Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Glikoz metabolizması Trypanosoma brucei için kritik öneme sahiptir, ancak hücrelerin ortamdaki değişen glikoz seviyelerini nasıl algıladığı ve bunlara nasıl tepki verdiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Canlı parazitlerde glikozomal pH'ı izlememize izin veren ve parazitlerin besin dalgalanmalarına dinamik tepkilerinin anlaşılmasına yardımcı olacak bir pH biyosensörünü ifade eden parazitler geliştirdik. Bu deney için bir zorluk, bir mikrotitre plaka okuyucu ile donatılmış bir akış sitometresinin yanı sıra biyosensör floresansını ölçmek için uygun filtre setlerinin mevcudiyeti olacaktır.

Ek olarak, T.brucei bir risk grubu iki organizmadır, bu nedenle sitometre bir biyogüvenlik seviyesi iki tesisi içinde barındırılmalıdır. Hekzokinaz ve fosfofruktokinaz pH'a duyarlı olduğu için glikozomların pH seviyesinin glikolizi etkileyebileceği keşfedilmiştir. Bununla birlikte, daha önce kullanılan pH probları, kan dolaşımı formundaki glikozomu doğru bir şekilde hedeflemedi.

Bu parazit yaşam evresinde glikozomal pH ve glikoliz arasındaki ilişkiyi incelemek için daha iyi bir araca ihtiyaç vardı. pHluorin2-PTS1 sensörü, bu yaşam evresinde kimyasal pH problarından ziyade glikozomun yerini belirlemede daha iyi olan bir araçtır. Kullanıcı dostudur, çünkü pH sensörünün ekspresyonunu yalnızca bir gecede indüklemeniz gerekir ve hücreler pHluorin2'yi glikozoma dönüştürür ve lokalize eder.

pHluorin2'yi ölçmek için akış sitometrisinin kullanılması, mikroskoba kıyasla verimi artırır ve istatistiksel ölçümleri iyileştirir.