Fototermal Rezonans Kılavuz Çekme Kullanılarak DNA Üç Köşeli Yıldız Motifi Kendi Kendine Montajın Yüksek Hızlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntülemesi
22 Mart 2024
Burada, görüntüleme parametrelerini optimize ettiğimiz, sistem sınırlarını belirlediğimiz ve üç noktalı yıldız DNA motifi montajını görüntülemedeki potansiyel iyileştirmeleri araştırdığımız fototermal kapalı rezonans dokunma (PORT) ile biyomoleküler etkileşimleri gözlemlemek için görüntüleme protokolünü gösteriyoruz.
Laboratuvarımızda nano ölçekli biyoloji için yeni ölçüm teknolojileri geliştiriyoruz. Özellikle, nanometre ölçeğinde dinamik biyolojik süreçleri incelemek için yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobunun geliştirilmesine odaklanıyoruz. Ve bunun için, yakın zamanda Fototermal Kapalı Rezonans Dokunma veya PORT adını verdiğimiz yeni bir görüntüleme modu geliştirdik.
Bu modda, konsolları yüksek hızda çok kontrollü bir şekilde harekete geçirmek için özel bir tahrik lazeri kullanıyoruz, bu da verileri ve geleneksel rezonans dışı dokunmaya göre iki büyüklük sırasına kadar daha hızlı almamızı sağlıyor. Yüksek hızlı AFM'de altın standart, rezonans modlu görüntülemedir. Bu modda, konsol bu rezonans frekansında çalıştırılır, bu da konsol konumunun kontrol edilemediği, sadece salınım genliği anlamına gelir.
Normal hızlı AFM için, kapalı rezonans modları giderek daha yaygın hale geliyor. Bununla birlikte, çalıştırma frekansı burada sınırlıdır, bu da bu görüntüleme modlarını oldukça yavaş hale getirir. Konsolu harekete geçirmek için ikincil bir lazer kullanarak, daha yüksek çalıştırma frekansları elde edebiliriz, bu da daha yüksek görüntüleme hızları anlamına gelir.
Bu yaklaşım, diğer rezonans dışı personel modlarıyla ilişkili avantajları korumamıza olanak tanır, bu da görüntüleme hassasiyeti ve hız arasındaki dengeyi optimize edebileceğimiz anlamına gelir. Görüntüleme hızımız en yüksek portre ile sınırlı. Portreyi artırmak istiyorsak, aynı çalıştırma genliğini korumak için lazer gücünü artırmamız gerekir.
Bu, zayıf kuvvet kontrolüne ve numunenin hasar görmesine neden olabilir. Konsolların boyutlarını küçülterek ve lazer absorpsiyon verimliliğini artırarak bant genişliğini artırmak, yeterli numune boşluğunu sağlarken daha yüksek port oranları elde etmemizi sağlayacaktır. Bu ilerleme, montaj dinamiklerinin karmaşıklıklarını incelemek için çok önemli olan daha hızlı görüntüleme hızlarını kolaylaştıracaktır.
Başlamak için konsolları temizleyin ve hazırlayın. Konsolları taramalı elektron mikroskobu veya SEM sistemi ile uyumlu bir tutucuya monte edin. Ardından, yeni ucu büyütmek için gaz enjeksiyon sisteminde kullanılacak öncü gazı ısıtın.
Vakum, negatif beş milibar gücünün 10'un altına ulaştığında, nozul hattında kalan havayı çıkarmak için gaz enjeksiyon hattını her biri iki saniye boyunca 10 kez boşaltın. Konsolun ucunu bulmak için SEM'i kullanın. Atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme için konsolu doğru şekilde hizalamak için tutucuyu belirli bir açıyla eğin.
Karbon nano ucun büyüyeceği konsol ucunun net bir şekilde görülebilmesi için SEM'in konumunu ve odağını ayarlayın. Ardından, yeni ucu büyütmek için yazılımdaki biriktirme parametrelerini ayarlayın. Öncü gazı enjekte ederken konsol ucundaki elektron ışınının radyasyonu ile ucu büyütmek için biriktirme işlemini başlatın ve biriktirme tamamlandığında gaz enjeksiyonunu durdurun.
Yarıçapı ve uzunluğu da dahil olmak üzere yeni büyüyen ucun kalitesini ve özelliklerini değerlendirmek için büyüme sonrası SEM görüntüleme gerçekleştirin. Tutucuyu SEM odasından çıkarın. Başlamak için, yüksek hızlı bir atomik kuvvet mikroskobu hazırlayın.
Konsol tutucusundaki yaylı klipsin altına ultra kısa bir konsol yerleştirmek için cımbız kullanın. Bir şırınga kullanarak, sol sıvı erişim portundan 50 mikrolitre sıvı ekleyin. Ardından, okuma lazerini konsol üzerinde hizalamak için AFM kafasındaki üç düğmeyi kullanın.
Toplamı en üst düzeye çıkarırken konsolun gölgesini beyaz bir kağıt üzerinde gözlemleyin. Ardından, iki özel düğmeyi kullanarak lazer noktasını foto diyot üzerinde ortalayın. Ardından, sürücü lazerini açmak ve hizalamak, konsolu harekete geçirmek ve salmak için uyarma VI'daki uyarma etkin kutusunu işaretleyin.
