Name: Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Keşfedin küçük moleküllü ligandların kriyoelektron mikroskobisi haritalarına modellenmesini. Bu hesaplamalı yöntem, makromoleküler komplekslerin yapısını belirlemek ve ilaç keşfi için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek amacıyla kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SJ, DAE-TIFR'den doktora öğrencisi unvanı almıştır ve finansman kabul edilmektedir. KRV, DBT B-Life hibesi DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ve Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı'nın Proje Kimlik No'lu kapsamında desteğini kabul eder. RTI4006.

Makromoleküllerin CryoEM Haritalarında Küçük Moleküllü Ligandların Modellenmesi

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Mikroskop donanım ve yazılımındaki gelişmeler, son yıllarda cryoEM yapılarının sayısında artışa neden olmuştur. Tek parçacıklı cryoEM'de şu anda elde edilen en yüksek çözünürlük 1.2 Å57,58,59 olmasına rağmen, yapıların çoğu 3-4 şçözünürlük civarında belirlenmektedir. Orta ila düşük çözünürlüklü haritalarda ligandları modellemek zor olabilir ve genellikle belirsizliklerle dolu olabilir. CryoEM'nin hem akademide hem de ilaç endüstrisinde translasyonel araştırma ve ilaç keşfi için yaygın kullanımı göz önüne alındığında, ligandların doğru ve belirsizlik olmadan modellenmesini sağlamak çok önemlidir. Bu nedenle, ligand atomlarının çözülebilirliğini, Chimera'da olduğu kadar haritaların kalitesini ve modelin uyumunu değerlendirmek için bir metrik olarak EMDB'de de mevcut olan Q-skorları60'ı hesaplayarak ölçmek ihtiyatlı olacaktır.
İlk örnekte, M. tuberculosis enolaz enzimindeki apo ve ligand-bound haritaları arasındaki gerçek uzaydaki fark haritasını hesaplamak için ChimeraX kullanıldı. Yüksek bir eşikteki ek yoğunluk, aktif bölgede ligand, fosfoenolpiruvat ve ligand'a bağlı Mg2 + 'nın varlığını gösterir. Bu durumda, haritanın orta çözünürlükte (3.2 Å) olduğunu ve su moleküllerinin güvenle modellenemeyeceğini belirtmek önemlidir (Şekil 1). Bu yöntemle ilişkili sınırlama, yalnızca ligand bağlanmasının proteinde önemli konformasyonel değişikliklere neden olmadığı durumlarda uygulanabilmesidir. Bu durumda hem apo hem de ligand'a bağlı veri kümeleri aynı piksel boyutunda elde edildiğinden ve Relion'da aynı parametrelerle işlendiğinden harita normalizasyonu yapılmamıştır. Bununla birlikte, Relion 46,47 ve CryoSparc61 gibi farklı yeniden yapılandırma programları tarafından veya farklı kaliteye sahip haritalar karşılaştırıldığında, anlamlı karşılaştırmalar yapılmadan önce haritaların normalleştirilmesinin gerekli hale geldiğini belirtmekte fayda var.
Bir sonraki örnek, cryoEMyapılarından 51,62 (Şekil 2) anlaşılacağı gibi, agonist bağlanması üzerine büyük moleküler yeniden yapılanmaya uğrayan mGlu 5'tir. Bu senaryoda, haritalar arasındaki önemli farklılıklar nedeniyle, bağlanmamış (apo) ve ligand-bağlı reseptörler arasında basit bir fark haritası hesaplamak mümkün değildir. Burada, karşılıklı uzayda arıtma için girdi olarak keskinleştirilmemiş ve ağırlıklandırılmamış yarı haritalar kullanan ve daha sonra deneysel harita ile modelden türetilen harita arasında bir fark haritası hesaplayan Servalcat kullanılmıştır. Yüksek bir eşikte, farklılıklar görselleştirilebilir ve modelin düzeltilmesi ve iyileştirilmesi için bir rehber görevi görebilir. mGlu5'in hücre dışı ve transmembran alanının yakınında birkaç modellenmemiş blob gözlendi ve ligandları modellemek için bir kılavuz olarak kullanıldı (Şekil 2).
