Name: Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Keşfedin farelerde viral izleme öncesi stereotaksik enjeksiyon koordinatlarını kriyoseksiyonla hızlı doğrulama yöntemini. Bu protokol, boya kullanarak doğrulama süresini kısaltır ve sinir devre araştırmalarında verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (XY Sun'a 82101249 NO'lu hibe), Çin Doktora Sonrası Araştırma Vakfı (XY Sun'a hibe NO. 2022M722125). Şangay Yelken Programı (SH Chen'e hibe NO. 21YF1425100). Şanghay Belediye Sağlık Komisyonu Klinik Araştırma Özel Projesi (J Zhou'ya 202340088 numaralı hibe). Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (X Zhang'a 82101262 NO'lu hibe, SH Chen'e 82101287 NO'lu hibe).

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Araştırmaları Raporlama İn Vivo Deneyleri (ARRIVE) kılavuzlarına ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma, Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Renji Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için sekiz haftalık C57BL / 6J erkek fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart kafeslerde (22 °C ± 2 °C, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, yiyecek ve su ad libitum) barındırıldı.
1. Hedef beyin bölgelerinin seçimi
NOT: Bu steril bir işlemdir. Tüm cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden emin olun. Cerrahi aletlerle temas etmeden önce eldivenlere alkol püskürtün. Aletlerin ucuna veya cerrahi bölgeye eldivenle dokunmaktan kaçının. Prosedüre başlamadan önce, doğru reflekslerin kaybını ve kutanöz stimülasyona yanıt verilmemesini kontrol ederek farenin yeterince uyuşturulduğundan emin olun. Delme ve enjeksiyondan önce, solunum hızını (dakikada 60-220 nefes, dakikada ortalama 100-150 nefes) ve solunum genliğini (tutarlı olmalı ve aşırı sığ veya derin olmamalıdır) yakından izleyin. Solunum hızı veya genliğindeki herhangi bir önemli değişiklik not edilmelidir.
<ol><li>Fareyi 29 G'lik bir iğne kullanarak% 1.25 tribromoetanol (250 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Doğrultma refleksi ortadan kalktığında kafatasındaki kılları tıraş edin. Üst kesici dişleri bir burun kelepçesi ile sabitleyerek ve iki kulak çubuğu kullanarak başı sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürün. Saç derisini Anerdian (dezenfektan solüsyonu; Malzeme Tablosuna bakınız) ile üç kez sürünerek dezenfekte edin. Lokal analjezi sağlamak için 29 G insülin iğnesi kullanarak deri altına 0.2 mL% 1 lidokain enjekte edin.</li>
	<li>Kafatasını ortaya çıkarmak için göz makası kullanarak 0,5 cm'lik bir kesi yapın. Periosteumu çıkarmak için açıkta kalan kafatasını ovalamak için% 3 H2O2 ile batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Kafatasının kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Matkabı stereotaksik alete takın. Bir büyüteç yardımıyla matkap ucunu tam olarak bregma'ya konumlandırmak için stereotaksik kolların düğmelerini ayarlayın ve LCD dijital ekranı kullanarak z ekseni değerini kaydedin.<ol><li>Düğmeleri ayarlayın ve matkap ucunu lambdaya yerleştirin ve z ekseninin değerini kaydedin. Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını iki z değerini daha yakın hale getirecek şekilde ayarlayın ve iki z değeri arasındaki fark 0,1 mm'den az olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın. NOT: LCD dijital ekrandaki x, y ve z eksenleri sırasıyla mediolateral (ML), anteroposterior (AP) ve dorsoventral (DV) eksenlere karşılık gelir. İki z değeri arasındaki fark 0,1 mm'den az olduğunda, bregma ve lambda'nın aynı yatay düzlemde olduğu düşünülebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Beynin sol-sağ düzlüğünden emin olun. Stereotaksik çerçeveye bağlı kulak çubuklarını aynı ölçekte ayarlayın. Örneğin laterodorsal tegmental çekirdeği, ventral kısmı (LDTgV) ele alalım; Paxinos ve Franklin'in fare beyin atlası16'ya göre stereotaksik koordinatları x için -5.2, y için +0.8, z için -4.0'dır.<ol><li>Dorsal-ventral yönde z değerini ölçmek için matkabı (-5.2, +0.8) yapmak için kulak çubuğunu ayarlayın ve z değerini ölçmek için matkabı (-5.2, -0.8) konumuna getirin. NOT: İki z değeri arasındaki fark 0,2 mm'den az olduğunda sol-sağ eşit seviyede kabul edilir. Dış kulak içi kulak eti simetrik olduğu için kulak bantlarının doğru yere yerleştirilmesi gerekir. İki z değeri arasındaki fark 0,5 mm'den fazlaysa, kulak çubuğu yanlış yere takılmış olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Matkabı tekrar bregma'ya yerleştirin ve LCD dijital ekrandaki üç koordinatı sıfıra ayarlayın. Referans koordinatlarını kullanarak matkabı ilgilenilen bölgenin üzerine yerleştirin. Matkabı başlatın.<ol><li>Dikey kolu kullanarak matkabı kafatasına nüfuz edene kadar kademeli olarak indirin. Pamuklu çubuklar kullanarak kalıntıları ve kanı temizleyin. NOT: Beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Boya çözeltisinin hazırlanması ve beyin mikroenjeksiyonu