Konsol uyarma ve sapma sinyallerini bir osiloskopta görüntüleyin. Gölge yöntemini kullanın ve sürücü lazer ayar düğmeleri ile salınım genliğini en üst düzeye çıkarın. Bağlantı noktasındaki konsol salınım genliğini ayarlamak için, uyarma VI'daki konfigürasyon kutusundaki lazer diyot kontrol devresine bir DC voltajı ekleyin ve lazer diyot kontrol devresi için tepeden tepeye AC girişini girin.
Etkileşim eğrilerini elde etmek için Z denetleyici VI'yı temas moduna ayarlayın ve s'ye yaklaşmak için Başlat'a tıklayın.ampyüzey. Yüzeye ulaşıldığında, konsol sapma hassasiyeti kalibrasyonu için rampa VI'da bir kuvvete karşı mesafe eğrisi gerçekleştirin. Z piezo'yu ucun ulaşamayacağı yüzeyden geri çekmek için geri çek'e tıklayın.
Tamamen geri çekildikten sonra, Z denetleyici VI'da bağlantı noktası moduna geçin ve uyarma VI'da uyarma lazerini açın. Bağlantı noktası modunu istenen frekansa ayarlayın. Tahribatsız biyo-numune görüntüleme için çok önemli olan temas salınımından serbest salınım çıkarılarak net etkileşim eğrileri elde edildi. 100 kilohertz bağlantı noktası hızında, iyi görüntüleme kalitesi elde edildi.
Bununla birlikte, uyarma frekansı konsol rezonansına yaklaştıkça, geri besleme kontrolü bozuldu, bu da etkileşim eğrilerinin gizlenmesine ve görüntü kalitesinin düşmesine neden oldu. Başlamak için 10 milimolar bir magnezyum asetat çözeltisi hazırlayın. Bir Hamilton şırıngası kullanarak, konsol tutucunun akışkan kanalına 50 mikrolitre çözelti enjekte edin ve konsolu saran bir sıvı damlası oluşturun.
Tarama VI'daki tarama boyutunu 800 x 800 nanometre ve satır hızını 100 hertz olarak ayarlayın. Yüzeyi taramak için, kaliteyi kontrol etmek üzere çerçeve okuna tıklayın. Taramadan sonra, konsolu yüzeyden geri çekmek için Z denetleyicisi VI'da geri çek'e tıklayın.
Bir Hamilton şırınga kullanarak, tampon çözeltisini konsol tutucusundan çıkarın. Daha sonra seyreltilmiş bir DNA üç nokta yıldız çözeltisi hazırlayın ve bu çözeltiden 50 mikrolitre konsol tutucuya enjekte edin. 800 x 800 nanometre alanla 100 hertz varsayılan hat hızında görüntüleme gerçekleştirin.
İlk taramadan sonra, görüntüleme boyutunu ve hızını ayarlayın ve daha fazla veri toplama için VI'yı belirtilen değerlere tarayın Görüntüleme işlemi boyunca doğru izleme için Z denetleyici VI ayar noktası kutusundaki ayar noktası girişini gereken en düşük seviyede tutun. Gerekli tüm numune alanları için bunu tekrarlayın. Bu protokol kullanılarak, DNA üç noktalı yıldız motiflerinin kararlı adalara gerçek zamanlı montajı, yüksek hızlı port AFM tarafından gözlemlendi.
100 kilohertz bağlantı noktası hızı için 100 ve 200 hertz hat hızlarında net görüntüler elde edildi. Ancak, bağlantı noktası hızlarını artırmadan daha yüksek görüntüleme hızları, hızlı topografya değişiklikleri nedeniyle görüntü kalitesini düşürdü. En düşük tepeden tepeye AC girişi için DNA üç noktalı yıldızın görüntüleme sonuçları, sağlam yapılar gösterirken, en yüksek tepeden tepeye AC girişi, daha yüksek kuvvetler nedeniyle gözlemlenebilir numune hasarına neden oldu.
Benzer şekilde, en düşük DC ofset girişi sağlam yapıları ortaya çıkarırken, en yüksek DC ofset girişi yapısal hasara neden oldu.
Genel Bakış
Bu makale, Fototermal Off-Rezonans Tıklama (PORT) yöntemi kullanılarak biyomoleküler etkileşimlerin gözlemlenmesi için bir görüntüleme protokolü sunmaktadır. Çalışma, görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesine ve üç kollu yıldız DNA motiflerinin birleştirilmesindeki potansiyel iyileştirmelerin araştırılmasına odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nanobiyoloji
- Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskopisi
- Biyomoleküler etkileşimler
Arka Plan
- Biyolojik süreçler için yeni ölçüm teknolojilerinin geliştirilmesi.
- Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobuna (AFM) odaklanılması.
- PORT olarak adlandırılan yeni bir görüntüleme modunun tanıtılması.
- Geleneksel rezonans dışı tıklama (off-resonance tapping) teknikleriyle karşılaştırılması.
Çalışmanın Amacı
- PORT için görüntüleme parametrelerini optimize etmek.
- Görüntüleme sürecindeki sistem sınırlarını belirlemek.
- DNA motif montajı görüntülemesindeki iyileştirmeleri araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskopisi.
- Fototermal Rezonans Dışı Vurma (PORT) görüntüleme modu.
- Özel bir sürücü lazer kullanılarak kantiverylerin kontrollü aktivasyonu.
- Geleneksel yöntemlerden önemli ölçüde daha hızlı veri toplama hızları.
Temel Sonuçlar
- Biyomoleküler etkileşim görüntüleme için PORT'un başarıyla uygulanması.
- Optimal görüntüleme parametrelerinin belirlenmesi.
- Üç uçlu yıldız DNA motiflerinin birleşimine dair öngörüler.
- Geliştirilmiş görüntüleme hızı ve kontrolünün gösterilmesi.
Sonuçlar
- PORT, biyomoleküler etkileşimlerin incelenmesinde yüksek hızlı AFM'nin kapasitesini artırır.
- Optimize edilmiş görüntüleme parametreleri, DNA montajının daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.
- Gelecekteki geliştirmeler, nano ölçekli biyolojideki görüntüleme tekniklerini daha da iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Fototermal Rezonans Dışı Tıklama (PORT) yöntemini kullanan yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM), biyomoleküler birleşmenin fizyolojik koşullar altında gerçek zamanlı görselleştirilmesine olanak tanıyarak erken keşif aşamasındaki dinamik ve kantitatif görüntüleme konusundaki kritik bir ihtiyacı karşılamaktadır. Uç-numune kuvvetlerini doğrudan kontrol etme ve görüntüleme parametrelerini optimize etme yeteneği, moleküler etkileşim çalışmalarında öngörücü güveni destekleyerek sağlam hedef doğrulama ve mekanizmik risk azaltma süreçlerini kolaylaştırır. Bu yetkinlik, moleküler keşiften preklinik model geliştirmeye geçişteki translasyonel köprüyü güçlendirerek portföy karar alma süreçlerini iyileştirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Biyomoleküler toplama dinamiklerinin tek molekül seviyesinde doğrudan gözlemlenmesine olanak tanır.
- Motif oluşumu sırasındaki gerçek zamanlı yapısal değişiklikleri ortaya çıkararak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Fonksiyonel hedef doğrulaması için kantitatif kuvvet ve topografya verileri sağlar.
- Hastalık mekanizmalarıyla ilgili moleküler yolların hipotez odaklı sorgulanmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Deney standardizasyonu için hassas biyomoleküler yapıların tekrarlanabilir, yüksek hızlı görüntülemesini sağlar.
- Alt akış iş süreçleri için güvenilir, kantitatif çıktılar sağlamak amacıyla görüntüleme parametrelerinin optimizasyonuna imkan tanır.
- Operasyonel sınırları tanımlayarak ve örnek hasarını minimize ederek ölçeklenebilirliği ve platformun yeniden kullanımını destekler.
- Bileşik tarama ve değerlendirme işlemleri için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel süreklilik için görüntüleme çıktılarını hastalıkla ilgili biyomoleküler düzenlemelerle hizalar.
- Preklinik model seçimi ve doğrulamasına temel oluşturacak yüksek çözünürlüklü veriler sağlar.
- Düzenleme süreçlerinin altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Kantitatif, gerçek zamanlı görüntüleme verilerine dayalı olarak risk ayarlı ilerleme kararlarına olanak tanır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
PORT destekli HS-AFM, erken hipotez testlerinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürecine entegre olarak, yinelemeli optimizasyonu ve fonksiyonlar arası veri paylaşımını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Montaj olaylarını gerçek zamanlı olarak görselleştirerek hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini kolaylaştırır.
- Tarama: Analiz hazırlığı ve bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif görüntüleme çıktıları sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulları karşılaştırmak ve protokolleri optimize etmek için kuvvet ve topografya ölçümleri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Klinik öncesi uyum için moleküler montaj verilerini hastalıkla ilgili sistemlerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Ar-Ge programları genelinde tekrarlanan kullanım için standartlaştırılmış, ölçeklenebilir bir görüntüleme kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Moleküler görüntüleme iş akışlarının standardizasyonunu, tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Süreçlerin erken aşamalarında sağlam ve nicel veriler sağlayarak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gerçek zamanlı moleküler içgörülere dayanarak, keşif programlarının riskle uyumlu önceliklendirilmesine ve ilerletilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Optimal parametre seçimi için nano ölçekli görüntüleme ve kuvvet spektroskopisi alanında uzmanlık gerektirir.
- Hızlı AFM ve fototermal aktivasyon sistemleri dahil olmak üzere özel enstrümantasyon gerektirir.
- Görüntüleme protokollerinin ve veri analiz iş akışlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı biyomoleküler sistemler veya numune türleri için görüntüleme parametrelerinin uyarlanması gerekebilir.
- Numune hasarını önlemek için sürücü lazerden kaynaklanan termal etkiler ve numune alanı kısıtlamaları yönetilmelidir.