Üçüncü örnek, çözünürlüğün (2.3 Å) β-galaktosidazda parça boyutlu bir inhibitörün harita yorumlanmasında ve modellenmesinde nasıl önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Buradaki zorluk, verilerdeki doğal gürültünün ortasında Servalcat fark haritasında çok küçük bir ligandı (<200 Da) tanımlamak ve onu doğru bir şekilde modellemekti. Fourier Kabuk Korelasyonu (FSC) kullanılarak belirlenen yüksek global çözünürlüğe ek olarak, ligandlara özgü yerel çözünürlük de ligandların kiral merkezlerinin doğru yerleştirilmesini sağlamak için yeterince yüksekti (Şekil 3). Çözücü molekülleri için yoğunluk, enzim boyunca ve özellikle ligandı çevreleyen fark haritasında gözlendi. Çözünürlüğün ligandların ve çözücü atomlarının modellenmesi üzerindeki etkisi de gösterilmiştir (Şekil 4). Su veya çözücü moleküllerini modellerken dikkatli olmak önemlidir, çünkü bazen düşük bir eşikteki gürültü su veya çözücü moleküllerine benzeyebilir ve bu da olası yanlış yorumlamalara yol açabilir.
Bir diğer önemli husus, cryoEM haritalarının tek başına bir metal iyonunu doğru bir şekilde tanımlamak için yeterli olmayabileceğidir. Metal iyonunun varlığını ve kimliğini doğrulamak için genellikle Genişletilmiş X-ışını Absorpsiyon İnce Yapısı (EXAFS) veya Enerji Dağıtıcı X-ışını Spektroskopisi (EDX) gibi ek biyofiziksel yöntemler gereklidir. Hem enolaz hem de β-galaktosidaz enzimlerinde, Mg2 + , bu proteinler üzerinde halihazırda mevcut olan bilgi zenginliği nedeniyle modellendi ve metal iyonunun kimliğini doğruladı. Ayrıca, klasik oktahedral geometri ve Mg2 + 'nın ideale yakın koordinasyon mesafeleri ile örneklenen bu durumlarda metal iyonlarının koordinasyonu, kimliklerinin önemli bir kanıtını sağlamıştır.
Genel olarak, cryoEM haritalarında ligandlar modellenirken birkaç önemli husus dikkate alınmalıdır. Başlangıç olarak, ligand tanımlama ve modelleme için doğru haritayı seçmek önemlidir. Her durumda, ligand yoğunluğunu görselleştirmek için keskinleştirilmiş ve ağırlıklı bir harita yerine keskinleştirilmemiş ve ağırlıklandırılmamış bir harita veya yarım harita tavsiye edilir, çünkü keskinleştirme ve ağırlıklandırma haritada az keskinleştirilmiş veya aşırı keskinleştirilmiş (seri sonlandırmadan kaynaklanan gürültü) bölgelere neden olabilir. Bu, optimal olmayan bir ligand yoğunluğuna neden olabilir ve Coot'ta model oluşturma sırasında yoğunluğu değerlendirmek için farklı B-faktörü keskinleştirmenin kullanılması kullanılabilir. Bir cryoEM haritasında ligandları tanımlamak için keskinleştirilmiş haritanın kullanılmasında bir risk olmasına rağmen, keskinleştirilmemiş harita ligand yoğunluğunun tam detayını göstermeyebilir, ancak Şekil 1B, C'de gösterildiği gibi gösteri amacıyla kullanılabilir.
Modellenen ligandın pozu, özellikle verilerin zayıf olduğu durumlarda doğrulanmalıdır. Burada mGlu5 için gösterildiği gibi, yerel çözünürlük cryoEM haritası boyunca değişir ve ligandın tarafsız modellemesi zor olabilir. Servalcat, protein ve ligand modellemesindeki potansiyel yanlışlıkları tespit etmek için değerli bir araç olarak kullanılabilir22.