<ol><li>Bromofenol mavisi içeren 25 μL SDS-PAGE yükleme tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Boya çözeltisini hazırlamak için tüpe 50 μL ddH2O ekleyin.</li>
	<li>Kafatası penceresini tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuklu bir bezle örtün. Salini tekrar tekrar aspire ederek ve dışarı atarak mikroşırınga açıklığını sağlayın. Mikro şırıngaya 0,3 μL boya yükleyin. Şırıngayı ve motorlu stereotaksik mikroenjektörü stereotaksik kola takın.</li>
	<li>Şırınga ucunu bregma'ya yerleştirin ve LCD dijital ekranda koordinatları sıfıra ayarlayın. İğneyi referans koordinatlarına göre ilgilenilen bölgeye göre ayarlayın. Enjeksiyon hızını 0,1 μL/dk'ya ayarlayın ve motorlu mikroenjektörü çalıştırarak hedef bölgeye 0,3 μL mavi boya verin. Enjektörü yavaşça çekmeden önce şırıngayı en az 10 dakika yerinde bırakın. NOT: Yakın konumdaki bölgeleri ayırt etmek için aynı farelerde farklı renk boyalar kullanılabilir. Diğer boyaları fiziksel özelliklerine göre uygun konsantrasyonlar için test edin. Tıkanmaları önlemek için bromofenol mavisi formülünün kullanılması ve kullanımdan önce ve sonra şırınganın iyice durulanması önerilir. Enjeksiyon hacimlerini boya difüzyonuna göre ayarlayın.</li>
</ol>3. Beyin dokusu hasadı ve kriyoseksiyon
<ol><li>Fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın. Fareyi 29 G'lik bir iğne kullanarak 50 mg / kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Fareyi bantlı bir köpük tahtaya sabitleyin.</li>
	<li>Hızlı boğulmaya neden olmak için toraksın her iki tarafını da açın. Sağ atriyal apendikste 1-2 mm'lik bir kesi yapın. Sol ventriküle bir infüzyon iğnesi yerleştirin. 20 mL önceden soğutulmuş salin ve 20 mL buzlu% 4 paraformaldehit çözeltisi demleyin.</li>
	<li>Fareyi doku diseksiyon makasıyla dekapitasyon yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Boyundan buruna kadar orta hat boyunca bir kesi yaparak cildi çıkarın ve ardından kafatasını ortaya çıkarın. Forseps veya makasla kafatasındaki artık kasları temizleyin.</li>
	<li>İnce makasın bir bıçağının ucunu, foramen magnum ile beyin arasına, keskin kenarı kemiğe bakacak şekilde, orta sagital sütürün rostral ucuna yerleştirin. Kafatasını orta sagital sütür boyunca kaydırmaya ve kesmeye devam edin. Kafatasını çıkarmak için forseps kullanın ve açıkta kalan beyni ortaya çıkarın. NOT: Operasyon sırasında beyne herhangi bir zarar vermemek için dikkatli olun. Kemik parçalarını çıkarmadan önce, kafatasına yapışmış olabilecek meninksleri dikkatlice soyun. Bu önlem, işlem sırasında beyin dokusunun yanlışlıkla kesilmesini önlemek için çok önemlidir.</li>
	<li>Döner mikrotom kriyostatının gücünü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığını -20 °C'ye ayarlayın. Numune diskinin yüzeyini eşit şekilde kaplamak için biraz OCT bileşiği dökün. Kriyo odasına yerleştirin ve OCT'nin katılaşmasına izin verin.</li>
	<li>Diski numune kafasına takın. Bıçağı bloğa yaklaştırın ve diske paralel düz bir düzlem oluşturmak için OCT bloğunu kesin.</li>
	<li>Beyni, bir tıraş bıçağı ile bir beyin dilimi kalıbında enjeksiyon bölgesinden uzakta koronal bir yönde kesin. Enjeksiyon bölgesini içeren beyin dokusunu, kesik tarafı aşağı bakacak şekilde OCT düz düzlemine yerleştirin.<ol><li>OCT'yi beynin üzerine dökün ve diski kriyo odasına koyun, böylece numune bloğunun katılaşmasına izin verin. Beyin OCT ile tamamen gömülü olana kadar OCT'yi tekrar tekrar beyne dökün. NOT: OCT bileşiğini katman katman ekleyin. Önceki OCT tabakası dondurulduktan sonra, sonraki OCT bileşiği tabakasını beynin üzerine dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef bölge yaklaşana kadar numune bloğunu kesin. Enjeksiyon bölgesi seviyesinden birkaç bölüm yapın. Koronal beyin dilimlerini, -20 ° C'de tutulan küçük bir yazı fırçası kullanarak oda sıcaklığında PBS içeren 6 oyuklu bir plakaya toplayın. NOT: Bloğu kesmek için kesme kalınlığını daha büyük bir kalınlığa ayarlayın ve ardından bıçak enjeksiyon bölgesine yaklaşırken kesme kalınlığını 40 μm'ye ayarlayın. Nöral devre izleyicileri kullanılırsa, fareler hemen feda edilmez. Anesteziden kurtulmak için fareyi steril, ameliyat sonrası bir kurtarma kafesine bir ısıtma battaniyesi üzerine yerleştirin. Fareleri uyandıktan sonra orijinal kafese veya yeni bir kafese geri koyun.</li>
</ol>4. Görüntüleme
<ol><li>OCT'yi oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Beyin bölümlerini almak ve bir slayta yerleştirmek için bir fırça kullanın. Bölümlerin oda sıcaklığında kurumasına izin verin.</li>
	<li>Enjekte edilen bölgeyi görsel olarak gözlemleyin veya hedef çekirdekler çok küçük olduğunda mikroskop kullanın. Enjekte edilen boyanın yerini beyin atlasındaki ilgili bölge ile karşılaştırın. NOT: x, y ve z eksenlerinin değerlerini, enjeksiyon noktası sapmasının yönüne ve mesafesine göre ayarlayın. Koordinatları doğru bir şekilde belirlemek için bu protokoldeki tüm adımları birden çok kez tekrarlamak gerekebilir.</li>
</ol>

