Nematod Caenorhabditis elegans'ın Kemotaksisinde İlişkisel Öğrenmenin Ölçülmesi

Sinirbilimdeki en ilginç sorulardan biri, öğrenme hafızasının nöronların plastisitesinden nasıl ortaya çıktığıdır. Hem plastiklik hem de öğrenme yaşla azalır. Ancak bu düşüşün neden sorumlu mekanizmalarını araştırdığımız büyük ölçüde belirsiz.

Nematod model organizmaların nöritis elegans'ta kullanılması. C.elegans'ın neredeyse her davranışının bağlam ve deneyime bağlı olduğu ve diğer organizmalarla ilişkilendirilen ve ilişkilendirilmeyen öğrenme mekanizmalarını paylaştıkları açıkça ortaya çıkmıştır. C.elegans öğrenmesinin önemli belirleyicileri, örneğin sinir aktivitesi ve insülin sinyalasyonu, beynin ve hatta tüm organizmanın kaşıntı süreçlerinin düzenlenmesinde de rol oynamaktadır.

Temel teknoloji, kemotaksislerin bölünmüş Petri kaplarının mikroskoplarla incelenmesinde kullanılır. Ayrıca, Petri kabında gözlemlediğimiz davranışların ardındaki fizyolojik mekanizmaları görselleştirmek için takip yazılımlı kameralar ve yörünge takibi için özel yapımı davranış odaları ve mikrofluidiklerle kalsiyum görüntüleme kullanıyoruz. Şu anda C.elegans çevrim kemotaksis testleri gradyan plakalar veya dörtgen plakalar üzerinde yapılmıştır.

Gradient plakalar zamanla değiştiği için çalışmak zorlayıcı olabilir ve quadrant plakalar sadece iki farklı tuz konsantrasyonunu karşılaştırmak için kullanılmıştır. Bu yüzden bu Testte beyaz plakaların kullanımını tanıttık. Öğrenme yeteneğinin, ki bu da sinirsel plastisiteye bağlı olarak, yaşla birlikte neden azaldığını anlamak istiyoruz.

Kemotaksis testini kullanarak belirli sinyal yollarının bu düşüşten sorumlu olup olmadığını test etmeyi hedefliyoruz. Buna dayanarak, yaşa bağlı bilişsel geriliği hedefleyen tedaviler geliştirmeyi hedefliyoruz. Nematod büyümesini başlatmak için, canlı escherichia coli OP 50 ile beslenen orta burgu plakaları.

Tabağa Caenorhabditis elegans N 2 ekleyin ve nem kaybını en aza indirmek için gece boyunca 20 derece Celsius sıcaklığında ters tutun. Ertesi gün, 30 genç yetişkin Caenorhabditis elegans'ı nematod büyüme plakasına aktarın. Hayvanların yaklaşık sekiz saat boyunca 20 derece Celsius sıcaklıkta yumurta bırakmasına izin verin.

Zamanlanmış yumurta bırakmadan sonra, tüm yetişkin solucanları tabaktan çıkarın. Tabağı üç gün boyunca 20 derece Celsius'ta ters çevirin. Test için, istenen koşullandırma plakası gruplarının partisinin yarısını her plaka başına 200 mikrolitre OP 50 ile tohumlayın.

Tohumlanmış plakaların, tohumlanmamış plakaların yanında bir kuluçka makinesinde 20 derece Celsius'ta gece boyunca kurumasına izin verin. İstenilen konsantrasyonda bir litrelik sodyum klorür çözeltisi cam şişeye hazırlayın. Şişeleri 121 derece Celsius'ta 15 dakika otoklavla geçirin.

Sonra şişeleri 55 derece Celsius'ta su banyosunda 30 dakika soğut. Bu arada, YP ağaç çanak bölümünün altını ilgili sodyum klorür konsantrasyonuyla etiketleyin ve duvarların birleştiği plaka merkezinin etrafında beş milimetrelik bir yarıçap dairesi çizin. Her şişeyi tek tek ısıtmalı manyetik karıştırıcıya yerleştirin.

Her şişeye pH altı olan bir molyar potasyum fosfat çözeltisi 25 mililitre ekleyin. İki dakika iyice karıştırın. Sonra karıştırırken sıralı olarak kalsiyum klorür kolesterol ve magnezyum sülfat ekleyin.

Sonra, sıfır milimolar ortamı bir Y Petri kabının bir bölmesine aliquot yapın ve iç duvarın üstüne ulaşın. Ve ortamın yaklaşık beş dakika sertleşmesine izin verin. 100 milimolar ortamı Y Petri kabının ikinci bölmesine soku, bitişiğindeki sertleşmiş sıfır milimolar kesitle değene kadar koyun.

Sonra steril 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak y duvarı boyunca yüzey gerilimini kırın ve sıfır milimolar sodyum klorür bölümüne bağlayın. Medyumun beş dakika sertleşmesine izin verin. 50 milimolar ortamı, Y Petri kabının kalan bölmesine yerleştirin, ta ki sertleşmiş sıfır milimolar ve 100 milimolar kesitlere değene kadar.

Sonra steril 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak Y duvarındaki yüzey gerilimini kırın ve 50 milimolar sodyum klorür kesitini diğer iki bölüme bağlayın. Ortamın beş dakika sertleşmesine izin verdikten sonra, tabakları gece boyunca 20 derece Celsius'ta saklayın. Başlamak için bir mililitre steril M dokuz tamponu Caenorhabditis elegans içeren bir büyüme plakasına pipet yapın.

Plakayı nazikçe döndürerek OP 50 bakteriyel çimlerinden ve burgu askıdan kurtulmayı sağlar. Bir mililitrelik plastik pipet ucu ile üst kısmı kesilmiş şekilde M dokuz tamponda solucan süspansiyonunu toplamak için plakayı eğin. Süspansiyonu 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Solucanların mikro santrifüj tüplerinin dibinde yaklaşık 60 saniye boyunca yerleşmesini ve bir pelet oluşturmasını sağlayın. Sonra süpernatantı bir mililitrelik pipetle peleti rahatsız etmeden çıkarın. Pelleti bir mililitre steril M dokuz tampon ile iki kez yıkayın.

Kalan OP 50'yi kaldırmak için. Reese, pelleti 300 mikrolitre M dokuz tamponla askıya alır. Son yıkamadan sonra.

Süspansiyonu kurdakların eşit dağılımı için döndürün ve yaklaşık 200 ila 300 solucan içeren 50 mikrolitre solucan süspansiyonunu her bir kondisyon plakasına yavaşça aktarın. OP 50 ile tohumlanmış plakalar için, solucan damlasını bakteriyel gıda çimlerinden uzakta bırakın ve burguya emilmesini sağlayın. Plakaları 20 derece Celsius'ta bir kuluçka makinesinde dört saat boyunca ters tutun.

Kondisyondan sonra, steril M dokuz tamponu bir mililitre pipetleyin ve solucanları yerinden çıkararak süspansiyon oluşturacak şekilde nazikçe döndürün. Sonra plakayı eğip solucan süspansiyonunu toplayıp bir mililitrelik plastik pipet ucu kullanarak 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. 60 saniyede solucanlar sakinleşip bir pelet oluşturur.

Süpernatant çıkarıldıktan sonra, solucanları bir mililitre steril M dokuz tampon ile iki kez yıkayın. Sonra mikro santrifüj tüpünü bir mililitre işaretine kadar M dokuz tampon ile doldurun. Solucan pelleti oluştuğunda, pelleti rahatsız etmeden 960 mikrolitre süpernattan alın.

Şimdi tüpü hafifçe döndürün veya sallayın, böylece solucanlar tekrar süzülür. Yaklaşık 100 ila 150 solucan içeren bu süspansiyondan 20 mikrolitre, y duvar segmentlerinin birleştiği bir test plakasının merkezine aktarın. Solucanların 30 dakika boyunca 20 derece Celsius'ta dolaşmasına izin verin.

Sonra test plakasının her bölümündeki solucan sayısını sayın ve 30 dakika sonra tekrar sayın. Belirtilen formülü kullanarak plaka başına Kemotaksis indeksini hesaplayın. Vahşi tip Caenorhabditis elegans davranışı, farklı sodyum klorür seviyelerine sahip tabaklarda yemekli veya yiyeceksiz dört saatlik kondisyonla önemli ölçüde etkilenmiştir.

Test plakasında 30 dakika sonra, yüksek sodyum klorür konsantrasyonları ve besle kondisyonlandırılmış, sodyum klorür ve yiyecek içermeyen solucanlarda pozitif kemotaksis indeksi görüldü ve bu da daha yüksek sodyum klorür konsantrasyonlarına tercih edildiklerini gösteriyordu. Buna karşılık, yüksek sodyum klorür konsantrasyonları ve gıda olmadan, orta derecede sodyum klorür konsantrasyonları, yiyecekler olmadan ve sodyum klorür içermeyen solucanlarda negatif kemotaksis indeksi gösterildi ve bu da daha düşük sodyum klorür konsantrasyonlarını tercih ettiğini gösteriyordu. Sodyum klorür Gıda Derneği, Kemotaksis indeksi ile 60 dakika sonra da devam etti; bu genellikle yiyeceklerle koşullandırılmış solucanlarda değişiyor, hayvanlar dolaşırken ve yiyecek ararken bu ilişkiyi güncelledikçe dinamik ilişkilendirilme işaret ediyor.