Bileşimsel heterojenlik, yalnızca belirli bir popülasyonun ligandın mevcut olabileceği bir protein-ligand kompleksinde mevcut olabilir (ligand düşük moleküler ağırlığa sahipse, sınıflandırma adımı heterojenliği ortadan kaldırmayabilir). Bununla birlikte, ligand modellemesinden önce görüntü işleme sırasında 3D sınıflandırma63 adımını yinelemeli olarak gerçekleştirmek ve ligandın yoğunluğunun iyileşip iyileşmediğini doğrulamak önemlidir. Proteinin birden fazla kopyası mevcutsa, ilk model oluşturma ve iyileştirme sırasında harita boyunca simetri uygularken dikkatli olunmalıdır, çünkü bu, simetri ile ilgili tüm moleküllerdeki ligand yoğunluğunun ortalamasını alabilir. Simetri, yalnızca tüm protein zincirlerinde ligand yoğunluğunun varlığını doğrulamak için harita kapsamlı bir şekilde incelendikten sonra uygulanmalıdır.
Duruma (kristal veya çözelti) ve konuma (gömülü veya yüzey) bağlı olarak, atomlar dinamik olabilir ve model iyileştirmede buna atomik yer değiştirme parametresi (ADP) denir. Modeldeki olası yanlışlıklara görsel ipuçları sağlayan fark haritası ile birlikte, ADP değerleri, 64,65,66,67 iyileştirmesinden sonra ligandların doğruluğunu değerlendirmek için kullanılabilir. Tipik olarak, ligand, çevredeki kalıntılarla benzer ADP değerlerine sahip olmalıdır, yani kararlı bir şekilde bağlanmış ve doğru bir şekilde modellenmişse. Bununla birlikte, makromoleküllerden uzak olan bir ligandın çevresindeki ligandlar veya atomlar (lipitler gibi) daha yüksek ADP değerlerine sahip olabilir. Koordinatların iyileştirilmesine ek olarak, hem Refmac33,34 hem de Phenix,ADP değerlerinin 28,68 iyileştirilmesine izin verir. Refmac'ta, harita hesaplaması sırasında tek tek atomların elektron saçılma faktörünü hesaplamak için Mott-Bethe yaklaşımı kullanılır. Phoenix'in son versiyonunda, atom bozukluğunu açıklamak için kristalografiye benzer bireysel B-faktörü iyileştirmesi tanıtıldı. Çok sık olarak, cryoEM'den türetilen rafine modellerde, çok çeşitli ADP değerleri gözlenir (bazen sıfıra yakın değerler) ve hatta EMDB'de modelin haritaya uyumunu değerlendirmek için kullanılan Q skoru, biriktirilen birincil haritaya ve B-faktörü keskinleştirmenin doğasınabağlıdır 60. CryoEM model oluşturmada, genellikle birden fazla harita kullanılır ve bu nedenle, modelleme ve iyileştirmede kullanılan haritalar, birçok makromoleküldeki anizotropik çözünürlük nedeniyle, tüm detayları açıklamak için tek bir harita yeterli olmayabileceğinden, yöntemlerde açıkça belirtilmelidir. 
Makromoleküllerdeki ligandların modellenmesinde, cryoEM haritalarının (kristalografide olduğu gibi) ana sınırlamalarından biri, ligand bağlanma bölgesinin düşük çözünürlüklü olması veya bağlı ligandın dinamik olması durumunda, doğru konformasyonu tespit etmenin zor olabileceğidir. Ek olarak, çoğu cryoEM yapısı 3 Å'nin altında çözünürlüğe sahiptir ve haritalarda su moleküllerinin temsili sınırlıdır, bu da hidrasyonun ligand veya ilaç bağlanmasındaki rolünü değerlendirmeyi zorlaştırır (burada enolaz ve mGluR örneklerinde gösterildiği gibi). Hesaplama yöntemleri, bu sınırlamaları ele almak için cryoEM verileriyle birlikte kullanılabilir69. Kristalografinin aksine, harita değil, yalnızca model iyileştirmeye tabi tutulur. Şu anda, bir ligandın varlığını göstermenin veya doğru modellemeyi sağlamanın tek yolu, atlama haritaları oluşturmaktır (Servalcat gibi araçları kullanarak). Bu nedenle, araştırmacıların modeli oluşturmasına ve değerlendirmesine yardımcı olacak bir dizi araç vardır, ancak model iyileştirmede yakın gelecekte daha yeni yaklaşımların veya mevcut yaklaşımların modifikasyonlarının beklenebileceği birkaç alan vardır.
Bu makalede, ligand yoğunluğunun manuel olarak incelenmesini, ligand geometri dosyasının oluşturulmasını ve ardından ligandın cryoEM haritasında modellenmesini içeren ligandların modellenmesi için mevcut yaklaşımlara odaklandık. Bu, yapısal biyoloji ve ilaç keşfinde heyecan verici bir dönemdir, çünkü daha hızlı kare hızlarına sahip doğrudan elektron dedektörleri ve daha hızlı veri toplamanın70 kullanılması , genellikle küçük moleküllü ligandlarla nispeten kısa sürede bağlanan birkaç makromolekülün yüksek çözünürlüklü haritalarının (<2.8 Å) elde edilmesiyle sonuçlanmıştır. Schrödinger takımında GEMspot69 ve Rosetta takımında EMERALD17 gibi otomatik ligand modelleme araçlarının yakın zamanda piyasaya sürülmesi, deneysel kriyoEM verilerini hesaba katarken ligandın en olası bağlı pozunu bulmaya çalışan, bu süreci kolaylaştırma ve otomatikleştirme sözü veriyor. X-ışını kristalografisine benzer şekilde, küçük moleküllü ligandların bağlanma modlarının cryoEM ile tanımlanmasının, belki de tek bir günde iki veya daha fazla, gerçekçi bir olasılık haline geleceği öngörülmektedir.

Hücreler, sayısız kimyasal reaksiyonu aynı anda ve bağımsız olarak gerçekleştirerek işlevlerini yerine getirirler, her biri çevresel ipuçlarına yanıt olarak hayatta kalmalarını ve uyum sağlamalarını sağlamak için titizlikle düzenlenir. Bu, biyomoleküllerin, özellikle proteinlerin, diğer makromoleküllerin yanı sıra küçük moleküller veya ligandlar ile geçici veya kararlı kompleksler oluşturmasını sağlayan moleküler tanıma ile elde edilir1. Bu nedenle, protein-ligand etkileşimleri, protein ekspresyonunun ve aktivitesinin düzenlenmesini, substratların ve kofaktörlerin enzimler tarafından tanınmasını ve ayrıca hücrelerin sinyalleri nasıl algıladığını ve ilettiğiniiçeren biyolojideki tüm süreçler için temeldir 1,2. Protein-ligand kompleksinin kinetik, termodinamik ve yapısal özelliklerinin daha iyi anlaşılması, ligand etkileşiminin moleküler temelini ortaya çıkarır ve ayrıca ilaç etkileşimini ve özgüllüğünü optimize ederek rasyonel ilaç tasarımını kolaylaştırır. Protein-ligand etkileşimini incelemek için ekonomik ve daha hızlı bir yaklaşım, çok çeşitli küçük molekülleri sanal olarak tarayan ve bu ligandların hedef proteinlere bağlanma modunu ve afinitesini tahmin eden bir hesaplama yöntemi olan moleküler yerleştirmeyi kullanmaktır3. Bununla birlikte, X-ışını Kırınımı (XRD), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya elektron kriyomikroskopisi (cryoEM) ile belirlenen yüksek çözünürlüklü yapılardan elde edilen deneysel kanıtlar, bu tür tahminler için temel kanıtı sağlar ve belirli bir hedef için daha yeni ve daha etkili aktivatörlerin veya inhibitörlerin geliştirilmesine yardımcı olur. Bu makale, tekniğe yaygın olarak atıfta bulunulduğu için 'cryoEM' kısaltmasını kullanır. Bununla birlikte, doğru isimlendirmenin seçilmesi konusunda devam eden bir tartışma vardır ve son zamanlarda, numunenin kriyojenik sıcaklıkta olduğunu ve elektronlarlagörüntülendiğini belirtmek için kriyojeniknumune Elektron Mikroskopisi (cryoEM) terimi önerilmiştir. Benzer şekilde, cryoEM'den türetilen haritalar elektron potansiyeli, elektrostatik potansiyel veya Coulomb potansiyeli olarak adlandırılmıştır ve basitlik için burada cryoEM haritaları 5,6,7,8,9,10 kullanıyoruz.
