Name: Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Öğrenin, Danio rerio embriyolarında mikroglia dinamiğini canlı görüntüleme yöntemiyle karakterize etmeyi. Bu protokol, gelişen beyinde mikroglia hücre davranışlarını ve morfolojisini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Optik Tektum Gelişiminde Mikroglia Davranışının Aydınlatılması

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Marın-Teva, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+the+death+of+developing+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia promote the death of developing Purkinje cells.</a> Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Hattori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglia-blood+vessel+interactions+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The microglia-blood vessel interactions in the developing brain.</a> Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxn4+directly+regulates+tbx2b+expression+and+atrioventricular+canal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation.</a> Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+time-lapse+imaging+of+transgenic+zebrafish%3A+visualizing+retinal+stem+cells+activated+by+targeted+neuronal+cell+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation.</a> J Vis Exp. (43), e2093(2010).</li>
<li>Ferrero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+derive+from+primitive+macrophages+and+are+replaced+by+cmyb-dependent+definitive+microglia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish.</a> Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).</li>
<li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+colonization+of+developing+zebrafish+midbrain+is+promoted+by+apoptotic+neuron+and+lysophosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine.</a> Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Thion, M. S., Garel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ontogeny%2C+diversity+and+neurodevelopmental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions.</a> Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development%2C+homeostasis%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration.</a> Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Green, L. A., O'Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+zebrafish+brain+is+seeded+by+a+lymphatic-dependent+population+of+mrc1%2B+microglia+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors.</a> Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+is+essential+for+myelination+in+the+central+nervous+system+%28CNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">C1q is essential for myelination in the central nervous system (CNS).</a> iScience. 26 (12), 108518(2023).</li>
<li>Zengeler, K. E., Lukens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+at+the+crossroads+of+healthy+brain+maturation+and+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders.</a> Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+developing+brain+in+living+zebrafish+using+Brainbow+and+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60593(2020).</li>
<li>Tayanloo-Beik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+modeling+of+autism+spectrum+disorders%2C+current+status+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective.</a> Front Psychiatry. 13, 911770(2022).</li>
<li>D'Amora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+innovative+tool+for+epilepsy+modeling%3A+State+of+the+art+and+potential+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an innovative tool for epilepsy modeling: State of the art and potential future directions.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7702(2023).</li>
<li>Langova, V., Vales, K., Horacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zebrafish+and+laboratory+rodents+in+schizophrenia+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research.</a> Front Psychiatry. 11, 549232(2020).</li>
<li>Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+organism+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease.</a> Front Mol Neurosci. 15, 940484(2022).</li>
<li>Astell, K. R., Sieger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+vivo+models+of+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L Üreme tankları</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiyoüre (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Embriyo pigmentasyonunu önlemek için E3'te 0,2 mM'ye seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Alt cam görüntüleme kabı</td><td>FluoroDish</td><td>FD3510-100</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Dereceli transfer pipeti</td><td>avantor</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>Kuru blok ısıtıcı</td><td>Novolab</td><td>QBD4 verin</td><td>Düşük erime noktalı agarozu 37 &°C'de tutmak için; C</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Trikain)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Imaris Dosya Dönüştürücü</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>https://imaris.oxinst.com/big-data</td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>&nbsp; 50081</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları (90 mm)</td><td>avantor</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Paslanmaz Çelik Forseps Dumont No. 5</td><td>FineScienceTools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td>Embriyoları monte etmek için</td></tr><tr><td>alay iğnesi</td><td>avantor</td><td>76549-024</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyosunda mikroglia dinamiğinin canlı görüntülenmesi ve karakterizasyonu