Farelerde Stereotaksik Mikroenjeksiyon Doğruluğunu Optimize Etme

<ol><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175(2018).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li>
<li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li>
<li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li>
<li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77(2023).</li>
<li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li>
<li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).</li>
<li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211(2021).</li>
<li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+2nd+ed%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed</a>. , Academic Press. (2001).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkar beyan etmezler.

Bu makale, stereotaksik beyin enjeksiyonlarının 5,6 doğruluğunu viral izlemeden önce daha hızlı ve basit bir şekilde doğrulamak için istikrarlı bir strateji tanımlamıştır, ancak beyin bölgesindeki raportör gen ekspresyonunun yeri doldurulamaz yönü, beyin bölgesi etiketlemesi için çok önemlidir. Kullandığımız mavi boya, enjeksiyon bölgesinin hemen görselleştirilmesine izin verdi.
Bu protokoldeki birkaç kritik adım, enjeksiyon bölgesinin doğruluğunun iyileştirilmesine katkıda bulunur. İlk olarak, 1.5 adımından itibaren stereotaksik alette beynin sol-sağ düzlüğünün sağlanması; Bu adım, operatörlerin kafatası anatomisine aşina olmasını ve kulak çubuklarının doğru konuma yerleştirilmesini sağlamasını gerektirir. Kulak çubukları üzerindeki ölçekler ve stereotaksik çerçeve de referans görevi görür. İkinci olarak, adım 1.6 ve adım 2.3'te tam sıfır noktasını, bregmayı bulmak. Bazen, adım 1.6 ve 2.3'te bulunan koordinatlardaki önemli bir tutarsızlık, sıfır noktası konumlandırmasındaki önemli bir farktan kaynaklanır. Bu, mikroenjektör iğnesinin kafatası penceresine nüfuz edememesine neden olabilir. Bu gibi durumlarda, sıfır noktasını yeniden konumlandırmak ve gerekirse yeni bir kraniyal pencere oluşturmak gerekir. Buna rağmen, adım 2.3'te sıfır noktasını yeniden kurmak ve koordinatları yeniden bulmak hala önemlidir; Mikro şırınga önceden yapılmış kraniyal pencereden doğrudan yerleştirilemez.
Donmamış bir beynin bir fare beyin dilimi kalıbında kesilmesiyle karşılaştırıldığında, bu strateji daha doğru bir sonuç sağlar çünkü katı numune bloğu bıçağın beyni sıkmasını ve boyanın enjeksiyon noktalarından yer değiştirmesine neden olmasını önler. Ayrıca, bir beyin dilimi kalıbı tarafından kesilen beyin bölümleri nispeten daha kalındır ve küçük beyin çekirdeklerini lokalize etmek için mümkün değildir. Bununla birlikte, standart beyin dokusu kriyoseksiyon işlemi 11,12,13,14,15 ile karşılaştırıldığında, dehidrasyon adımlarını atlayarak işlem süresini en az 72 saat kısalttık, bu da beyin bölümlerinin daha kırılgan olmasına ve bu protokolün büyük bir zayıflığını temsil eden bir cam slayt üzerinde alınması daha zor olmasına neden oldu.
Boya enjeksiyonu için kraniyal pencereler yapılırken, diş matkabını elle tutmak yerine stereotaksik kola sıkıca takmak, ince ayar düğmesini kullanarak delme derinliğini kontrol etmeyi kolaylaştırır ve böylece beyin dokusuna zarar verme olasılığını azaltır.
Sonuç olarak, bu çalışma, viral izlemeden önce kesin stereotaksik koordinatları önceden doğrulamak için umut verici bir yöntem sağlamış ve sonraki nöron etiketleme ve izleme sürecini daha güvenilir hale getirmiştir.