XRD, protein-ligand komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapı tayininde altın standart teknik olmasına rağmen, son birkaç yılda Elektron Mikroskobu Veritabanında (EMDB)12,13 biriken Coulomb potansiyel haritalarının veya kriyoEM haritalarının dalgalanmasıyla gösterildiği gibi, çözünürlük devrimisonrası 11 kriyoEM ivme kazanmıştır14. Numune hazırlama, görüntüleme ve veri işleme yöntemlerindeki ilerlemeler sayesinde, kriyoEM kullanan Protein Veri Bankası (PDB)14 birikimlerinin sayısı 2010 ve 2020 yılları arasında %0,7'den %17'ye yükselmiştir ve 2020'de rapor edilen yapıların yaklaşık %50'si 3,5 şveya daha iyi çözünürlükte belirlenmiştir15,16. CryoEM, farmasötik endüstrisi de dahil olmak üzere yapısal biyoloji topluluğu tarafından hızla benimsenmiştir, çünkü esnek ve kristal olmayan biyolojik makromoleküllerin, özellikle membran proteinlerinin ve çoklu protein komplekslerinin, atoma yakın çözünürlükte çalışılmasına izin verir, kristalleşme sürecinin üstesinden gelir ve XRD ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için gerekli olan iyi kırınım kristalleri elde eder.
CryoEM haritasındaki ligandın doğru modellenmesi, moleküler düzeyde protein-ligand kompleksinin bir planı olarak hizmet ettiği için çok önemlidir. X-ışını kristalografisinde kullanılan, ligandı elektron yoğunluğu 17,18,19,20'ye sığdırmak veya inşa etmek için ligand yoğunluğunun şekline ve topolojisine bağlı olan birkaç otomatik ligand oluşturma aracı vardır. Bununla birlikte, çözünürlük 3 Å'den düşükse, bu yaklaşımlar daha az arzu edilen sonuçlar üretme eğilimindedir, çünkü tanıma ve oluşturma için bağlı oldukları topolojik özellikler daha az tanımlanmış hale gelir. Birçok durumda, bu haritalar düşük-orta çözünürlük aralığında, tipik olarak 3.5 Å-5 Å17 arasında belirlendiğinden, bu yöntemlerin ligandları cryoEM haritalarına doğru bir şekilde modellemede etkisiz olduğu kanıtlanmıştır.
