Name: Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: Öğrenin maya iki-hibrit testi ile etkileşim-boş mutantları izole etme yöntemini. Hücre döngüsü düzenlemesinde siklin bağımlı kinazların rolünü anlamak için kullanılan bu teknik, protein etkileşimlerini incelemeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Y. Tanaka, Y2H'nin teknik iyileştirmesini gerçekleştirdi. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Hibe Numarası JP22K06336 ve Osaka Fermantasyon Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.

1. Mutant kütüphanesinin inşası
<ol><li>Polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) ayarlayın (aşağıda bir örnek gösterilmiştir). Genel olarak, 5 μL'lik on alikota bölünmüş 50 μL'lik reaksiyonu hazırlayın ve hedef gen fragmanını bir PCR makinesinde4 çoğaltın. NOT: Kullanıcılar, mutasyonları verimli bir şekilde tanıtmak için uygun bir polimeraz seçmelidir. Amplifiye edilecek DNA fragmanı kısaysa, düzeltme okuma aktivitesinden yoksun olan Taq polimeraz gibi daha yüksek hata oranına sahip bir polimeraza ihtiyaç vardır. Amplifiye edilecek DNA fragmanı uzunsa, mutasyon sayısını azaltmak için daha yüksek kaliteli bir polimeraz gerekir. Mutasyonlar, düzenli Taq polimeraz4 ile 30 döngü amplifikasyondan sonra her birkaç yüz baz çiftinde bir meydana gelir. Temsili sonuçlarda, normal Taq polimerazdan daha yüksek sadakate sahip farklı bir Taq polimeraz kullanıldı (Malzeme Tablosuna bakınız) ve mutasyon oranı 600 baz çiftinde birdi. PCR karışımlarının, primer detaylarının ve reaksiyon koşullarının bir örneği Ek Dosya 1'de verilmiştir.</li>
	<li>PCR tamamlandığında, reaksiyonun tüm alikotlarını birleştirin, ilgilenilen DNA fragmanlarının agaroz jel elektroforezi vb. kullanılarak amplifiye edildiğini doğrulayın ve DNA5'i saflaştırın.</li>
	<li>Adım 1.2'de oluşturulan DNA parçasını 'kesintisiz' bir klonlama stratejisi kullanarak uygun Y2H vektörü ile birleştirin (Şekil 1). NOT: Gibson assembly6 gibi dikişsiz klonlama sistemi, kendi kendine ligasyon yoluyla üretilen boş vektörler tarafından oluşturulan oluşturulmuş mutant kitaplığın kirlenmesini en aza indirir. Y2H vektörlerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir. Montajdan önce BamHI sindirimi ile hazırlanabilirler. Tüm plazmitler Ulusal BiyoKaynak Projesi'nden temin edilebilir - maya (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Adım 1.3'te üretilen reaksiyon karışımını, yüksek verimli bir E. coli transformasyon protokolüne göre hazırlanan Escherichia coli yetkin hücrelerine ekleyin (örneğin, Inoue ve ark.7). Tüm yetkili hücreleri, uygun antibiyotikler içeren birkaç LB plakasına (%1 tripton, %0.5 maya özütü, %1 NaCl ve %2 agar) yayın (bkz. Bu noktada, kütüphane titresini hesaplamak için aynı seçim plakasına küçük bir miktar (toplam reaksiyonun ~ 1 / 100'ü) yayın. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Çok sayıda E. coli kolonisi ortaya çıktığında, tek kullanımlık bir plastik halka kullanarak tüm hücreleri plakanın yüzeyinden kazıyın. Alkalin lizis8 gibi popüler yöntemleri kullanarak bu hücrelerden plazmit DNA'yı kurtarın. Aynı zamanda, dönüşüm karışımının küçük alikotlarını plaka üzerine yaydıktan sonra ortaya çıkan koloni sayısını sayın. Bu sayıyı kullanarak, kitaplıktaki toplam bağımsız klon sayısını tahmin edin. NOT: Bu noktada, dönüşüm reaksiyonunun küçük alikotlarının yayıldığı plaka üzerinde görünen birkaç bağımsız koloniyi (4-6) alın, bunları ayrı ayrı kültürleyin ve hemen hemen tüm klonların istenen DNA parçalarını taşıdığını doğrulamak için plazmitleri bunlardan izole edin5. Plazmitleri E. coli'den izole etmek için birçok ticari kit mevcuttur. Küçük alikotlar yayıldıktan sonra plaka üzerinde görünen koloni sayısı manuel olarak sayılabilir.</li>
