Populus trichocarpa kabuğunun endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyomlarının kantitatif değerlendirmesi için bir iş akışı

[Sunucu] Populus trichocarpa kabuğunun endofitik ve epitetik bakteriyel mikrobiyomlarının kantitatif değerlendirmesi için bir iş akışı. Burada, Populus trichocarpa'nın kabuğunun iç dokularını veya yüzeylerini kolonize eden mikrobiyomu incelemek için ayrıntılı bir iş akışı tasarladık ve test ettik. Bu iş akışı, Populus trichocarpa'nın kabuğunun endofitik ve epitetik mikrobiyomlarının örneklenmesini, toplanan materyallerin işlenmesini, genomik DNA'nın ekstraksiyonunu, hedef bölgelerin PCR amplifikasyonunu, DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını ve yeni nesil dizileme teknolojisi ile endofitik ve epitetik bakteriyel mikrobiyomların dizilenmesini ayrıntılı olarak açıklar. Ayrıca elde edilen sıralama verileri için kısa bir analitik prosedür sunuyoruz. Bu kanıtlanmış iş akışı, Populus trichocarpa ve diğer ormancılık türlerinin kabuğunun endofitik ve epitetik mikrobiyom topluluklarını ampirik olarak araştırmak için etkili bir yaklaşım sağlayacaktır. Üç aylık Populus trichocarpa fidanlarını bir büyüme odasında büyütün, Populus trichocarpa'nın 10 santimetre uzunluğundaki gövde segmentlerini sterilize edilmiş bir budayıcı kullanarak sterilize edilmiş toprak yüzeyinin iki ila 12 santimetre yukarısından kesin. Gövde segmentlerini sterilize edilmiş bir kare Petri kabına yerleştirin. Sterilize edilmiş kare Petri kabı üzerindeki sapın epidermisini% 0.1 oranında steril pamuk kullanarak tekrar tekrar silin. Ara 20. Mikroorganizma içeren her bir pamuk parçasını, epitetik numuneleri eksi 80 santigrat derecede steril 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın. Gövde yüzeyini sildikten sonra, kabuğu steril bir neşter ile kesin, kabuğunu soyun ve kare bir Petri kabına yerleştirin. Gövdeden sıyrılan kabuğu steril bir neşter ile yaklaşık bir santimetrelik segmentlere kesin. Segment yüzeylerini iki dakika% 70 alkole batırarak sterilize edin ve ardından segmentleri% 0.1, Tween 80 ile beş dakika sodyum hipoklorit içinde bekletin. Son olarak, segmentleri 30 saniye boyunca% 70 alkolle sterilize edin. Daha sonra tüm numuneleri steril damıtılmış su ile üç kez yıkayın ve havayla kurutma için temiz bir tezgah üzerine koyun. Her sterilize edilmiş kök kabuğu endofitik örneğini eksi 80 santigrat derecede steril iki mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın. Gövde kabuğu bölümlerini steril beş mililitrelik sert tüplere yerleştirin ve her tüpe üç sterilize çelik boncuk ekleyin. Numuneleri içeren sert tüpleri sıvı nitrojen içinde 10 dakika dondurun. Kabuk örneklerini bir boncuk çırpıcı ile beş dakika boyunca ezin. Daha sonra sert tüpü tekrar sıvı nitrojen içinde bir dakika dondurun ve boncuk çırpma adımını beş dakika boyunca tekrarlayın. Populus trichocarpa'nın ezilmiş gövde kabuğunu ve her biri 0.25 gram olan pamuğa yapışmış epitetik bakteri topluluklarını boncuk tüplerinin her birine ekleyin ve ardından ticari bir kit tarafından sağlanan 60 mikrolitre C1 çözeltisi ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. Daha sonra, endofitik ve epitetik numuneleri bir dakikalık dört çalışmada bir boncuk çırpıcı kullanarak homojenize edin. Her çalıştırmadan sonra numuneleri 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri bir dakika boyunca yerçekiminin 10.000 katında santrifüjleyin, üreticinin talimatlarını izleyerek bir kit kullanarak endofitik ve epitetik örnekleri çıkarın, beyaz filtre zarının ortasına 30 mikrolitre C6 çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında yerçekiminin 10.000 katı sıcaklıkta bir dakika santrifüjleyin. Mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak epitetik ve endofitik örneklerden ekstrakte edilen genomik DNA'nın konsantrasyonlarını ölçün. PCR amplifikasyonu için DNA şablonunu elde etmek için her DNA örneğini steril ddH2O ile mikrolitre başına iki nanograma seyreltin. Bakteriyel 16S rRNA geninin V5 ila V7 bölgesini, ileri primer 799F ve ters primer 1193R kullanarak amplifiye edin. Bu arada, ileri primer 