Name: Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Keşfedin proteazla aktive edilen reseptörlerin kalsiyum mobilizasyon testi ile karakterizasyonunu. Parmamodlinlerin trombo-inflamatuar bozukluklarda tedavi potansiyelini plaka okuyucu kullanarak değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<meta charset="utf8"></head><body>Endotel Hücrelerinde Proteaz ile aktive olan reseptör ligandlarının incelenmesi

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hücre Kültürü Reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uyumlu EA.hy926 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper hücre ayrışma reaktifi</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Tripsin isteğe bağlı olarak kullanılabilir, ancak PAR2 tahlillerinden kesinlikle kaçınılmalıdır.</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), fenol kırmızısı</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ile Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Avantor</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>MilliporeSigma</td><td>G2500</td><td>Deiyonize su ile sulu% 0.4 (a / h) bir çözelti yapmak için kullanın. Sterilize etmek için kullanmadan önce otoklavlayın.</td></tr><tr><td>Kalem / Strep (100X)</td> <td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi (% 0.4 w / h)</td> <td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr> < <tr><td>güçlü > Kalsiyum Mobilizasyon Reaktifleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Termo</td><td>172571000</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Avantor</td><td>97061-420</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Thermo</td><td>42352-0250</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Thermo</td><td>J66650-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4/</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisi (Ca/Mg/fenol-kırmızı içermez)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (Poloxamer 407)</td><td>Spektrum Kimyasal</td><td>P1166</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>TCI America</td><td>P1975</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>VWR International</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>TFLLRN-NH2 (TFA tuzu)</td><td></td><td></td><td>Versiti Blood'da Trudy Holyst tarafından hazırlanmıştır. Araştırma Enstitüsü</td></tr><tr><td><güçlü > Malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 iyi kültürle işlenmiş, siyah duvarlı, şeffaf tabanlı tahlil plakası</td> Şeffaf <td>kapaklı</td><td>Corning</td><td>3603</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü, 15 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü, 50 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Kültür şişesi, T-75</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>doku kültürü ile tedavi edildi</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık reaktif rezervuarı, 50 mL</td><td>Corning</td><td>RES-V-50-S</td><td></td></tr><tr><td>Enspire plaka okuyucu</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Üretimi Durdurulan</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü, 1,5 mL</td><td>Avantor</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeti, 9"</td> <td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td>sterilize edilmelidir</td></tr><tr><td>PCR tüp şeridi ayrı düz başlık şeritleri</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları, 20 & L</td><td>Biotix</td><td>63300042</td><td>steril, filtreli uçlar</td></tr><tr><td>Pipet uçları, 200 & mikro; L</td><td>Biotix</td><td>63300044</td><td>steril, filtrelenmiş uçlar</td></tr><tr><td>Pipet uçları, 1250 & mikro; L</td><td>Biotix</td><td>63300047</td><td>steril, filtrelenmiş uçlar</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>hacim 6 kullanılmış</td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 5 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5005</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 10 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5010</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 25 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5025</td><td></td></tr></tbody></table>

proteazla aktive edilen reseptörlerin modülatörlerinin plaka okuyucu kullanılarak kalsiyum mobilizasyon testi ile karakterize edilmesi

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Bu testin amacı genellikle üç ila dört yeni parmodulin için konsantrasyon-tepki eğrileri (CRC'ler) üretmektir. Her tahlil plakasında, NRD-21 gibi bilinen bir bileşik için genellikle ek bir CRC üretilir ve bu, bilinen IC50'si nedeniyle deney için bir kalite kontrolü görevi görür. CRC'leri oluşturmak için, Tablo 1'de gösterilen gibi bir plaka haritası planlanmalıdır. Bunun yerine tek noktalı konsantrasyon tepkileri isteniyorsa, 10 μM nihai konsantrasyonlardaki (veya diğer tercih edilen konsantra...

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

characterizing-modulators-protease-activated-receptors-with-calcium

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Biz peptidler viral füzyon peptidler bölünme sitenin temsil eden proteaz proteolitik aktivite hızlı bir tarama sağlayan bir fluorogenic peptid bölünme tahlil mevcut. Bu yöntem aynı zamanda bir protein sıra içinde diğer amino asit motif üzerinde proteaz aktivitesi için test etmek için kullanılabilir.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir nitroselüloz bağlanma testini rapor ediyor ve gösteriyoruz. Yöntemimiz, geleneksel SDS-PAGE tabanlı tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir ve bu önemli proteinleri karakterize etmek için değerli bir alternatif sunar.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Burada, etkili bir hidroliz ve bir Ni-Schiff-baz kompleksi izole edilen bir amino asidin daha sonra Fmoc koruma sunmaktadır. asit-labil yan zincir koruma gruplarının tutma gerekli olduğunda burada sunulan Hidroliz koşulları kullanılmak üzere uygundur. Bu teknik, doğal olmayan amino asit çeşitli substratlar için adapte edilebilir.

Koruma Grupları aside dayanıksız Saklanmasına için uygun bir Ni-Schiff-Base hidrolizi Kompleksi kullanma Koşullar

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Burada tarif biz prenilasyon ve guanozin-5'-trifosfat (GTP) araştırmak için bir protokol-Rho GTPazlar yükleme. Bu protokol iki detaylı yöntemi oluşur, yani membran ayırma ve GTPazlar bağlı immunosorbent assay. Protokolü prenilasyon ve GTP ölçmek için kullanılabilir diğer küçük GTPases'den başka bir yükleme.

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

Keşfedin proteazla aktive edilen reseptörlerin kalsiyum mobilizasyon testi ile karakterizasyonunu. Parmamodlinlerin trombo-inflamatuar bozukluklarda tedavi potansiyelini plaka okuyucu kullanarak değerlendirin.

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi (Video) | JoVE Journal

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Daha fazla video keşfet