CryoEM ile bir protein-ligand kompleksinin 3D yapı tayinindeki ilk adım, ligandın protein ile birlikte saflaştırılmasını (ligandın proteine yüksek bir bağlanma afinitesine sahip olduğunda) veya protein çözeltisinin ızgara hazırlığından önce belirli bir süre ligand ile inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, plazma ile temizlenmiş delikli bir TEM ızgarasına küçük bir numune hacmi yerleştirilir, ardından sıvı etan içinde hızlı dondurma ve son olarak bir kriyo-TEM ile görüntüleme yapılır. Yüz binlerce ila milyonlarca bireysel parçacıktan gelen 2D projeksiyon görüntülerinin ortalaması, makromolekülün 3 boyutlu (3D) Coulomb potansiyel haritasını yeniden oluşturmak için alınır. Bu haritalardaki ligandların ve çözücü moleküllerinin tanımlanması ve modellenmesi, harita boyunca anizotropik çözünürlük (yani, çözünürlük makromolekül boyunca aynı değildir), ligandın bağlı olduğu bölgedeki esneklik ve verilerdeki gürültü nedeniyle birçok durumda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. XRD için geliştirilen modelleme, iyileştirme ve görselleştirme araçlarının çoğu şimdi aynı amaçlar için cryoEM'de kullanılmak üzere uyarlanmaktadır 18,19,20,21. Bu makalede, ligandları tanımlamak, modeller oluşturmak ve cryoEM'den türetilen koordinatları iyileştirmek için şu anda kullanılan çeşitli yöntemlere ve yazılımlara genel bir bakış sunulmaktadır. Değişen çözünürlük ve karmaşıklığa sahip spesifik protein-ligand kompleksleri kullanılarak ligandların modellenmesinde yer alan süreçleri göstermek için adım adım bir protokol sağlanmıştır.
CryoEM haritalarında ligandların modellenmesindeki ilk adım, haritadaki ligand yoğunluğunun (protein olmayan) tanımlanmasını içerir. Ligand bağlanması proteinde herhangi bir konformasyonel değişikliğe neden olmazsa, protein-ligand kompleksi ile apo-protein arasındaki basit bir fark haritasının hesaplanması, ligandın varlığını düşündüren ekstra yoğunluk bölgelerini esasen vurgular. Bu tür farklılıklar hemen gözlemlenebilir, çünkü sadece iki harita gerektirir ve hatta ligandın mevcut olup olmadığını kontrol etmek için 3D iyileştirme işlemi sırasında ara haritalar bile kullanılabilir. Ek olarak, çözünürlük yeterince yüksekse (<3.0 Å), fark haritası, su moleküllerinin yanı sıra ligand ve protein kalıntıları ile etkileşime giren iyonların konumu hakkında da bilgi sağlayabilir.
Apo-protein haritasının yokluğunda, bağımsız bir araç olarak mevcut olan ve ayrıca Refmac iyileştirmesinin bir parçası olarak CCP-EM yazılım paketi 23,24'e ve CCP4 8.0 sürüm 25,26'ya entegre edilmiş olan Servalcat22'yi kullanmak artık mümkün. Servalcat, keskinleştirilmemiş yarım haritaları ve apoprotein modelini girdi olarak kullanarak bir FSC ağırlıklı fark (Fo-Fc) haritasının hesaplanmasına izin verir. Fo-Fc atlama haritası, deneysel harita (Fo) ile modelden türetilen harita (Fc) arasındaki eşitsizliği temsil eder. Modelde bir ligandın yokluğunda, deneysel EM haritasıyla örtüşen bir Fo-Fc haritasındaki pozitif bir yoğunluk tipik olarak ligandın varlığını gösterir. Buradaki varsayım, protein zincirinin haritaya iyi bir şekilde oturduğu ve kalan pozitif yoğunluğun ligandın yerini gösterdiğidir. Bununla birlikte, pozitif yoğunluğun, bir protein yan zincirinin yanlış döndürücüsü gibi modelleme hatalarından kaynaklanıp kaynaklanmadığını titizlikle incelemek önemlidir.
