Name: Canlı Trypanosoma bruceide Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Keşfedin, canlı Trypanosoma brucei parazitlerinde glikozomal pH dinamiklerini pH duyarlı biyosensör ve akış sitometri ile nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, besin değişimlerine parazit yanıtlarını anlamak için yüksek verimli tarama olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

pHluorin2-PTS1, yapıyı yüksek kopyalı bir klonlama vektöründe sağlayan Twist Bioscience tarafından pLEW100v5'e klonlandı; pLEW100v5, Dr. George Cross'un hediyesiydi. T. brucei aldolase'ye karşı yetiştirilen antiserum, talep üzerine Clemson Üniversitesi'nden Dr. Meredith T. Morris'ten temin edilebilir. JCM ve KAC laboratuvarlarından yapılan çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01AI156382) bir ödülle kısmen desteklenmiştir. SSP, NIH 3R01AI156382 tarafından desteklenmiştir.

Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH için pHluorin2 Tabanlı Sensörün Geliştirilmesi

<ol><li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+the+African+trypanosome%3A+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).</li>
<li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938(2015).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018).</li>
<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139(2022).</li>
<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
<li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li>
<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Afrika tripanozomundaki çevresel algı ve tepki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Besin mevcudiyetindeki değişikliklerin, glikozomların asitlenmesi de dahil olmak üzere parazitte çeşitli tepkileri tetiklediği bilinmektedir. Burada, kalıtsal bir protein sensörü, pHluorin2 ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerdeki çevresel bozulmalara glikozomal pH tepkisini incelemek için bir yöntem tanımladık.
Sensörün kullanımında birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, transgeni eksprese eden ...

Parazitik kinetoplastidler, çoğu canlı organizma gibi, merkezi karbon metabolizmasının temel bir bileşeni olarak glikoza güvenir. Bu grup, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei gibi tıbbi açıdan önemli organizmaları içerir;Amerikan tripanozomu, T. cruzi; ve Leishmania cinsinin parazitleri. Glikoz metabolizması, patojenik yaşam döngüsü aşamalarında parazit büyümesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, glikozdan yoksun bırakıldığında, Afrika tripanozomunun kan dolaşımı formu (BSF) hızla ölür. Özellikle, glikoliz, enfeksiyonun bu aşamasında ATP'nin tek kaynağı olarak hizmet eder1. Leishmania parazitleri de aynı şekilde insan konakçıdaki glikoza bağımlıdır, konakçı makrofajlarda bulunan amastigot yaşam döngüsü aşaması büyüme için bu karbon kaynağına bağımlıdır2.
Bu parazitler, farklı böcek vektörlerini içeren farklı yaşam tarzlarına sahip olsalar da, glikoza nasıl tepki verdikleri ve tükettikleri konusunda birçok ortak noktayı paylaşırlar. Örneğin, bu parazitler çoğu glikolitik enzimi glikozom adı verilen modifiye peroksizomlara lokalize eder. Bu kinetoplastide spesifik organel, korunmuş biyosentetik mekanizmalara vemorfolojiye dayalı memeli peroksizomları ile ilişkilidir 3,4,5,6.
Glikolitik yol enzimlerinin çoğunun glikozoma bölümlendirilmesi, yolun düzenlenmesi için parazite özgü araçlar sunar. Kimyasal bir pH probu kullanarak, besin yoksunluğunun, anahtar glikolitik enzim hekzokinaz 7,8 üzerindeki bir allosterik düzenleyici bağlanma bölgesine maruz kalma yoluyla glikolitik enzim aktivitesinin değişmesine neden olan prosiklik form (PF) parazit glikozomlarının hızlı bir asitlenmesini tetiklediğini belirledik. Önceki çalışmamızda, kimyasal probun kullanım için sürekli teslimat gerektirmesi ve diğer uygulamalardaki faydasını sınırlaması gerekiyordu. Ek olarak, BSF'deki glikozomdaki prob dağılımını sürdürme zorlukları, bu yaşam evresinde glikozomal pH'ı araştırma yaklaşımının faydasını sınırladı.
Bu çalışmada, glikoz açlığı9 dahil olmak üzere çevresel ipuçlarına yanıt olarak BSF T. brucei'deki glikozomal pH değişimini izlemek için floresan protein biyosensörü pHluorin2'yi kullandık (Şekil 1). Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, BSF T. brucei'nin, PF parazitlerinde gözlemlediğimiz tepkilere benzer şekilde, açlığa yanıt olarak glikozomları geri dönüşümlü bir şekilde hızla asitleştirdiğini göstermektedir. Bu biyosensörün T. brucei ve ilgili parazitlerdeki glikolitik regülasyon anlayışımızı geliştireceğini umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>50 mL Doku Kültürü Şişeleri (İşlem görmemiş, steril)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Doku Kültürü Şişesi (İşlem görmemiş, steril)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &; mikro; L düz tabanlı 384 kuyulu plaka</td><td>BrandTech&nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa İnsan T Hücresi Nükleofektoru&nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific tarafından</td><td>Attune NxT Akış Sitometresi</td> invitrojen <td>A24858</td><td>FlowJo yazılımı</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, düz tabanlı plaka</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>Coloc 2 ImageJ</td><td></td><td></td><td>eklentisi https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr>Thermo Fisher<td>Scientific tarafından CytKick Max Otomatik Örnekleyici</td><td>canlandırıcısı</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Akış Sitometresi</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri% 16 Paraformaldehit Sulu Çözelti, EM Sınıfı, 10 mL Ampul</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>istatistik yazılımı</td></tr><tr><td>Nigericin (sodyum tuzu)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nükleofektör 2b</td><td>Lonza</td><td>Üretimi Durdurulan Ürün</td><td></td></tr><tr><td>OP2 Sıvı İşleyici</td><td>opentronları</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin, H2O Sigma</td><td>Life Science</td><td>CAS:25988-63-0</td><td>HTS testi için pipetleme robotu</td></tr><tr><td>Tiazol Kırmızısı (TO-PRO-3)</td><td>biotium</td><td>#40087</td> Bu <td>marka plakanın algılanabilmesi ve CytKick Max Auto'muzda kullanılabilmesi için özel bir akrilik plaka standı işledik. Bu marka plakanın algılanabilmesi ve CytKick Max Auto'muzda kullanılabilmesi için özel bir akrilik plaka standı işledik HTS testi için örnekleyici</td></tr><tr><td>valinomycin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>Pipetleme robotu</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>pH kalibrasyonu için</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>pH kalibrasyonu için</td></tr></tbody></table>