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden mikroglial hücreler ve Tg(mpeg1:eGFPgl22) cinsinden DsRed eksprese eden endotelyal hücreler; KDRL:CRES898; actb2: loxP-STOP-loxP-DsRedexpress, sd5) üçlü transgenik embriyolar14 , açıklanan protokole göre 3 dpf'de görüntülendi. Tek bir zebra balığı embriyosu, %1 düşük erime noktalı agaroz içine bir alt cam plaka üzerine monte edildi ve görüntüleme işlemi, edinme süresi boyunca embriyonun büyümesini engellemedi. Timelapse, 10x 0.45 NA kuru objektif lensi ile donatılmış ticari bir nokta taramalı konfokal mikroskopi sistemi kullanılarak kaydedildi ve mikroglia ve endotel hücrelerini görüntülemek için sırasıyla 488 nm ve 561 nm uyarma lazerleri kullanıldı. Ek olarak, zaman aralığı, görüntü çözünürlüğü, piksel boyutu ve z adımı sırasıyla 30 saniye (s), 1024x1024, 0.49 μm ve 2.5 μm idi. Timelapse kayıt 3,5 saat (s) sürdü.
Elde edilen görüş alanı, embriyonun tüm başını kapsıyordu, ancak analiz, gelişimin ilk haftasında olduğu gibi, özellikle optik tektuma odaklandı, mikroglia esas olarak dorsal orta beynin bu bölgesinin nöronal soma tabakası ile sınırlıdır ve araştırmacıların tüm popülasyonu aynı anda görselleştirmesine izin verir15. 3D izleme analizi, yukarıda açıklandığı gibi Imaris 10.0 kullanılarak gerçekleştirildi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, izleme başarılı oldu ve optik tektumda 3 dpf16'da bulunan beklenen mikroglia hücresi sayısıyla eşleşen 25 parça ile sonuçlandı. Minimum bir manuel iz düzeltmesi gerekliydi. Şekil 5'te , başarılı bir izleme deneyinden çıkarılması mümkün olan verilerin bir örneği gösterilmektedir. Makrofajların ve endotel hücrelerinin eşzamanlı olarak etiketlenmesi, mikroglia'nın ikincisine göre konumunun ölçülmesine izin vererek, araştırmacıların her bir hücrenin zaman içinde en yakın endotel hücresine olan göreceli mesafesini görselleştirmesine ve potansiyel etkileşimlerin sıklığını ve sayısını incelemesine olanak tanır (Şekil 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel prosedüre genel bakış. (A) Zebra balığı embriyo hazırlığı ve anestezisi. (B) Numune montajı ve konumlandırma. (C) Görüntü elde etme. (D) Görüntü işleme ve hareketlilik verilerinin çıkarılması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig02.jpg"> Şekil 2: Zebra balığı embriyosunda mikroglia görüntüleme ve beyin hücresel ortamı ile etkileşimler. (A) 3 dpf embriyonik zebra balığı kafasının ve beyninin (sırt görünümü), optik tektum ve arka beyni etiketleyen parlak alan görüntüsü. Embriyonik zebra balığının beyni, küçük boyutu ve optik şeffaflığı nedeniyle bu aşamada bütünüyle görüntülenebilir. (B-D) Mikroglia konumu ve davranışı, (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 ve (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23 gibi transgenik hatların kullanılması ve OT'ye odaklanılmasıyla görselleştirilebilir. (B) Nöronlar ve hücre gövdeleri, raportör hattı Tg(XlTubb:D sRed)zf148 kullanılarak tanımlanabilir ve mikroglia-nöron etkileşimleri, her iki transgeni birlikte ifade eden çizgilerde iki kanalın birleştirilmesiyle görselleştirilebilir. Görülen, yeşil (mikroglia) ve kırmızı (macenta cinsinden nöronlar) sinyallerin bir birleşimidir. (C,D) Raportör çizgileri ayrıca endotel hücreleri ile mikroglia (yeşil) etkileşimlere ışık tutabilir, burada (C) çift Tg(kdrl:cre s898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredekspres, sd5) transgenikler veya oligodendrositler ve öncüleri gibi glial hücrelerle, (D) çift Tg (olig2: EGFP; mpeg1: mcherry ) transgenik hat. 1: OT'deki oligodendrositler ve progenitör hücreler, 2: beyincikteki eurydendroid nöronları. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; OT = optik tektum; HB = arka beyin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig03.jpg"> Şekil 3: 3 dpf zebra balığı embriyosunda deri makrofajları ve mikroglia arasındaki morfolojik ve mekansal eşitsizlik. (A,B) (A) parankimal mikroglia hücrelerini (macenta yıldızlarla işaretlenmiş) ve cilt makrofajlarına (beyaz yıldız) karşı (A) parankimal mikroglia hücrelerini (macenta yıldızlarla işaretlenmiş) ve cilt makrofajlarına (beyaz yıldız) gösteren, (B) 'de görüldüğü gibi, z ekseni boyunca göreceli konumlarına göre tanımlanan bir Tg(mpeg1:eGFP)gl22 zebra balığı embriyosunun dorsal görünümü), z ekseni renk kodlamasıyla oluşturulan tek renkli 3D görüntüyü gösterir. (C,D) (C) A ve (D) B'nin, embriyonun kafasındaki mpeg1:eGFP + hücrelerinin z derinliklerini gösteren ve mikroglial hücrelere kıyasla cilt makrofajlarının yüzeysel lokalizasyonunu vurgulayan yanal görünümü. (E-K) A ve B'de bir yıldızla gösterilen her hücrenin yüksek büyütmesi, (EG) amoeboid mikroglia ve (H-K) uzamış cilt makrofajları arasındaki farklı morfolojilerin ayrıntılı bir görselleştirmesini sağlar. Ölçek çubukları= 30 μm. Kısaltma: dpf = döllenmeden sonraki gün sayısı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig04.jpg"> Şekil 4: 3 dpf zebra balığı embriyosunda mikroglial hücrelerin izlenmesi. (A) 3 dpf Tg(kdrl:cres898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredekspres, sd5; mpeg1: eGFPGL22) üçlü transgenik embriyo, mikroglia (yeşil) ve damarların yüzey görüntüsünü (macenta) gösterir. (B-D) (B) 3,5 saatlik bir zaman penceresi boyunca mikroglia hareketlerinin temsili takibi. Bireysel hücrelerin karmaşık yörüngeleri takip ettiği görülmektedir. (C) Kesikli kare ile çevrelenmiş B'deki bölgenin büyütülmüş bir görünümünü gösteren zaman atlamalı çekimden ayrıntı. Filmden altı kare (45 dakika arayla) sunulmakta ve mikrogliaların mikro çevrelerinde endotel hücreleri ile geçici temaslar kurduğunu belgelemektedir. (D) X, Y ve Z eksenleri uzamsal boyutları temsil ederken, optik tektum içindeki bireysel mikroglial hücre göçünün yörüngeleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltma: dpf = döllenmeden sonraki gün sayısı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig05.jpg"> Şekil 5: Elde edilen verilerin görselleştirilmesi. Açıklanan protokol kullanılarak elde edilebilecek uzamsal veri örneği. Grafikler (A) mikroglial hücrelerin ortalama hızını, (B) 1 saatte kat ettikleri ortalama mesafeyi, (C) ortalama kare yer değiştirmelerini ve (D) farklı zamanlarda uzaydaki dağılımlarını göstermektedir. Damarın yüzey oluşturması, herhangi bir zamanda mikroglia ve endotel hücreleri arasındaki en kısa mesafenin, hem (E) tek hücre düzeyinde hem de (F) küresel ortalama olarak ölçülmesine de izin verdi. A, B ve D için her nokta tek bir hücreyi temsil eder. N = bir embriyo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533_20240306_SupplementalFile1%20(2).zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