İkinci adım, mevcut kimyasal bilgilerden iyi tanımlanmış geometriye sahip ligandın kartezyen koordinat dosyasının elde edilmesini veya oluşturulmasını içerir. CCP4 monomer kütüphanesinde zaten mevcut olan standart ligandlar (örneğin, ATP ve NADP+), koordinat ve geometri dosyalarını monomer erişim kodları aracılığıyla alarak iyileştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bilinmeyen veya standart olmayan ligandlar için, geometri dosyalarını oluşturmak için çeşitli araçlar mevcuttur. Örneklerden bazıları arasında Phenix28'deki eLBOW27 - (elektronik ligand oluşturucu ve optimizasyon tezgahı), Lidia - Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Schrödinger paketi içindeki Glide'ın Ligprep32-a modülünde yerleşik bir araç bulunmaktadır. Ligand koordinat dosyası daha sonra hem deneysel cryoEM haritası hem de Coot'taki fark haritası tarafından yönlendirilen yoğunluğa yerleştirilir. Bunu, Phoenix28'de gerçek alan iyileştirmesi veya Refmac33'te karşılıklı iyileştirme takip eder. İyi bir grafik kartı ve yukarıda belirtilen yazılımla donatılmış bir Linux iş istasyonu veya dizüstü bilgisayar gereklidir. Bu programların çoğu çeşitli süitlere dahil edilmiştir. CCP-EM24 ve Phenix28, akademik kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir ve Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, vb. dahil olmak üzere bu makalede kullanılan çeşitli araçları içerir. Benzer şekilde, Chimera37 ve ChimeraX38 akademik kullanıcılara ücretsiz lisanslar sağlar.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Çeşitli enstitülerin konsorsiyumu</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>Akademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot ve X-ışını kristalografisi için geliştirilen araçların listesini içerir</td></tr><tr>Çeşitli enstitülerin<td>ÇKP-EM</td><td>Konsorsiyumu</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>akademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot, Relion ve diğerlerini içerir</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>Model oluşturma için genel yazılım, ancak yukarıda açıklanan diğer süitlerle de mevcuttur</td></tr><tr><td>DockinMap (Phoenix)</td><td>Birkaç enstitünün konsorsiyumu</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Modeli cryoEM haritalarına yerleştirmek için Phoenix paketi içindeki yazılımlar</td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Veri Bankası&nbsp;</td><td>Çeşitli enstitülerden oluşan konsorsiyum</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Elektron Mikroskobu haritaları için Kamu</td></tr><tr><td>Deposu Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Ticari, Thermo Fisher'dan kamera&nbsp;</td></tr><tr><td>Phenix&nbsp;</td><td>Çeşitli enstitülerin konsorsiyumu</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>Akademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot</td></tr><tr><td>Protein Veri Bankası'nı</td> içerir <td>Çeşitli enstitülerin konsorsiyumu</td><td>https://rcsb.org</td><td>Makromoleküler yapıların halka açık veritabanı</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrödinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Moleküler görselleştirme aracı. Eğitim sürümü ücretsizdir ancak sınırlama ile birlikte gelir. Tam sürüm küçük bir ücret karşılığında edinilebilir.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, cryoEM</td><td>görüntü</td> işleme için Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html <td>Yazılımı, ayrıca CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios Thermo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Ticari, Thermo Fisher'dan kriyoTEM</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, ABD</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Görüntüleme, analiz ve daha fazlası için genel amaçlı yazılım</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, ABD</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Görüntüleme, analiz ve daha fazlası için genel amaçlı yazılım</td></tr></tbody></table>

ligandların elektron kriyomikroskopisinden türetilen haritalara modellenmesi

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Bir makromoleküler kompleksteki protein-ligand etkileşimlerinin deşifre edilmesi, moleküler mekanizmayı, altta yatan biyolojik süreçleri ve ilaç geliştirmeyi anlamak için çok önemlidir. Son yıllarda, kriyojenik örnek elektron mikroskobu (cryoEM), makromoleküllerin yapılarını belirlemek ve atoma yakın çözünürlükte ligand bağlanma modunu araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. CryoEM haritalarında protein olmayan moleküllerin tanımlanması ve modellenmesi, ilgilenilen molekül boyunca anizotropik çözünürlük ve verilerdeki doğal gürültü nedeniyle genellikle zordur. Bu makalede, okuyuculara, seçilen makromolekülleri kullanarak ligand tanımlaması, model oluşturma ve atomik koordinatların iyileştirilmesi için şu anda kullanılan çeşitli yazılım ve yöntemler tanıtılmaktadır. Enolaz enzimi ile gösterildiği gibi bir ligandın varlığını tanımlamanın en basit yollarından biri, ligandlı ve ligandsız elde edilen iki haritayı çıkarmaktır. Ligandın ekstra yoğunluğunun, daha yüksek bir eşikte bile fark haritasında öne çıkması muhtemeldir. Metabotropik Glutamat reseptörü mGlu5 durumunda gösterildiği gibi, bu kadar basit fark haritalarının oluşturulamadığı durumlar vardır. Yakın zamanda tanıtılan Fo-Fc atlama haritasını türetme yöntemi, ligandın varlığını doğrulamak ve göstermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Son olarak, iyi çalışılmış β-galaktosidaz örnek olarak, çözünürlüğün cryoEM haritalarında ligandların ve çözücü moleküllerinin modellenmesi üzerindeki etkisi analiz edilmekte ve cryoEM'nin ilaç keşfinde nasıl kullanılabileceğine dair bir bakış sunulmaktadır.

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Hücre boyunca, özellikle zar arayüzünde meydana gelen fizyolojik süreçleri anlamakla ilgileniyoruz. Cryo-EM'yi ana teknik olarak kullanıyoruz ve çoklu makromoleküler kompleksleri inceleyerek çeşitli ilginç ve zorlu biyolojik problemler üzerinde çalışıyoruz. Zar proteinlerinin ve diğer kararsız komplekslerin yapılarını belirlemek birkaç on yıl önce zordu.Bununla birlikte, yeni bir deterjan ve lipid taklitçisi olan Cryo-EM'deki teknik gelişmeler ve sahip olunan donanımlar, bu komplekslerin hızlı yapı tayininin yolunu açmıştır. Bu yapılar artık yüksek çözünürlükte elde edilebilir ve potansiyel olarak ilaç keşfinde kullanılabilir. Tek parçacıklı Cryo-EM'deki zorluklar arasında kararlı ve homojen numune elde edilmesi, numunenin ince buza rastgele yönde gömülmesi, düşük sinyal-gürültü oranına sahip çok sayıda görüntünün işlenmesi ve 3D rekonstrüksiyon sırasında açısal yönelim ve sınıflandırmanın doğru bir şekilde belirlenmesi yer alır.Ligand protein komplekslerinin kriyo-EM haritalarındaki küçük moleküllerin tanımlanması ve modellenmesi, verilerdeki doğal gürültü ve izotropik ve düşük harita çözünürlüğü, numune heterojenliği ve ligand esnekliği nedeniyle zordur. Bu protokol, düşük ila orta çözünürlüklü Cryo-EM'de ligandları ve çözücü moleküllerini tanımlamak ve modellemek için adım adım bir kılavuzdur.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Biyomoleküler modellemede önemli bir beceri, proteinlerdeki aktif bölgelerin görüntülenmesi ve açıklamalarının gösterilmesidir. Bu teknik makromoleküler görselleştirme için dört popüler ücretsiz program kullanılarak gösterilmiştir: iCn3D, Jmol, PyMOL ve UCSF ChimeraX.

Moleküler Görselleştirme Freeware Kullanarak Bir Enzim Aktif Sitesini Modelleme

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Bu protokol, endojen lipitlerin alerjenlerden uzaklaştırılmasını ve termal tavlama ile birleştiğinde ters faz HPLC ile kullanıcı tarafından belirtilen ligandlarla değiştirilmesini açıklar. 31 P-NMR ve dairesel dikroizm, ligand çıkarma/yüklemenin hızlı bir şekilde onaylanmasına ve doğal alerjen yapısının geri kazanılmasına izin verir.

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Burada, mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük moleküllü kristallerin tozlarının hazırlanması için laboratuvarımızda geliştirilen prosedürleri açıklıyoruz.

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

Keşfedin küçük moleküllü ligandların kriyoelektron mikroskobisi haritalarına modellenmesini. Bu hesaplamalı yöntem, makromoleküler komplekslerin yapısını belirlemek ve ilaç keşfi için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek amacıyla kullanılır.

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Daha fazla video keşfet