İn vivo kalsiyum kaydı, optogenetik ve kemogenetik araçlar dahil olmak üzere neredeyse tüm modern nöromodülasyon araçları, nöral manipülasyonun temelini oluşturan beyin ilgi alanını 1,2,3 hedeflemek için stereotaksik koordinatların kullanılmasını gerektirir. Fare beyin bölgeleri için stereotaksik koordinatlar, kafatası üzerindeki kemikli yer işaretleri olan bregma ve lambda ile ilişkili olarak tanımlanır ve kafatasından türetilmiş stereotaksik koordinat sistemini oluşturur. Ya bregma ya da lambda, üç boyutlu koordinatların sıfır noktası olarak hizmet edebilir. Üç eksen anteroposterior (AP), mediolateral (ML) ve dorsoventral (DV) olup, stereotaksik aletlerin dijital ekranında y, x ve z eksenlerini temsil eder. İyi bilinen beyin bölgeleri için, belirli bir alanın stereotaksik koordinat parametreleri, fare beyin atlaslarından4 (örneğin, stereotaksik koordinatlarda Paxinos ve Franklin'in fare beyni) ve/veya yayınlanmış literatürden 5,6 elde edilebilir. Bununla birlikte, stereotaksik ekipmandaki farklılıklar ve farklı araştırmacılar tarafından kullanılan farelerin yaşı / popülasyonları nedeniyle daha fazla doğrulama gereklidir.
Yapı, işlevin temelidir. Nöral devreler, bilişsel aktiviteler, duygu, hafıza, duyusal ve motor işlevler gibi birçok beyin fonksiyonunun temelini oluşturur1. Nöral devrelerin yapısını etiketlemek ve aktivitesini manipüle etmek, belirli bir nöral devrenin işlevini anlamak için hayati önem taşır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, nöral izleyiciler birçok nesil boyunca gelişti; erken araştırmalar, buğday tohumu aglütinini (WGA) ve phaseolus vulgaris aglütinini (PHA) anterograd izleyiciler olarak ve florogold (FG), kolera toksin alt birimi B (CTB), karbosiyanin retrograd izleyiciler olarak kabul edildi. Bununla birlikte, viral izleyicilerin aksine, bu geleneksel nöral izleyiciler, eksojen genleri konakçıya entegre edemezler ve hücre tipi seçiciliğine sahip değildirler. Günümüzde, viral strateji, temel sinirbilim araştırmaları sırasında önemli bir öneri haline gelmiştir. Farklı araştırma amaçları için çeşitli viral araçlar seçilebilir 7,8. Transsinaptik olmayan virüsler, trans-multisinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) ve trans-monosinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) vardır. Her kategori, ilgili özelliklere sahip birkaç tür içerir.
Viral uygulama ve ekspresyon süreci oldukça zaman ve kaynak yoğundur, genellikle haftalar veya daha uzun sürer. Çeşitli viral vektörler arasında, adeno-ilişkili virüs, deneysel prosedür için enjeksiyondan 3 ila 8 hafta sonra geniş bir pencere sağlayarak, gen iletimi için umut verici bir araç olarak tanımlanmıştır 7,8. AAV geliştikçe, uygulamadan 2-3 hafta sonra analiz yapılabilir 9,10. Yalancı kuduz virüsü (PRV) ve kuduz virüsü (RV) gibi diğer nöral devre izleyicileri de en az 2-7 günlük bir izleme süresi gerektirir 11,12,13,14,15. Bu nedenle, floresan sinyallerini gözlemlemeden önce enjeksiyon bölgesinin ön doğrulaması hem zaman hem de maliyet açısından etkilidir.
Stereotaksik enjeksiyonların basit ve hızlı bir şekilde doğrulanmasını kolaylaştırmak için, bu çalışmada, viral vektörlerden önce bir boya uygulanır ve kriyoseksiyon, araştırmacıların enjeksiyon bölgesini gözlemlemelerini ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika içinde izlemelerini sağlar.