live-imaging-characterization-microglia-dynamics-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Kaynak: Niu, L. ve diğerleri. Zebrafish embriyolarında mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj litik hücre ölümünün intravital mikroskopi ile görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sonrası zebrafish embriyolarında makrofaj litik hücre ölümünü görselleştirmek için intravital konfokal mikroskopi kullanımını göstermektedir.

Zebrafish embriyolarında mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün canlı görüntülemesi

Bu video, zebra balığı radyal glia progenitörlerinde Notch/DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testini göstermektedir. Agaroza gömülü dekoryonlu zebra balığı embriyolarının monte edilmesini, RGP'ler üzerinde DeltaD ligandlarını hedefleyen bir boya çözeltisinin enjekte edilmesini ve Notch / DeltaD sinyal aktivasyonunu doğrulayan asimetrik hücre bölünmesi için bir floresan mikroskobu altında görüntülemeyi içerir.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinde Çentik/DeltaD Sinyalini Görüntülemek için Bir Antikor Alım Testi

Kaynak: Lahne, M., et.al. Multifoton Mikroskobu ile Canlı Hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra Balığı Retinal Eksplantlarının Kültürü. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, ışık kaynaklı fotoreseptör hasarını takiben agaroza gömülü zebra balığı retinal eksplantlarında Muller glial nükleer göçünün canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Hasarlı fotoreseptörler tarafından salınan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), Muller glial hücrelerini aktive ederek mitoz ve nöronal progenitör oluşumu...

Zebra Balığı Retina Rejenerasyonu Sırasında Müller Glial Nükleer Migrasyonunun Canlı Hücre Görüntülemesi

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Burada, larva zebra balıklarının üç boyutlu floresan mikroskobu kullanılarak in vivo tüm beyin görüntülemesi için bir protokol sunulmaktadır. Deneysel prosedür numune hazırlama, görüntü toplama ve görselleştirmeyi içerir.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

Öğrenin, Danio rerio embriyolarında mikroglia dinamiğini canlı görüntüleme yöntemiyle karakterize etmeyi. Bu protokol, gelişen beyinde mikroglia hücre davranışlarını ve morfolojisini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet