın. Gözleri ısıtılmış fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın. PBS'yi atılacak tüpten dökerek tekrar boşaltın. Daha sonra gözleri 10 mL tripsin çözeltisi içeren 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Çanağı bir kuluçka makinesine yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 1,5 ila 2 saat inkübe edin. İnkübe ettikten sonra, gözleri kabaca beş mL tam primer Muller hücre büyüme ortamı içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Daha iyi görünürlük ve net gösterim için videonun kaputun dışında kaydedildiğini belirtmekte fayda var. Gerçek deneyler için, gösterildiği gibi bir laminer akış başlığında yapılmalıdır. Gözleri diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın. Bağ dokusunu, göz dışı kasları ve optik siniri çıkarmak için M5S tarzı cımbız ve Vannas makası kullanın. Burada optik sinir Vannas makası ile kesilir. M5S tarzı cımbızla gözü kavrayın ve Vannas makas veya şırınga iğnesi ile ora serrata bölümünde bir kesi yapın. Kesiği iki M5S tarzı cımbızla kavrayın ve korneayı gözün arka kısmından çekmeye veya yırtmaya başlayın. Retinanın bütünlüğünün bozulmadan kalmasını sağlamak için küçük artışlarla çekin. İşte korneanın göz kabının arka kısmından nasıl çıkarılacağına dair bir gösteri. Lens ve nöral retina açığa çıktıktan sonra, muhtemelen irisin yapışmış olduğu gözün pigmentli tabakasını çıkarın. Ardından nöral retinayı lensten çıkarın. İzolasyonun saflığını arttırmak için nöral retinadan herhangi bir pigmentli dokuyu çıkarın. Nöral retinanın yapışkan doğası göz önüne alındığında, tüm pigmentli dokuyu çıkarmanız pek olası olmayacaktır. Tüm nöral retinaları toplayın ve daha küçük parçalara ayırın. Nöral retinaları, dört mL tam primer Muller hücre büyüme ortamı içeren bir T25 şişesinde plakalayın. Son olarak, şişeyi bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Panel A, pasaj sıfır ve pasaj bir'de sağlıklı bir Muller hücre kültürünü gösterir. Pigment eksikliği, izolasyondaki birincil kontamine olan RPE hücrelerinin yokluğunu gösterir. Bu, panel B'de RP'ye özgü bir işaretleyici olan RP65 ile güçlendirilmiştir.