canlı trypanosoma brucei'de dinamik glikozomal ph değişikliklerinin Ölçülmesi

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glikoz metabolizması, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei, temel bir metabolik süreç ve parazit gelişiminin düzenleyicisi olarak kritik öneme sahiptir. Çevresel glikoz seviyeleri değiştiğinde oluşan hücresel tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Hem kan dolaşımında hem de prosiklik formda (böcek evresi) parazitlerde, glikozomlar glikolizin çoğunu barındırır. Bu organeller, glikoz yoksunluğuna yanıt olarak hızla asitleştirilir, bu da muhtemelen hekzokinaz gibi glikolitik enzimlerin allosterik regülasyonuna neden olur. Önceki çalışmalarda, pH ölçümleri yapmak için kullanılan kimyasal probun lokalizasyonu zordu ve diğer uygulamalardaki kullanımını sınırlıyordu.
Bu makale, kalıtsal bir protein pH biyosensörü olan glikozomal olarak lokalize pHluorin2'yi eksprese eden parazitlerin gelişimini ve kullanımını açıklamaktadır. pHluorin2, 395 nm'de uyarmada pH'a (asit) bağlı bir azalma gösteren ve aynı anda 475 nm'de uyarmada bir artış sağlayan bir oransal pHluorin varyantıdır. Transgenik parazitler, pHluorin2 açık okuma çerçevesinin tripanozom ekspresyon vektörü pLEW100v5'e klonlanmasıyla üretildi ve her iki yaşam döngüsü aşamasında da indüklenebilir protein ekspresyonu sağlandı. pHluorin2 biyosensörünün glikozomal lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan kullanıldı ve biyosensörün lokalizasyonunu glikozomal yerleşik protein aldolaz ile karşılaştırdı. Sensörün yanıt verme hızı, daha önce floresein bazlı bir pH sensörünü kalibre etmek için kullandığımız bir yaklaşım olan pH değeri 4 ile 8 arasında değişen bir dizi tamponda hücrelerin inkübe edilmesiyle farklı pH seviyelerinde kalibre edildi. Daha sonra glikozomal pH'ı belirlemek için akış sitometrisi kullanarak 405 nm ve 488 nm'de pHluorin2 floresansını ölçtük. PF parazitlerinde bilinen bir glikozomal asitleşme tetikleyicisi olan glikoz yoksunluğuna yanıt olarak zaman içinde pH'ı izleyerek canlı transgenik pHluorin2 eksprese eden parazitlerin performansını doğruladık. Bu araç, potansiyel olarak yüksek verimli ilaç taramasında kullanılmak da dahil olmak üzere bir dizi potansiyel uygulamaya sahiptir. Sensör, glikozomal pH'ın ötesinde, canlı hücre ortamındaki pH dinamiklerini anlamak için diğer organellere uyarlanabilir veya diğer tripanosomatidlerde kullanılabilir.

BSF T. brucei'de glikozomlara pHLuorin2-PTS1 lokalizasyonu pHluorin2-PTS1'in hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek için parazitler immünofloresan testlerine tabi tutuldu. Glikozomda yerleşik bir protein olan aldolaza (TbAldolaz) karşı yükselen anti-serumlarla birlikte lokalize olan transgenden gelen sinyal (Şekil 2A). Anti-TbAldolaz ve pHluorin2-PTS1 arasındaki ortalama Pearson korelasyon katsayısı 0.895 idi, bu da pHluorin2-PTS1'in öncelikle glikozomlara lok...

PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Glikoz metabolizması Trypanosoma brucei için kritik öneme sahiptir, ancak hücrelerin ortamdaki değişen glikoz seviyelerini nasıl algıladığı ve bunlara nasıl tepki verdiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Canlı parazitlerde glikozomal pH'ı izlememize izin veren ve parazitlerin besin dalgalanmalarına dinamik tepkilerinin anlaşılmasına yardımcı olacak bir pH biyosensörünü ifade eden parazitler geliştirdik. Bu deney için bir zorluk, bir mikrotitre plaka okuyucu ile donatılmış bir akış sitometresinin yanı sıra biyosensör floresansını ölçmek için uygun filtre setlerinin mevcudiyeti olacaktır.Ek olarak, T.brucei bir risk grubu iki organizmadır, bu nedenle sitometre bir biyogüvenlik seviyesi iki tesisi içinde barındırılmalıdır. Hekzokinaz ve fosfofruktokinaz pH'a duyarlı olduğu için glikozomların pH seviyesinin glikolizi etkileyebileceği keşfedilmiştir. Bununla birlikte, daha önce kullanılan pH probları, kan dolaşımı formundaki glikozomu doğru bir şekilde hedeflemedi.Bu parazit yaşam evresinde glikozomal pH ve glikoliz arasındaki ilişkiyi incelemek için daha iyi bir araca ihtiyaç vardı. pHluorin2-PTS1 sensörü, bu yaşam evresinde kimyasal pH problarından ziyade glikozomun yerini belirleme

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Afrika tripanozomlarındaki glikozom dinamiklerinin, elektron ve floresan mikroskobu gibi geleneksel hücre biyolojisi teknikleriyle incelenmesi zordur.  Dinamik organel davranışını gözlemlemenin bir yolu olarak, canlı parazitlerde gerçek zamanlı glikozom dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile birlikte bir floresan-organel raportör sistemi kullanılmıştır.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Bir proteine bir etiket eklemek, onun işlevi hakkında fikir edinmenin güçlü bir yoludur. Burada, yüzlerce Trypanosoma brucei proteinini paralel olarak endojen olarak etiketlemek için bir protokol açıklıyoruz, böylece genom ölçeği etiketlemesi elde edilebilir.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

İn vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomları, düşük bir oranda antijenik varyasyona uğrar, öyle ki popülasyonlar, baskın bir varyant yüzey glikoprotein (VSG) tipini ifade eden parazitlerden ve küçük bir "anahtarlamalı" varyant popülasyonundan oluşur.  Bu protokol, bu popülasyonları tespit etmek ve ölçmek için hızlı bir yöntemi tanımlar.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Telomerler kromozom istikrar için çok önemlidir ve telomer G-çıkıntı yapısı, telomeraz aracılı telomer bakımı için önemlidir. Biz son zamanlarda telomer G-çıkıntı yapı tespit etmek için iki yöntem...

Telomer G-çıkıntı Yapısı incelenmesi Trypanosoma brucei</em

Bu makale, flow sitometri kullanarak sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivitesini ölçmek için ayrıntılı protokol.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Influenza A virusu ile aynı anda enfeksiyon asemptomatik sırasında invazif pnömokok hastalığına indüksiyonu karıştığı faktörlerden...

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü...

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

Keşfedin, canlı Trypanosoma brucei parazitlerinde glikozomal pH dinamiklerini pH duyarlı biyosensör ve akış sitometri ile nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, besin değişimlerine parazit yanıtlarını anlamak için yüksek verimli tarama olanağı sunar.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet