Name: Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Öğrenin MMqPCR yöntemiyle insan DNA'sından göreli telomer uzunluğu ölçümünü. Bu protokol nüfus temelli çalışmalarda hücresel yaşlanma ve sağlık sonuçları araştırmaları için güvenilir bir analiz sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan Popülasyonu Çalışmalarında Doğru Telomer Uzunluğu Değerlendirmesi

<ol><li>Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shortest+telomere%2C+not+average+telomere+length%2C+is+critical+for+cell+viability+and+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability.</a> Cell. 107 (1), 67-77 (2001).</li>
<li>Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+telomere+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%3A+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of telomere biology in cancer.</a> Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).</li>
<li>Lindrose, A., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+reporting+recommendations+for+pcr-based+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Telomere+Research+Network%22%5BJournal%5D)">Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement.</a> Telomere Research Network. , (2020).</li>
<li>Verhulst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+The+reliability+of+telomere+length+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Commentary: The reliability of telomere length measurements.</a> Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).</li>
<li>Mundstock, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+obesity+on+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).</li>
<li>Haycock, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocyte+telomere+length+and+risk+of+cardiovascular+disease%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 349, 4227(2014).</li>
<li>Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+of+84+studies+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis.</a> Environ Res. 158, 480-489 (2017).</li>
<li>Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+telomere+length%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Depression and telomere length: A meta-analysis.</a> J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).</li>
<li>Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+all-cause+mortality%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis.</a> Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).</li>
<li>Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+telomere+length+in+risk+and+recurrence+of+prostate+cancer%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis.</a> Andrologia. 51 (7), e13304(2019).</li>
<li>Schneider, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+telomere+length+with+risk+of+disease+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Inter+Med%22%5BJournal%5D)">Association of telomere length with risk of disease and mortality.</a> JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+the+risk+of+cardiovascular+diseases%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).</li>
<li>D'mello, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shortened+leukocyte+telomere+length+and+cardiometabolic+outcomes%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovasc+Gene%22%5BJournal%5D)">Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis.</a> Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).</li>
<li>Wilbourn, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+telomere+length+and+mortality+risk+in+non-model+vertebrate+systems%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).</li>
<li>Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Cawthon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quatitative+pcr%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quatitative pcr.</a> Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+a+novel+monochrome+multiplex+quantitative+pcr+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method.</a> Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).</li>
<li>Lindrose, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+comparison+studies+of+telomere+length+measurement+using+qpcr+approaches%3A+A+critical+appraisal+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature.</a> PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+extraction%2C+DNA+integrity%2C+and+laboratory+on+the+precision+of+qpcr-based+telomere+length+measurement+-+a+multi-lab+impartial+study%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ph+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+An+overlooked+detail+of+pcr+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting.</a> Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+chronological+age+across+the+human+lifespan%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+414+study+samples+including+743%2C019+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals.</a> Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).</li>
<li>Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+telomerase+activity%3B+a+yin+and+yang+of+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence.</a> J Vis Exp. (75), e50246(2013).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+inflammatory+diseases+and+leukocyte+telomere+length%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genetics%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study.</a> Front Genetics. 14, 1129247(2023).</li>
<li>Van Ockenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressful+life+events+and+leukocyte+telomere+attrition+in+adulthood%3A+A+prospective+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study.</a> Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).</li>
<li>Zong, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+air+pollution+exposure+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health%22%5BJournal%5D)">Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis.</a> Public Health. 215, 42-55 (2023).</li>
<li>Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+air+pollution%2C+genetic+risk+and+telomere+length+in+uk+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22J+Expo+Sci+Environ+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank.</a> J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+cell+type-specific+telomere+length+changes+in+subsets+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes.</a> J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).</li>
<li>Needham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socioeconomic+status%2C+health+behavior%2C+and+leukocyte+telomere+length+in+the+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1999-2002%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Sci+Med%22%5BJournal%5D)">Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002.</a> Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).</li>
<li>Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+comparability+between+qpcr-based+telomere+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Res%22%5BJournal%5D)">Improving comparability between qpcr-based telomere studies.</a> Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).</li>
<li>Dagnall, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PloS one. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+qpcr-summary+of+critical+factors+and+recommendations+for+assay+design%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design.</a> Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).</li>
<li>Wolf, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-tissue+comparison+of+telomere+length+and+quality+metrics+of+DNA+among+individuals+aged+8+to+70+years%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years.</a> PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).</li>
<li>RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+long-term+storage+on+stability+of+standard+DNA+for+nucleic+acid-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods.</a> J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).</li>
<li>Dagnall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+effect+of+repeated+freeze+and+thaw+cycles+on+stability+of+genomic+DNA+using+pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis.</a> Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).</li>
<li>Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/">https://cran.r-project.org/</a> (2024).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+a+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
</ol>

Telomerler, tüm ökaryotik kromozomların sonunda bulunan, yüksek oranda korunmuş, tekrarlayan DNA dizileri ve ilişkili proteinlerden oluşan koruyucu komplekslerdir. Telomer, kromozom stabilitesini koruyarak DNA'nın bütünlüğünü korur. Telomerlerin ilerleyici kısalması, eksik gecikmeli iplikçik DNA sentezi, DNA hasarı ve diğer faktörlerin bir sonucu olarak bölünen hücrelerde meydana gelir 1,2. Telomer uzunluğunun (TL) insan ömrü boyunca yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıkların bir biyobelirteç olduğunu destekleyen artan kanıtlara, insan maruziyeti, hastalık ve sağlık çalışmalarında TL'nin rolünü değerlendirmek için kullanılan TL ölçüm testlerinin türlerinde bir artış eşlik etmiştir 3,4,5. Meta-analizler, TL'nin genel mortalite, çevresel maruziyetler ve kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet dahil olmak üzere sağlık sonuçları ile ilişkilerini bildirmiştir 6,7,8,9,10,11,12,13 . Bu meta-ilişkilendirmeler, ilişkilendirmelerin güçlü yönlerinin farklı metodolojiler arasında farklılık gösterme eğiliminde olduğu iki düzineden fazla farklı TL ölçüm metodolojisinden birini kullanan çalışmalardan kaynaklanmaktadır 14,15,16. Bir araştırma çalışması için en uygun TL ölçüm yönteminin seçilmesi, her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları olduğundan, doğru sonuçlar elde etmek için çok önemli bir adımdır 5,17.
Reaktiflerin nispeten düşük maliyeti, hızlı tahlil geri dönüşü, ölçeklenebilirlik ve daha düşük başlangıç DNA gereksinimi nedeniyle, PCR tabanlı TL ölçüm teknikleri, büyük örneklem popülasyonlarıyla yapılan çalışmalar, yüksek DNA konsantrasyonlarına sahip örneklere sınırlı erişimi olan çalışmalar veya yüksek verime öncelik veren çalışmalar yürütülürken genellikle tercihen kullanılır. Orijinal olarak Richard Cawthon tarafından geliştirilen tek katlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) olan ilk PCR tabanlı TL ölçüm yöntemi, ayrı PCR plakaları18 üzerinde çalıştırılan telomer (T) ve tek kopya gen (S) amplifikasyonunun floresan sinyallerinin oranını kullanır. Bu yaklaşımda, numunedeki toplam telomer DNA içeriğini amplifiye etmek için tekrarlanan telomer DNA dizilerini (T) tamamlayan primerler kullanılır ve floresan raportör SYBR green'in tespiti ile nicelik belirlenir. Benzer şekilde, korunmuş tek kopya (S) geninin intergenik bir bölgesini tamamlayan primerler, genom kopya sayısını ölçmek için kullanılır. Bu iki tahmin, plakadan plakaya varyasyonu kontrol etmek için bir projedeki tüm tahlillerde kullanılan bir genomik DNA standart eğrisine göre ölçülür. Toplam telomerik DNA'nın (T) tek genom kopya sayısına (S) bölünmesi, tek bir DNA örneği18,19 için hücre başına ortalama telomerik içeriği temsil eden birimsiz, göreceli bir ölçüm olan T/S oranını üretir. Bu nedenle, T/S oranı, fonksiyonel uzunluğun belirli bir ölçüsü değildir; ancak literatür normlarına uygun olarak bu protokol boyunca örneklem başına ortalama TL terimini kullanmaktayız.
Bu yöntem, 2009 yılında Richard Cawthon'un monokrom multipleks qPCR (MMqPCR) testini, orijinal singleplex qPCR yöntemine göre T/S oranındaki değişkenliği potansiyel olarak azaltmak için bir yaklaşım olarak tanımladığı19 zaman geliştirilmiştir. MMqPCR testi, qPCR testinin faydalarına sahiptir ve aynı reaksiyon kuyusu içinde T ve S sinyallerini tek bir raporlama floroforu kullanarak ölçme avantajına sahiptir, böylece singleplex qPCR'ye göre hatayı azaltır ve daha yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır19. Ayrıca, bu multipleks yöntemi potansiyel olarak maliyetleri düşürür ve singleplex testine kıyasla yarısı kadar reaksiyon gerektiğindenverimi artırır 19.
MMqPCR TL ölçümünün avantajları göz önüne alındığında, bu yöntem, maruziyetler, sağlık sonuçları ve biyolojik süreçlerle TL ilişkilerinin popülasyon temelli çalışmaları için çok uygundur. Ancak, yöntemi başlatmak zor olabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, laboratuvarımızda kullanılan MMqPCR TL ölçüm protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyor ve test hassasiyetini artırmak, kontaminasyon riskini azaltmak ve tekrarlanabilirliği geliştirmek için uygulanan temel adımları vurguluyoruz.
Ayrıca, bu protokol, verilerin temizlenmesi ve TL ölçümlerinin tekrarlanabilirliğinin önemli bir istatistiksel ölçüsü olan sınıf içi korelasyon katsayısının (ICC) hesaplanması için adımları ana hatlarıyla belirtir2. Temsili sonuçlarımızla, bu protokolü kullanarak yüksek ICC'ler üretme kabiliyetini gösteriyoruz. Ek olarak, TL ölçümlerindeki değişimi azaltması ve ortaya çıkan ICC'yi artırması beklenen kalite kontrol (QC) ve sorun giderme adımlarını belirliyoruz. Bu yöntemin yüksek tekrarlanabilirliği, verimliliği ve maliyet etkinliği nedeniyle, MMqPCR TL ölçümü epidemiyolojik TL araştırmaları için idealdir. Şekil 1, bu protokolde açıklandığı gibi MMqPCR yöntemine görsel bir genel bakış sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig01v2.jpg"> Şekil 1: Yönteme genel bakış. Telomer uzunluğunu ölçmek için monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu yöntemine geniş bir genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>0.5 mL Tüpler</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0099</td><td>Seal-Rite 0.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri, Steril Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>1.5 mL Tüpler</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5599</td><td>Seal-Rite 1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri, Steril Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>100mM DTT</td><td></td><td>Evde Uygulanamaz</td><td>Stok DTT, seyreltilmiş sodyum asetat ve PCR Sınıf H2O ile üretilmiştir Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 derece; C&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL Tüpler</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-959-53A</td><td>Corning 352196 Falcon 15mL Konik Santrifüj Tüpleri Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>1M MgCl < alt > 2 < / alt ></td> <td>Thermo Fisher</td><td>50152107</td><td>Biotang Inc 1M MgCl < alt > 2 < / alt > 18.2 Megohm Suda Hazırlanmış ve 0.22 Mikron Filtre ile Filtrelenmiş Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: 4 & derece; C&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Evde Altın Tamponu</td><td></td><td>Uygulanamaz</td><td>PCR Grade H2O ile seyreltilmiş 10X Altın Tamponu Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>25mM dNTP'ler</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>Deoksinükleotid Çözelti Seti Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mL Tüpler</td><td>Thermo Fisher</td><td>3391276</td><td>Argos Technologies Mikrosantrifüj Tüpleri ve 5 mL Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Plaka</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR Plakaları, Düşük Profilli, İnce Duvarlı, Etekli, Beyaz / Şeffaf Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td>Ofis Depo</td><td>3489072</td><td>Reynolds Wrap Stanard Alüminyum Folyo Rulo, 12" x 75', Gümüş Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold Kit &ndash; Polimeraz ve Tampon</td><td>Thermo Fisher</td><td>4311806</td><td>Altın Tamponlu AmpliTaq Altın DNA Polimeraz ve MgCl2 (bu kitte MgCl<>sub2 kullanılmaz), 10X Altın Tamponu, 2.5U AmpliTaq Altın Polimeraz Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Betain</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ77507AB</td><td>Betain, 5M Çözelti, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Ultrasaf, 10mL Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Büyük Tüp Rafı</td><td>Thermo Fisher</td><td>344817</td><td>Fisherbrand 4 Tüp Raf Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>CFX Maestro Yazılımı</td> Gerçek <td>zamanlı PCR plakası kurulumu, veri toplama, istatistikler ve sonuçların grafiklendirilmesi için Bio-Rad 12004110 Yazılımı Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Başlangıç Paketli Gerçek Zamanlı PCR Sistemleri için Optik Reaksiyon Modülü</td><td>Gerçek zamanlı</td><td>PCR için Bio-Rad 1845096 96 kuyulu optik modül Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1539706</td><td>Dithiothreitol, >99.5+ Moleküler Biyoloji Sınıfı, 5 g Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-32</td><td>ELIMINase Laboratuvar Dekontaminant Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>HEPA Filtre</td><td>ABD Bilimsel</td><td>Yedek Filtreler</td><td>AirClean İş İstasyonları için Yüksek Verimli Partikül Hava Filtresi Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher</td><td>06666A</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Hassas Görev Silecekleri, 1 Katlı Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Yükleme Teknesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>14387069</td><td>Thermo Scientific Matrix Reaktif Rezervuarları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Uygulanamaz</td><td>Microsoft 365 paketi, Excel yazılım uygulaması Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Mini Santrifüj</td><td>Genesee Scientific</td><td>31-500B</td><td>Poseidon 31-500B Mini Santrifüj, Mavi Kapak Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>PCR Sınıf H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile Muamele Edilmemiş) Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>PCR Hood</td><td>USA Scientific</td><td>4263-2588</td><td>HEPA Filtrasyonlu Nükleik Asit İş İstasyonu, AirClean Sistemleri Kombinasyonu PCR İş İstasyonu Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>PCR Şeritleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0776</td><td>Düşük Profilli Tüpler ve Düz Kapaklar, 8 Şeritler Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>PCR Tüp Rafı</td><td>Thermo Fisher</td><td>344820</td><td>Fisherbrand 96 Kuyulu PCR Tüp Rafı Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipet Uçları (Çok Kanallı)</td><td>Ranin</td><td>17005860</td><td>Pipet Uçları SR LTS 20&micro; L F 960A / 5, 20 ve mikro; L Maksimum Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipet Uçları (Tek Kanallı)</td><td>USA Scientific</td><td>1181-3850</td><td>10&micro; L Dereceli TipOne RPT Filtre Uçları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>Pipet Uçları (Tek Kanallı)</td> <td>USA Scientific</td><td>1180-1850</td><td>20 & L Eğimli TipOne RPT Filtre Uçları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipet Uçları (Tek Kanallı)</td> <td>USA Scientific</td><td>1111-0880</td><td>200 & micro; L Raflarda Doğal TipOne Pipet Uçları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipet Uçları (Tek Kanallı)</td> <td>USA Scientific</td><td>1111-2890</td><td>1000 & L Raflarda Doğal Dereceli TipOne Pipet Uçları < / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (Çok Kanallı)</td> <td>Ranin</td><td>17013802</td><td>Pipet-Lite Çoklu Pipet L8-10XLS, 0,5 ila 10 mikro; L Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (Çok Kanallı)</td><td>Ranin</td><td>17013803</td><td>Pipet-Lite Çoklu Pipet L8-20LS+, 2 ila 20&mikro; L Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (Tek Kanallı)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>F144802G</td><td>Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 1 ila 10 & mikro; L Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (Tek Kanallı)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F123600</td><td>Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 2 ila 20&mikro; L Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (Tek Kanallı)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F123601</td><td>Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 20 ila 200&mikro; L Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (Tek Kanallı)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F123602</td><td>Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 200 ila 1000&mikro; L Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Plaka Sızdırmazlık Filmi</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Microseal " B&rdquo; PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, Yapıştırıcı, Optik Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Plaka Döndürücü</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-100-141</td><td>Fisherbrand Mini Plakalı Döner Santrifüj, 230 V Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>Ön Kaput Filtresi</td><td>USA Scientific</td><td>4235-3724</td><td>AirClean Sistemleri için Ön Filtre İş İstasyonları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklık</td></tr><tr><td>R Yazılımı</td><td>İstatistiksel Hesaplama için R Projesi</td><td>Uygulanamaz</td><td>R sürüm 4.2.2 Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Ölçek</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-922-329</td><td>OHAUS 30430060 PR Serisi Analitik Terazi, 62g Kapasite Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Ofis Depo</td><td>458612</td><td>Ofis Deposu Marka Makas, 8", Düz, Siyah, 2 'lik Paket Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Sharpies</td><td>Sharpie</td><td>2151734</td><td>Fırçası İkiz Kalıcı İşaretleyiciler, Siyah Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>Tek Kopya Gen İleri Astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel</td><td>Ayrı tabloya bakın Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 ° C; C rehidre edildiğinde</td></tr><tr><td>Tek Kopya Gen Ters Primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel Ayrı</td><td>tabloya bakınız Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C yeniden sulandırıldığında</td></tr><tr><td>Küçük Tüp Rafı</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-402-17</td><td>Thermo Fisher 8601 Kapaklı Ters Çevrilebilir Mikrotüp Rafları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Thermo Fisher</td><td>J63560. EQE</td><td>3M NaOAc pH 5.2 Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Spatula</td><td>Thermo Fisher</td><td>3990240</td><td>Bel-Art SP Scienceware Paslanmaz Çelik Numune Alma Kaşığı ve Spatula Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>SYBR Yeşil</td><td>Termo Balıkçı</td><td>S7563</td><td>SYBR Green I Nükleik Asit Jel Lekesi &ndash; DMSO Depolama Sıcaklığı ve Koşullarında 10.000X Konsantre: eksi 20 °C C rehidre edildiğinde</td></tr><tr><td>Şırınga Filtreleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-927-55A</td><td>GD / X 25 mm Steril Şırınga Filtresi, selüloz asetat filtrasyon ortamı, 0.2 & mu; m Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Şırıngalar</td><td>Thermo Fisher</td><td>148232A</td><td>BD Luer-Lok İğnesiz Tek Kullanımlık Şırıngalar, 10mL Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>TE Tampon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2474100</td><td>TE Tamponu, Tris-EDTA, 1X Çözelti, pH 7.6, Moleküler Biyoloji, Fisher BioReagents Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr><tr><td>Telomer İleri Astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel Ayrı</td><td>tabloya bakınız Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C rehidre edildiğinde</td></tr><tr><td>Telomer Ters Astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>görenek Ayrı</td><td>tabloya bakınız Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C yeniden sulandırıldığında</td></tr><tr><td>UV Işığı</td><td>USA Scientific</td><td>4288-2540</td><td>İş İstasyonları için UV Ampul Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-151</td><td>Fisherbrand Mini Vorteks Mikser, 115 V, 50/60 Hz Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Tartı Tekne</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-549-752</td><td>Fisherbrand Steril Altıgen Tartı Teknesi, 10mL Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı</td></tr></tbody></table>

monokrom multipleks kantitatif pcr telomer uzunluğu Ölçümü 

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Tablo 4 ve Tablo 5'te sunulan sonuçlar, protokol izlenerek elde edilen yüksek oranda tekrarlanabilir TL ölçümlerine bir örnek sunmaktadır. Bu sonuçlar için, üreticilerin yönergelerine göre ticari bir kit kullanılarak 24 periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneğinden DNA ekstrakte edildi. Bu 24 numune, iki adet 96 oyuklu plaka boyunca çalıştırıldı. Tüm DNA örnekleri, tahlil uygunluğunu ve numune seyreltme faktörünü belirlemek için ortalama 260/280 oranı, ortalama 260/230 oranı ve dsDNA konsantrasyonu kullanılarak spektrofotometre ve florometre ile kalite açısından kontrol edildi (Tablo 6). Tablo 6 ayrıca, bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen DNA konsantrasyonundan farklı olabilen dsDNA konsantrasyonunun ölçülmesinin önemini vurgulamaktadır. Bu değişkenlik, nicelemeye yönelik farklı yaklaşımların bir sonucudur. Spesifik olarak, spektrofotometre, 280 nm'de absorpsiyona dayalı olarak DNA konsantrasyonunu türetir ve absorbans okumalarını etkileyen kirleticilerden (örn. protein, tuz vb.) kaynaklanan dalgalanmalara karşı hassastır. Buna karşılık, bir florometre kullanılarak ölçülen dsDNA konsantrasyonları, dsDNA'ya spesifik olarak bağlanan bir boyanın floresansı ile belirlenir ve bu nedenle, DNA içeriğinin daha doğru bir yansıması olduğu varsayılır. DNA örnekleri, MMqPCR TL analizinden önce üç adede kadar donma-çözülme döngüsüne maruz kaldı. Kontrol DNA'sı, 2 ng/μL'den 0.0313 ng/μL DNA'ya yedi noktalı bir seri seyreltme oluşturmak için kullanılan bir bireyden PBMC'lerin havuzlanmış DNA ekstraksiyonlarından oluşturuldu. PCR Step 9 (telomer amplicon) ve Step 12 (bu protokolde tek kopya gen amplicon, albumin) için oluşturulan bağımsız standart eğriler Şekil 6A,B'de sunulmuştur. Tahliller, Şekil 8'de görüldüğü gibi, bireysel amplikon ürünlerinin farklı sıcaklıklarda üretildiğini gösteren bir eriyik eğrisi oluşturan ticari bir Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi üzerinde çalıştırıldı.
Tablo 4: Optimum temsili sonuçlar için MMqPCR ölçümünden elde edilen çıktı verileri. 24 örnek için ortalama T/S oranları, SD'ler, CV'ler ve Z-skorlu TL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%204_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 5: Telomer uzunluğu veri çıkışı. MMqPCR testinden elde edilen ham veriler yazılımda analiz edilir, ardından daha fazla analiz ve kalite kontrol için Ek Dosya 1 olarak eklenen elektronik tablo şablonuna eklenir. Bu TL şablonu çıktı sayfası, her iki plakadaki her numune için numune kimliklerini, ortalama TL'leri, SD'leri ve CV'leri görüntüleyen verilerin bir özetini sunar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%205_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 6: Numune sonuçları için Spektrofotometre ve Florometre DNA kalite ölçümleri. Numune başına dsDNA ve herhangi bir kontamine için çift spektrofotometre analizinden ve tekil florometre ölçümünden elde edilen kalite kontrol verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%206_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig08.jpg"> Şekil 8: Örnek erime eğrisi. Yazılımda oluşturulan örnek veriler için erime eğrisi. Önceki tepe ~ 80 ° C, telomer amplikonunu temsil eder ve ~ 89 ° C'deki ikincil tepe albümin amplikonunu temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig09.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig09large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%207_RE.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%201.%20MMqPCR%20Template_RE.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%202.%20ICC%20Calculation_RE.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%203.%20TRN%20Reporting%20Guidelines_RE.zip" target="_blank"></a>

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

monochrome-multiplex-quantitative-pcr-telomere-length-measurement

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Bu makalede, telomer uzunluğunun hızlı ve etkin bir şekilde doğrudan ölçülmesini sağlayan, modifiye edilmiş bir terminal kısıtlama fragmanı analizi kullanarak telomer uzunluğunun nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol tartışılmıştır. Bu teknik telomer uzunluğunu ölçmek için çeşitli DNA hücreleri kaynaklarına uygulanabilir.

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Tandem birleştirme olayları, birbirinden 12 nükleotidden daha az uzaklıkta meydana gelir. Bu tür ek varyantlarının oranlarının niceliksel olarak belirlenmesi, mutlak bir kantitatif PCR yaklaşımı kullanılarak mümkündür. Bu el yazması, iki birleştirme olayının Serine-701 dahil etme/dışlama ve α/β C-uçları ile sonuçlandığı STAT3 geninin ek varyantlarının nasıl ölçülebileceğini açıklamaktadır.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Burada, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sıçan peritoneal membranda mikroRNA ekspresyonunun saptanması için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik koşullardaki sıçan peritoneal membrandaki mikroRNA ekspresyon profilini incelemek için uygundur.

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Burada, çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere kompleman reseptör 1 (CR1) uzunluk polimorfizmlerini belirlemek için yenilikçi bir yöntem, özellikle Alzheimer hastalığı (AD) gibi hastalıklara duyarlılığın değerlendirilmesi ile açıklanmaktadır. Bu yöntem, AD patogenezinde CR1 izoformlarının rolünü daha iyi anlamak için yararlı olabilir.

Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Öğrenin MMqPCR yöntemiyle insan DNA'sından göreli telomer uzunluğu ölçümünü. Bu protokol nüfus temelli çalışmalarda hücresel yaşlanma ve sağlık sonuçları araştırmaları için güvenilir bir analiz sunar.

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

Daha fazla video keşfet