5115F ve ters primer 806R kullanarak bakteriyel 16S rRNA geninin V4 bölgesini amplifiye edin. Her numuneyi iyice karıştırın ve kabarcıkları gidermek için santrifüjleyin. Bir termal döngüleyici üzerinde bakteriyel 16S rRNA genlerinin V5 ila V7 veya V4 bölgesinin amplifikasyonunu gerçekleştirin. Her numune Amplicon'undan beş mikrolitre litre %1'lik bir Agaroz jeli üzerine yükleyin ve 30 dakika boyunca 120 voltta elektroforez gerçekleştirin. Başarılı PCR amplifikasyonunu doğrulamak için jeli UV ışıkları altında görüntüleyin. Her numune için, PCR amplifikasyon ürünlerinin üç kopyasını bir PCR tüpünde karıştırın. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanarak güçlendirilmiş ürünlerin konsantrasyonunu belirleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresansı ölçün. Standart bir DNA eğrisi çizin ve bunu amplifiye edilmiş ürünlerin DNA konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanın. Ölçülen konsantrasyonlarına göre, Amplicon kütüphanesini oluşturmak için Populus trichocarpa kabuğundan elde edilen endofitik veya epifitik örneklerin elde edilen PCR ürünlerini eşit konsantrasyonda karıştırın. Elektroforez aparatı kullanarak Agaroz jel elektroforezini gerçekleştirin. Kısaca% 1.3 Agaroz jeli, 1.3 gram Agaroz tozu 100 mililitre bir kez TAE tamponunda hazırlayın. Jel katılaştıktan sonra tarakları çıkarın ve jeli bir kez TAE tamponu olan bir elektroforez tankına yerleştirin. Daha sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre merdiven yüklenmiş olarak her bir PCR ürününün beş hacim birimine altı kez turuncu yükleme tamponundan oluşan bir hacim birimi ekleyin. Bir kuyucuğa 30 mikrolitre DNA merdiveni ekleyin. Pozitif ve negatif kabloları bağladıktan sonra, 50 dakika boyunca 80 volt elektroforez yapın. Temiz, keskin bir neşter kullanarak Agarozlu jelden DNA parçalarını çıkarın. Jel dilimini tartın ve renksiz bir tüpe aktarın. Jel dilimini daldırmak için tampon ekleyin. Üreticinin talimatlarını izleyerek jel ekstraksiyon kitini kullanarak jel ekstraksiyonu gerçekleştirin. Saflaştırılmış Amplicon kitaplığının bir florimetre üzerindeki konsantrasyonunu, üreticinin sıralama profili oluşturma protokolünü izleyen ticari bir kit kullanarak belirleyin. Bir florimetre kullanarak standart ve numune tahlil tüplerini okuyun ve tek bir bandı görselleştirerek kitaplığın kalitesini onaylayın. CHAM II'yi kullanarak 16S rRNA gen dizilerini analiz edin ve açıklama ekleyin. Referans dizilerine göre Silver Database'i kullanarak taksonomik ek açıklamalar yapın. Bu sonuçları R'deki ggplot2 paketini kullanarak görselleştirin. Populus trichocarpa kabuğunun endofitik ve epitetik bakteriyel mikrobiyomlarının yüksek kaliteli genomik DNA'sı elde edildi. 12 numunenin tümünün PCR amplifikasyonu, doğru boyutta tek güçlü bantlar verdi. Amplicon kütüphanesi, ön sıralama gereksinimlerini karşılayan tek bir tepe noktası ile daha da inşa edildi. Endofitik mikrobiyomlar için, sırasıyla 799F / 1193R ve 515F / 806R primer çiftleri kullanılarak yüksek kaliteli okumalar elde edildi. 799F/1193R astar çifti, önemli ölçüde daha az güçlendirilmiş bitki okuması sağladı. Populus trichocarpa kabuğunun epitetik mikrobiyomundan elde edilen ASV'lerin sayısı, 799F/1193R kullanıldığında 515F/806R primerlerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. Shannon İndeksi'nin, kabuğun epifitik bakteri topluluğunda, 799F / 1193R primer çifti kullanılarak endofitik bakteri topluluğuna göre daha düşük olduğu tahmin edilmiştir. Populus trichocarpa'nın endofitik ve epifitik kabuk kısımlarındaki bakteri topluluklarının taksonomik özellikleri, 799F/1193R primer çifti kullanılarak daha fazla araştırılmıştır. Populus trichocarpa'nın kabuğunun endofitik ve epitetik bakteriyel mikrobiyomlarının bileşimini ve çeşitliliğini ölçmek için numune toplamadan veri analizine kadar güvenilir ve verimli bir iş akışı oluşturulmuştur. Protokolümüz, odunsu bitki türlerinin kabuk mikrobiyomunu incelemek için bir yol görevi görebilir ve diğer odunsu bitkilerde yaşayan bakteri topluluklarının özelliklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.