	<li>Kütüphane DNA havuzunun konsantrasyonunu ölçün. Genellikle, birkaç yüz nanogram kütüphane DNA'sı, bir sonraki adımda birkaç bin dönüştürücü elde etmek için yeterlidir. NOT: DNA konsantrasyonunun DNA'ya bağlanan bir floresan boya kullanılarak ölçülmesi önerilir, çünkü A260 ölçümü genellikle yanlıştır.</li>
</ol>2. Mutant kütüphane ve replika kaplama ile mayanın dönüşümü
<ol><li>Mutant kütüphaneyi konakçı maya suşuna (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) yaklaşık 100 ng DNA kullanarak Y2H testi için. Konakçı hücreleri 'yem' plazmidi ile önceden dönüştürün.<ol><li>Dönüşüm işleminden sonra, maya hücrelerini steril suda askıya alın ve uygun plakalara farklı miktarlarda alikotlar yayın (genellikle lösin ve triptofan içermeyen SC ortamı: SC-LW [% 0.67 maya azot bazı,% 2 glikoz, 1.546 g / L SC çift bırakma karışımı -Leu -Trp ve% 2 agar, Malzeme Tablosuna bakınız]). Bu plakaları gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. NOT: ~5 × 106 logaritmik olarak büyüyen hücrelere sahip lityum asetat-PEG yöntemi11 gibi standart protokol, mayanın dönüşümü için yeterlidir. Elektroporasyon gibi yüksek dönüşüm verimliliğine sahip başka bir yöntem de kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ertesi gün, küçük koloniler ortaya çıktığında, uygun sayıda hücreye (500-2000) sahip plakaları seçin ve bunlardan aşağıdaki gibi kopyalar yapın.</li>
	<li>Birkaç kopya yapmak için bir çoğaltma bloğuna iki yaprak filtre kağıdı yerleştirin (ortam SC-LW ve kanamisin içeren SC-LW'dir) (Malzeme Tablosuna bakınız). 30 °C'de 1-2 gün inkübe edin. NOT: Kanamisin (G418) konsantrasyonu 600 μg/mL'dir. Replika kaplama için kadife kullanmayın çünkü kolonilerin çözünürlüğü kaybolacaktır.</li>
	<li>Koloniler büyüdükten sonra, plakaları karşılaştırın ve adayları seçin. Raporlayıcı olarak lacZ kullanılıyorsa bir Y2H renk tahlili yapın (bkz. adım 3). NOT: Y2H muhabiri için lacZ , zayıf bir etkileşimi tespit etmede genellikle HIS3'ten daha iyidir.</li>
</ol>3. Y2H renk tahlili
<ol><li>Adım 2 kullanılarak hazırlanan çoğaltma plakasına önceden uygun boyutta kesilmiş bir filtre kağıdı yaprağı yerleştirin. Filtre kağıdı ile plaka arasında hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin. NOT: No. 4A filtre kağıdı veya Grade 50 filtre kağıdı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). Replika kaplama ile yapılan herhangi bir SC-LW veya SC-LW kanamisin plakası içeren renk tahlili için kullanılabilir.</li>
	<li>Plakadaki filtre kağıdı tamamen nemlendiğinde (filtre kağıdının rengi tamamen değiştiğinde), üstüne birkaç yaprak kağıt havlu yerleştirin ve fazla nemi almak için filtre kağıdıyla temas etmesini sağlayın. Suyu emdiğinde ve renk değiştirdiğinde kağıt havluyu çıkarın. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Filtre kağıdının kenarlarını cımbızla alın, plakadan hızlıca soyun, sıvı nitrojene batırın ve dondurun. Sıvı nitrojen yoksa, filtre kağıdını koloni tarafı yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye koyun ve tamamen donması için hemen bir dondurucuya (-20 °C ila -80 °C) koyun.</li>
	<li>Donmuş filtre kağıdını çıkarın ve koloni tarafı yukarı bakacak şekilde çözülmesi için kuru bir kağıt havlu üzerine koyun. Çözüldükten hemen sonra, filtre kağıdını, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde, plastik bir tepsi veya sızdırmaz bir kap üzerine yerleştirilmiş ve Z-tamponu ile ıslatılmış başka bir filtre kağıdına yerleştirin (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl ve 1 mM MgSO4, pH 7.0) X-gal (5-bromo-5-kloro-3-indolil-β-D-galaktozit) ve 2-merkaptoetanol9 içeren (bkz.). Üst ve alt filtre kağıtları arasında hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.</li>
	<li>Filtre kağıdını içeren plastik tepsiyi kapatın ve hava geçirmez bir kaba veya plastik torbaya koyun. Hava geçirmez kabı veya plastik torbayı kapatın ve mavi bir renk görünene kadar 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Mavi bir renk göründüğünde, filtre kağıdını koloni tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir plastik tepsiye yerleştirilmiş yaklaşık 500 μL durdurma çözeltisinin (1 M Na2CO3) üzerine yerleştirin. Durdurma çözeltisi hızla emilir; Bu nedenle, filtreyi hemen çıkarın, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde taze bir kağıt havlu üzerine koyun ve kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Kağıt havlu değiştirildikten ve filtre yeterince kuruduktan sonra, verileri yakalamak için bir tarayıcı veya başka bir cihaz kullanın.</li>
</ol>4. Aday klonların kurtarılması ve onaylanması
<ol><li>Replikanın orijinal plakasından (veya renk tahlili için kullanılmayan replika plakadan) beyaz ve Kan R aday klonlarını seçin. Örnekler Şekil 1C'de gösterilmiştir. Kanamisin içeren SC-LW ortamı üzerinde küçük bir yama olarak yeniden çizerek ve 30 ° C'de 1-2 gün inkübe ederek aday klonların beyaz ve KanR olduğunu onaylayın. En az iki set yapın veya ertesi gün tekrarlar yapın. NOT: Beyaz koloniler seçilmelidir çünkü soluk mavi koloniler etkileşimi koruyabilir.</li>
	<li>Aday klonlar iyi bir şekilde yeniden büyüdükten sonra, renk tahlilini adım 4.1'de oluşturulan en az bir plaka ile adım 3'te açıklandığı gibi tekrarlayın ve beyaz kaldıklarını ve maviye dönmediklerini onaylayın (Şekil 2A). NOT: Adayları yeniden çizerken, büyük miktarda hücre taşımayın. Çok fazla hücre, KanR ve KanS klonlarını ayırt etmeyi imkansız hale getirir.</li>
	<li>Plaka kalıntılarından hala beyaz olan ve adım 4.2'de üretilen KanR klonlarını alın ve bunları 30 ° C'de gece boyunca 1 mL seçim ortamında (kütüphane yapımı için hangi vektörün kullanıldığına bağlı olarak SC-L veya SC-W) bağımsız olarak büyütün.</li>
	<li>Kültürü bir mikrotüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın (~ 15.000 × g, oda sıcaklığında 10-30 saniye). Tüm DNA'yı hücre peletinden aşağıdaki gibi izole edin.</li>
	<li>Hücre peletini 400 μL lizis tamponunda (%2 Triton X-100, %1 SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) ve 1 mM EDTA) her biri 1 μL 2-merkaptoetanol ve 20 mg / mL Zymolyase 100T içeren süspansiyon yapın ve hücre duvarlarını sindirmek için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bu sırada, her 5-10 dakikada bir tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu opak veya yarı saydam hale geldiğinde, eşit hacimde fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) karışımı ekleyin ve 10-20 saniye orta hızda girdaplayarak iyice karıştırın.</li>
	<li>Mikrotüpleri bir mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca tam hızda (oda sıcaklığında ~ 15.000 × g) santrifüjleyin ve yeni bir mikrotüpte DNA içeren sulu fazı geri kazanın. 0.8 hacim izopropanol ekleyin ve tüpü ters çevirerek iyice karıştırın.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında 2-3 dakika bırakın ve daha sonra DNA'yı çökeltmek için tam hızda (oda sıcaklığında ~ 15.000 × g) 4-5 dakika bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve çökeltiyi yaklaşık 500 μL% 70 etanol ile yıkayın. Etanolü tamamen çıkarın ve çökeltiyi kısa bir süre kurutun.</li>
	<li>Çökeltiye 20 μL TE tamponu (10 mM Tris-Cl (8.0) ve 1 mM EDTA) ekleyin, kısaca karıştırın ve çökeltiyi çözmek için tüpü gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. NOT: Kullanıcıların acelesi varsa, tüpleri 37-50 °C'de tutun. DNA çökeltisi birkaç saat içinde çözülür.</li>
	<li>Pelet tamamen çözüldüğünde, E. coli'yi bu DNA çözeltisinin küçük bir miktarı ile dönüştürün. NOT: Yüksek transformasyon verimliliğine sahip E. coli kullanılıyorsa yaklaşık 0.5 μL DNA çözeltisi yeterlidir.</li>
	<li>E. coli kolonileri ortaya çıktığında, birkaç bağımsız koloni seçin, onları kültürleyin ve alkalen lizisi gibi standart yöntemlerle plazmitleri geri kazanın.</li>
	<li>Adım 4.12'de elde edilen plazmit DNA'sını, yem plazmidini barındıran Y2H konak hücrelerine sokun. Transformatörler ortaya çıktığında, bunları renk tahlili (beyaz görünmelidirler) ve batı lekesi4 (istenen boyutta bir proteini ifade etmelidirler) ile kontrol edin. NOT: Alkali sonrası yöntem12 , mayadan tam hücre özü hazırlamanın kolay ve hızlı bir yoludur.</li>
	<li>Yukarıdaki iki kriter karşılanırsa, klonların mutasyon bölgesini nükleotid dizilimi4 ile belirleyin.</li>
</ol>

Maya İki-Hibrit Tekniği Kullanılarak Biyomoleküler Etkileşim Çalışmaları 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
<li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null%2Fimpaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+4th+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu makale, Y2H testi kullanılarak etkileşim boş/bozulmuş mutantların nasıl izole edileceğini açıklamaktadır. Bu tür mutantlar, ilgilenilen bir proteinin işlevini analiz etmek için güçlü araçlardır. Bu tür mutantları izole etmek için, rY2H testleri daha önce Y2H konak suşu 2,3 modifiye edilerek geliştirilmiştir. Ancak, emek miktarını büyük ölçüde azaltmadılar. Buna karşılık, mutantlar bu yöntemle önemli miktarda emek harcamadan izole edilebilir. Bu yöntemde, Y2H v...

Biyomoleküller arasındaki etkileşimler, biyolojik olayların en temel parçasıdır. Protein-protein etkileşimleri bu etkileşimlerin önemli bir bölümünü oluşturur. Bu nedenle, ilgilenilen bir proteinin etkileşim ortağının/ortaklarının tanımlanması, ilgilenilen proteinin/genin işlevini daha fazla aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Maya iki-hibrit (Y2H) yöntemi, in vivo1 protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için popüler bir tekniktir. Bu sistemde, etkileşimi test edilecek olan iki protein (X ve Y) sırasıyla DNA bağlama (DB) alanına ve transkripsiyonel aktivasyon alanına (AD) kaynaştırılır. DB-X füzyon proteini, DB alanının bir tanıma dizisine bağlanır; bu nedenle, X ve Y proteinleri etkileşime girdiğinde, AD-Y füzyon proteini, tanıma dizisinin yakınına gelir. Sonuç olarak, tanıma dizisinin aşağı akışındaki raportör genin transkripsiyonu aktive edilir. Bu nedenle, raportör gen aktivitesinin varlığı veya yokluğu, protein-protein etkileşiminin varlığını veya yokluğunu belirlemek için kullanılabilir1.
İlgilenilen proteinin spesifik bir etkileşim ortağı belirlendikten sonra, etkileşimin biyolojik işlevini aydınlatmak için daha fazla analiz yapılmalıdır. Bu amaçla, spesifik protein-protein etkileşimini bozan veya ortadan kaldıran proteinlerin mutantları izole edilebilirse, güçlü araçlar olarak hizmet edeceklerdir. Y2H sistemi, vahşi tip 'etkileşim-pozitif' klondan başlayarak 'etkileşim-negatif' klonları tarayarak bu tür mutantları doğrudan izole etmek için kullanılabilir. Bu süreci hızlandırmak için 'ters' Y2H (rY2H) sistemleri geliştirilmiştir 2,3. rY2H sistemlerinde, konakçı maya suşları, raportör genler olarak karşı seçilebilir işaretleyici genleri barındırır, yani maya hücreleri yalnızca AD-Y ve DB-X proteinleri etkileşime girmediğinde büyür.
Hem Y2H hem de rY2H sistemleri, etkileşim negatif mutantların izolasyonuna izin verse de, mutantları izole etme süreci zahmetlidir çünkü tarama yoluyla elde edilen adayların tümü istenen mutasyon türünü (genellikle yanlış anlamlı mutasyonlar) taşımaz. En ciddi sorun, adayların önemli bir bölümünün çerçeve kayması veya saçma sapan mutasyonlar barındırması ve istenmeyen klonları dışlamak için batı blotlama yapmanın gerekli olmasıdır. Bu sorunun üstesinden gelmek için yeni plazmit vektörleri geliştirilmiştir4. Bu vektörlerde, bir ilaç direnci belirteci olan KanMX, DB alanının veya AD'nin aşağı akışında çerçeve dışı konumlandırılır. İşaretleyici gen, yalnızca ilgilenilen gen eklendiğinde DB alanı veya AD ile çerçeve içi hale gelir. İlgilenilen gende rastgele bir mutasyon (lar) ortaya çıktığında, çerçeve kayması veya anlamsız mutasyonlara sahip olanlar gibi istenmeyen mutantlar, ilaç direnci seçimi yapılarak kolayca elimine edilebilir ve arzu edilen yanlış anlamlı mutasyonları taşıyan adaylar Y2H ekranı4 ile kolayca tanımlanabilir. Bu makale, bu stratejiyi kullanarak ilgilenilen bir proteinin etkileşimi boş/bozulmuş mutantlarını izole etmek için bir protokol sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (8,0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>%10 SDS Çözümü</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimyasal A.Ş.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-kloro-3-indolil-&beta;-D-galaktopiranosid (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimyasal A.Ş.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin Sodyum</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimyasal A.Ş.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>Medikal & Biyolojik Laboratuvarlar Ltd. Şti.</td>Somon testislerinden <td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>DNA'sı</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>Koloni kaldırma için filtre kağıdı (Sınıf 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>Koloni kaldırma için filtre kağıdı (No.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>01411090</tr><tr><td>Çoğaltma için filtre kağıdı (No.1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>G-418 Sülfat</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimyasal A.Ş.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Asetat Dihidrat</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 ve boğa; 7H2O</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 ve boğa; 12H2O</td><td>Nacalai Tesque A.Ş.</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque A.Ş.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 ve boğa; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque A.Ş.</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol 25: 24: 1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid DNA'ları</td><td>Ulusal BiyoKaynak Projesi - maya (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmid izolasyon Kiti</td><td>Nippon Genetics Co., Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol # 4.000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC çift bırakma karışımı -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Dikişsiz klonlama kiti (In-Fusion montajı)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin Sülfat</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimyasal A.Ş.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraz (GoTaq Yeşil Master Karışımları)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hidroksimetil) aminometan</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>ThermoFisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Maya Azot Baz (YNB)</td><td>Orta</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein etkileşimleri, biyolojik olayların altında yatan en temel süreçlerden biridir. Spesifik bir protein-protein etkileşiminin rol(ler)ini ve fonksiyon(lar)ını anlamanın en basit ve en iyi yollarından biri, vahşi tipin fenotipini (ilgili protein-protein etkileşimi ile) ve ilgili etkileşimden yoksun mutantların fenotipini karşılaştırmaktır. Bu nedenle, bu tür mutantlar izole edilebilirse, ilgili biyolojik süreçlerin aydınlatılmasına yardımcı olacaklardır. Maya iki-hibrit (Y2H) prosedürü, yalnızca protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için değil, aynı zamanda etkileşimi sıfır/bozulmuş mutantları izole etmek için de güçlü bir yaklaşımdır. Bu makalede, Y2H teknolojisi kullanılarak etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmek için bir protokol sunulmuştur. İlk olarak, polimeraz zincir reaksiyonu ve boş vektörü kütüphaneden verimli bir şekilde dışlayan verimli dikişsiz klonlama teknolojisi birleştirilerek bir mutasyon kütüphanesi oluşturulur. İkinci olarak, etkileşim boş/bozulmuş mutantlar Y2H testi ile taranır. Y2H vektöründeki bir hile nedeniyle, çerçeve kayması ve saçma mutasyonlara sahip olanlar gibi istenmeyen mutantlar, tarama sürecinden verimli bir şekilde elimine edilir. Bu strateji basittir ve bu nedenle, etkileşimi iki hibrit sistem tarafından tespit edilebilen herhangi bir protein kombinasyonuna uygulanabilir.

Son zamanlarda, Pol2 proteininin C-terminal yarısının (Pol2-C) Mcm10 ile etkileşime girdiği bulundu. Her iki protein de DNA replikasyonunun başlatılması ve dolayısıyla tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae 13,14,15'te hücre büyümesi için gereklidir. Bu etkileşimin biyolojik önemini anlamaya yardımcı olmak için, Mcm10 ile etkileşimi olmayan/azalmış olan Pol2-C mutantları, burada açıklanan yöntem kullanılarak izole ...

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Ökaryotlarda hücre döngüsünün düzenleyici mekanizmalarını, özellikle DNA replikasyonu, kararlı mikrop bakımı ve hücre çoğalması arasındaki ilişkiyi anlamakla ilgileniyoruz. Hücre döngüsünün ilerlemesi, Ökaryotlarda sikline bağımlı kinazlar veya CDK'lar tarafından düzenlenir. DNA replikasyonunun başlatılması için durum budur.CDK'ların substratları üzerinde DNA replikasyonunu başlatmak için bir yol belirledik. İlgilendiğiniz proteinin işlevini anlamak için, vahşi tip ve mutantın karşılaştırılması doğrudan ve etkili bir yoldur. Maya iki-hibrit tahlili, basit bir tespit olup, etkileşim-boş mutantları izole etme sürecini geliştirecektir.Bu, alandaki araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunacaktır.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

MİT, geçici ve istikrarlı model organizma Saccharomyces cerevisiae ifade proteinler arasındaki etkileşimleri hassas algılama sağlar. Bu, yüksek kapasiteli bir şekilde etkileşim ortakları belirlemek amacıyla eksojen ve maya integral membran proteinleri çalışma başarıyla tatbik edilmiştir.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Bu video, belirli protein öz etkileşimlerini tespit etmek için maya iki hibrit testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen protein, β-galaktosidaz enzimini kodlayan bir transkripsiyon faktörünün iki alanına etiketlenir. İki protein etkileşime girdiğinde, bu, daha sonra bir biyokimyasal tahlil kullanılarak tespit edilen enzimi oluşturmak için transkripsiyon ve translasyona neden olur.

Maya Hücrelerinde Protein Kendi Kendine İlişkilendirmeyi Belirlemek için Maya İki Hibrit Testi

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Ketokonazol, Pregnane X Reseptörü (PXR) aktivasyonuna bağlanır ve antagonize eder. PXR mutantlarının maya yüksek verimli ekranları, ketokonazol bağlanması için benzersiz bir bölge tanımlar. Bu maya bazlı genetik yöntem, yüzey bağlanma bölgeleriyle ilişkili ligandlarla yeni nükleer reseptör etkileşimlerini keşfeder.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan &gt; 1000 TFs tek denemede.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Öğrenin maya iki-hibrit testi ile etkileşim-boş mutantları izole etme yöntemini. Hücre döngüsü düzenlemesinde siklin bağımlı kinazların rolünü anlamak için kullanılan bu teknik, protein etkileşimlerini incelemeye katkı sağlar.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Daha fazla video keşfet