<table><tbody><tr><td>1.0 ve mikro; L, Nöro Şırınga, Model 7001 KH, 32 G, Nokta Stili 3</td><td>Hamilton</td><td>65458-01</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; L pipet uçları</td><td>biosharp</td><td>BS-200-T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL şırınga</td><td>Lütfen grup</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%3 H2O2 çözeltisi</td><td>Lircon Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Shengyou Biotech</td><td>20006</td><td></td></tr><tr><td>Anerdian</td><td>Likang Yüksek teknoloji</td><td>31001002</td><td></td></tr><tr><td>Anti rulo plakası</td><td>Leica</td><td>14047742497</td><td></td></tr><tr><td>BD insülin şırınga</td><td>Becton, Dickinson ve Şirket</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Bükme dişli diseksiyon forseps</td><td>Jinzhong</td><td>JD1050</td><td></td></tr><tr><td>Cellsens boyut yazılımı</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu çubuk</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-Fluoromount-G</td><td>Southernbiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Matkap</td><td>Longxiang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce fırçalar</td><td>HWAHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>Jinzhong</td><td>y00030</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>donma mikrotomu</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Dişli düz hemostatik forseps</td><td>Jinzhong</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>İnfüzyon iğnesi 0,7 mm</td><td>Nazik grup</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidokain hidroklorür enjeksiyonu</td><td>Hasat İlaç Şirketi</td><td>71230803</td><td></td></tr><tr><td>Büyüteç</td><td>M& G Chenguang Kırtasiye</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erkek C57 / BL fareler</td><td>Şanghay Planlı Ebeveynlik Araştırma Enstitüsü&ndash; BK Laboratuvar Fareleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>koronal beyin dilimi kalıbı</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>68713</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>biosharp</td><td>BS-02-P</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom bıçakları</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik merhem</td><td>Cisen İlaç Şirketi</td><td>G23HDM9M4S5</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompalar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-4507</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Piette 2-200 & mu; L</td><td>thermofisher</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE bromofenol mavisi içeren numune yükleme</td><td>Beyotime</td><td>P0015A</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>BFYING</td><td>91560618</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar</td><td>Citotest Bilimsel</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik cihaz</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>68807</td><td></td></tr><tr><td>Düz dişli diseksiyon forseps</td><td>Jinzhong</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Tutucu</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>68206</td><td></td></tr><tr><td>Doku makası</td><td>Jinzhong</td><td>J21040</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek OCT bileşiği</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Aibei Biyoteknoloji</td><td>M2910</td><td></td></tr></tbody></table>

kriyoseksiyon yoluyla stereotaksik enjeksiyon koordinatlarının Ön doğrulaması

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik enjeksiyonu, temel sinirbilimde temel bir deneysel teknik oluşturur. Araştırmacılar genellikle stereotaksik enjeksiyon parametreleri seçimlerini fare beyin atlaslarına veya çeşitli popülasyonlar / yaşlarda fareler ve farklı stereotaksik ekipman kullanan yayınlanmış materyallere dayandırırlar ve bu da stereotaksik koordinat parametrelerinin daha fazla doğrulanmasını gerektirir. Kalsiyum görüntüleme, kemogenetik ve optogenetik manipülasyonların etkinliği, genellikle birkaç haftalık çaba gerektiren, ilgilenilen bölgedeki raportör genlerin kesin ifadesine dayanır. Bu nedenle, hedef beyin bölgesinin koordinatlarının önceden doğrulanmaması zaman alıcı bir iştir. Virüs yerine uygun bir boya kullanarak ve kriyoseksiyon uygulayarak, araştırmacılar boya uygulamasından hemen sonra enjeksiyon bölgesini gözlemleyebilirler. Bu, gerçek enjeksiyon bölgesi ile teorik konum arasında tutarsızlıkların olduğu durumlarda koordinat parametrelerinde zamanında ayarlamalar yapılmasını kolaylaştırır. Bu tür ayarlamalar, sonraki deneylerde hedef bölge içindeki viral ekspresyonun doğruluğunu önemli ölçüde artırır.

Bu çalışma, gösterilen yöntemi kullanarak enjeksiyon bölgesini 30 dakika içinde başarıyla tanımladı. Başlangıçta, bromofenol mavisi içeren bir SDS-PAGE numune yükleme çözeltisi, C57 / BL farelerinde LDTgV'ye enjekte edildi. Şekil 1A , boya çözeltisi enjeksiyonunun şematik bir gösterimini göstermektedir. LDTgV'deki mavi boyanın dağılımı Şekil 1B'de gösterilmiştir.
Bromofenol mavisi ayrıca bu protokolün evrenselliğini değerlendirmek için mPFC prelimbik korteks, mPFC infralimbik korteks ve bazomdial amigdalaya (BMA) enjekte edildi. Şekil 1C-E ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi, mavi boya mPFC prelimbik korteks, mPFC infralimbik korteks ve BMA'da dağıtıldı.
Ayrıca, bir floresan mCherry proteini taşıyan adeno-ilişkili bir virüs LDTgV'ye enjekte edildi (koordinatlar boya çözeltisi kullanılarak doğrulandı). Virüsün ifadesi dört hafta sürdü. LDTgV'deki mCherry + nöronlarının dağılımı Şekil 2B'de gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig01.jpg"> Şekil 1: Boya çözeltisinin enjeksiyonu. (A) Boya çözeltisi enjeksiyonunun şematik bir diyagramı. (B) LDTgV'de mavi boyanın dağılımı. (C) mPFC prelimbik kortekste mavi boyanın dağılımı. (D) mPFC infralimbik kortekste mavi boyanın dağılımı. (E) BMA'da mavi boyanın dağılımı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig02.jpg"> Şekil 2: Mikroskop altında görüntülenen mavi boya dağılımı ve mCherry dağılımı. (A) mPFC prelimbik kortekste mavi boya dağılımı (10x büyütme, ölçek çubuğu = 500 μm). (B) Floresan mikroskobu ile elde edilen LDTgV bölgesindeki mCherry dağılımının temsili görüntüsü (10x büyütme, ölçek çubuğu = 500 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mevcut protokol, boyalar ve donmuş kesitler kullanarak viral izleme yapmadan önce stereotaksik enjeksiyon koordinatlarının doğrulama adımını hızlandırmak için pratik bir stratejiyi açıklamaktadır.

Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Araştırmamız öncelikle farelerde bilişsel bozukluğun altında yatan nöral devre mekanizmasını araştırmaya odaklanmaktadır. Ve bu çalışmalarda sıklıkla beyin stereotaksik tekniklerini kullanıyoruz. Amacımız, boyaların kullanıldığı stereotaksik enjeksiyon bölgeleri için doğrulama sürecini optimize etmek ve hızlandırmak, bunun basit ve hızlı bir prosedür haline gelmesini sağlamaktır.Virüsün stereotaksik enjeksiyonu yoluyla sinirbilim araştırmalarında çeşitli stratejiler çok önemli hale gelmiştir. Bunu, tamamlanması birkaç hafta süren bir süreç olan enjeksiyon bölgelerini doğrulamak için doku dilimindeki floresan belirteçlerin gözlemlenmesi takip eder. Protokolümüz, en az üç günlük dehidrasyon süresinden tasarruf ederek ve enjeksiyon bölgelerinin daha hızlı tanımlanması için uygun maliyetli bir boya kullanarak diğer tekniklere göre avantajlar sunar.Ön doğrulama olmamasına kıyasla haftalar kazandırabilir.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kemirgenler üzerinde stereotaksik cerrahi, ilaçlar ya da uyanık davranmak hayvanlar elektriksel stimülasyon ve kayıtları, hedeflenen yönetim için izin verir. Bu video sunumu biz bu uzun soluklu bir prosedür başarıyla sağkalım oranı ve düşük ameliyat sonrası kilo kaybı son usul ayrıntılandırmaları gösterecektir.

Behavioral Neuroscience Kemirgen Stereotaksik Cerrahi ve Hayvan Refahı Sonuç İyileştirmeler

Stereotaksik koordinatları kullanarak excitotoxin infüzyonu ile belirli beyin bölgesinin Hedefli ablasyonu (ler) tarif edilir. Bu teknik aynı zamanda sıçan beyin içine diğer kimyasalların infüzyon için adapte edilebilir.

Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Kaynak: Joshi, K., et al. Farelerde kaudal beyin sapı ve üst servikal omuriliği Cisterna magna yoluyla mikroenjekte etmek için stereotaksik cerrahi yaklaşım. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, beyin sapı ve üst omuriliğe hedefli iletim için cisterna magna stereotaksik yaklaşımı göstermektedir. Bu yaklaşım, beyin omurilik sıvısı dolu cisterna magna'ya erişerek, standart stereotaksik yöntemler kullanılarak ulaşılması zor olan bölgelere hassas enjeksiyonlar yapılmasını sağlar.

Bir fare modelinde terapötik uygulama için stereotaksik Cisterna Magna yaklaşımı

Kaynak: Fricano-Kugler, C. J., et al. Stereotaksik enjeksiyon yoluyla yüksek titreli CRISPR retro ve Lentivirüslerin tasarımı, paketlenmesi ve teslimi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare beyninde hassas nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyonu göstermektedir. Protokol, dentat girusa doğru virüs iletimini sağlayarak, nöral devreleri, gen fonksiyonunu ve hastalık mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için floresan etiketleme ve CRISPR aracılı gen nakavtını mümkün kılar.

Fare beyninde hedeflenen nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyon

Stereotaktik Elektroensefalografi (SEEG) nöbet odakları yerelleştirilmesine yardımcı epilepsi cerrahisinde kullanılan bir cerrahi tekniktir. Aynı zamanda beyin fonksiyonu araştırmak için benzersiz bir fırsat tanıyor. Burada SEEG insan bireylerde kognitif işlemlerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Stereotaktik Elektroensefalografi kullanarak Derin KORTİKAL Fonksiyonu ve subkortikal yapıları incelenmesi: Ön Singulat Korteks Dersler

Burada, geri dönüşümsüz bir endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) inhibitörünün (L-Nio) lokal enjeksiyonu ile murin beyaz cevherinde fokal inme üretimi için metodoloji sunuyoruz. Bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişleten iki stereotaktik varyasyon, retrograd nöronal izleme ve taze doku etiketleme ve diseksiyon sunulmaktadır.

Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Bu protokol, ex vivo beyin dilimlerinde optogenetik stimülasyonlar kullanarak uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin hücre tipi spesifik fonksiyonel bağlantısını belirlemek için bir dizi yöntemi açıklamaktadır.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için stereotaksik cerrahi genellikle kafatası kemiklerinden erişimi içerir ve kafatası yer işaretleri tarafından yönlendirilir. Burada, beyin sapı yer işaretlerinin doğrudan görselleştirilmesine dayanan sarnıç magna aracılığıyla kaudal beyin sapı ve üst servikal omuriliği hedeflemek için alternatif bir stereotaksik yaklaşımı özetlemekteyiz.

Farelerde Cisterna Magna ile Kaudal Beyin Sapı ve Üst Servikal Omuriliğin Mikroenjekte Edilmesine Stereotaksik Cerrahi Yaklaşım

Keşfedin farelerde viral izleme öncesi stereotaksik enjeksiyon koordinatlarını kriyoseksiyonla hızlı doğrulama yöntemini. Bu protokol, boya kullanarak doğrulama süresini kısaltır ve sinir devre araştırmalarında verimliliği artırır.

Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması

Daha fazla video keşfet