Name: Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Öğrenin OPTIR-FISH yöntemiyle tek hücreli metabolizma analizi ve hücre kimliği belirleme. Bu protokol, karmaşık ortamlarda hücre etkileşimlerini anlamak için optik fototermal kızılötesi görüntüleme ile floresan yerinde hibridizasyonu birleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>OPTIR-FISH Kullanarak Hücre Tanımlama ve Metabolik Analiz için Kapsamlı Protokol

<ol><li>Evers, T. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+metabolic+heterogeneity+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis.</a> Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).</li>
<li>Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+culturing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Present and future of culturing bacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).</li>
<li>Epstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenomenon+of+microbial+uncultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li>
<li>Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-independent+methods+for+studying+environmental+microorganisms%3A+methods%2C+application%2C+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).</li>
<li>Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+metabolic+activities+in+single+cells%2C+with+emphasis+on+nanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).</li>
<li>Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+chemical+imaging+combined+with+correlative+microscopy+for+biological+sample+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).</li>
<li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+integration+with+other+imaging+modalities+for+greater+molecular+understanding+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues.</a> Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).</li>
<li>Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labelling+in+vibrational+spectroscopy%3A+a+technique+to+decipher+the+structure+of+surface+species%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Catal%22%5BJournal%5D)">Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species.</a> Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).</li>
<li>Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal-fluorescence+in+situ+hybridization+for+functional+analysis+and+genetic+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells.</a> Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+oligodeoxynucleotide+probes+for+the+major+subclasses+of+proteobacteria%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22System+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions.</a> System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+suite+of+16S+rRNA-specific+oligonucleotide+probes+designed+to+investigate+bacteria+of+the+phylum+cytophaga-flavobacter-bacteroides+in+the+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment.</a> Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).</li>
<li>Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaims%2C+H+%22Molecular+Microbial+Ecology%22">Molecular Microbial Ecology</a>. , Taylor & Francis. London. (2004).</li>
<li>Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Fluorescence+In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).</li>
<li>Wang, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+simple+FISH+protocol+with+hybridization-sensitive+fluorescent+linear+oligodeoxynucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes.</a> RNA. 18 (1), 166-175 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mathFISH%2C+a+web+tool+that+uses+thermodynamics-based+mathematical+models+for+in+silico+evaluation+of+oligonucleotide+probes+for+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).</li>
<li>Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+isotopically+labeled+bacteria+at+the+single-cell+level+using+high-resolution+optical+infrared+photothermal+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy.</a> Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond-resolution+photothermal+dynamic+imaging+via+MHZ+digitization+and+match+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering.</a> Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).</li>
<li>Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond-selective+imaging+by+optically+sensing+the+mid-infrared+photothermal+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect.</a> Sci Adv. 7 (20), (2021).</li>
<li>Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal+microscopy%3A+principle%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chemi+B%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications.</a> J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).</li>
<li>Du, J., Wang, H., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+vibrational+imaging+to+chemical+biology+with+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes.</a> ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).</li>
<li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+metabolic+imaging+with+vibrational+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes.</a> Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mapping+of+lipid+metabolites+using+an+infrared+probe+in+human-derived+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems.</a> Nat Commun. 15 (1), 350(2024).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRS-FISH%3A+A+high-throughput+platform+linking+microbiome+metabolism+to+identity+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+chemical+imaging+by+widefield+photothermal+sensing+of+infrared+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption.</a> Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).</li>
<li>Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+chemical+imaging+by+dense-net+learning+of+femtosecond+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering.</a> J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+fingerprint+stimulated+Raman+spectroscopic+imaging+by+ultrafast+tuning+and+spatial-spectral+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning.</a> Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).</li>
<li>Fu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+non-fluorescent+molecules+by+photothermal+relaxation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy.</a> Nat Photon. 17, 330-337 (2023).</li>
<li>Tamamitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+widefield+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared widefield nanoscopy.</a> arXiv. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>% 96 Etanol</td><td>ThermoScientific</td><td>T032021000</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Florür</td><td>Crystran</td><td>CAFP10-0.35</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoz (U-13C6,% 99)</td><td>Cambridge İzotopik Laboratuvarları</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>ThermoScientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani et suyu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Minimal Tuzlar 5x</td><td>SIGMA</td><td>M6030-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OPTIR cihazı</td><td>Fototermal Spektroskopi A.Ş.</td><td>mIRage LS</td><td></td></tr><tr><td>Paraforaldehit Çözeltisi, PBS</td><td>ThermoScientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin çözeltisinde %4 %0.1 (a/h)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür, %99+</td><td>ThermoScientific</td><td>A11379.18</td><td></td></tr><tr><td>Tripik Soya Suyu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

optik fototermal kızılötesi-floresan yerinde hibridizasyon (optir-fish)

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

OPTIR-FISH tarafından genetik tanımlama ile tek hücreli mikrobiyal metabolik analiz için genel iş akışı şurada özetlenmiştir: Şekil 2. OPTIR'ın tek hücreli metabolik görüntüleme yeteneğini gösteren temsili sonuçlar şurada gösterilmiştir: Şekil 3. Bu örnekte E. coli hücreleri ile inkübe edilmiştir. 12C- veya 1324 saat boyunca C-glikoz. Dahil edilmesi 13C'nin proteinlere dönüşmesinin, protein amidleri I ve II'de önemli bir kırmızıya kaymaya neden olduğu gösterilmiştir (Şekil 3A)17,18. Bu nedenle, bu iki anahtar dalga sayısı 12C-proteini (1656 cm)-1, normal amid I bandı) ve 13C-proteini (1612 cm)-1, kaydırılmış amid I bandı) seçildi ve bu iki dalga numarasında OPTIR görüntüleri elde edildi. Karşılık gelen parlak alan görüntüleri, hücrelerin morfolojisini göstermek için de gösterilmiştir (Şekil 3B,E). Çubuk şeklindeki bakteriler, hem parlak alan hem de OPTIR görüntülerinde tek hücre düzeyinde net bir şekilde çözülebilir, bu da OPTIR tekniğinin yüksek uzamsal çözünürlüğünü doğrular (Şekil 3B-G). İle inkübe edilen hücreler için 12C-glikoz (Şekil 3B-D), 1656 cm'de daha yüksek bir yoğunluk-1 gözlenirken, 1612 cm daha yüksek bir-1 ile inkübe edilen hücreler için yoğunluk gözlendi. 13C-glikoz (Şekil 3E-G). Bu tepe kayması, daha ağır karbon izotoplarının protein kütlesine dahil edildiğini gösterir17. Değerlendirme, OPTIR-FISH'in çok tür örneklerinde bakteri taksonlarını ve metabolik aktivitelerini ayırt etme yeteneğini değerlendirmek için genişletildi. İnsan bağırsak mikrobiyomunda yaygın olan iki bakteri türünü yapay olarak karıştırdık: E. coli ve B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli ile inkübe edilmiş hücreler 13C-glukoz, Gammaproteobacteria'nın 23S rRNA'sını hedefleyen bir Gam42a-Cy5 probu ile hibritlendi10. B. theta ile inkübe edilmiş hücreler 12C-glukoz, çoğu Bacteroidaceae türünün 16S rRNA'sını hedef alan Bac303-Cy3 probu ile hibritlendi11. Her ikisi de çubuk şeklinde olduğu için parlak alan görüntülerine dayanarak iki türü ayırt etmek çok zordur (Şekil 4A). Bu nedenle, hibritleştirilmiş probların çok renkli floresan görüntülemesi, analiz edilen her bakteri hücresine taksonomik bir kimlik atamak için gerekliydi (Şekil 4B). 1612 cm'de elde edilen OPTIR görüntüleri çıkarıldığında-1 1656 cm'den itibaren-1, bu iki tür örneklemindeki bir hücre segmentinin pozitif çıkarma değerleri gösterdiğini fark ettik (Şekil 4C), dahil edildiğini gösterir 13C izotopları. Kültür koşullarına bağlı olarak, pozitif çıkarma değerine sahip hücreleri E. colive negatif çıkarma değeri olacak B. theta. Bakteri türlerinin atanması, floresan görüntüleme sonuçlarıyla doğrulanır: pozitif çıkarma değerleri üreten hücreler, aşağıdakilere özgü olan Cy5 kontrastı üretir: E. colive negatif çıkarma değerleri üreten hücreler üretir B. theta-spesifik Cy3 kontrastları. Daha sonra, izotopik değiştirme oranı hesaplandı, bu durumda yeni sentezlendi 13C-proteini 13C-glikoz (Şekil 4D). Beklendiği gibi, iki bakteri türü arasında izotopik yer değiştirme oranında anlamlı bir fark (ikili t-testi, p = 9.74 x 10-33) gözlendi. Bu veri seti, birden fazla örnek türünün bulunduğu karmaşık bir ortamda metabolizmayı incelemek için OPTIR-FISH platformunun uygulanmasının fizibilitesinin altını çizmektedir.
<img alt="Mikrobiyal analiz; floresan hibridizasyonu, izotop etiketleme, OPTIR görüntüleme, genotip fenotipi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: Eş zamanlı tür tanımlama ve metabolizma analizi için OPTIR-FISH platformunun şeması. Mikrobiyal topluluğun farklı üyeleri, mikrobiyal ribozomal RNA problarının floresan in situ hibridizasyon yoluyla spesifik bağlanması ile tanımlanabilir ve bağlı floroforların floresan görüntülemesi ile tespit edilebilir. Metabolik aktivite, izotopik substratlarla kültürlenerek analiz edilebilir ve OPTIR görüntüleme ile tespit edilebilir. OPTIR görüntüleme, IR absorpsiyonunun neden olduğu saçılma değişikliğini algılar ve OPTIR, yaygın olarak kullanılan floresan araçlarıyla doğal olarak uyumludur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="İzotop etiketleme proses diyagramı: mikrobiyal BALIK, OPTIR analizi, kimlik belirleme, oranlar." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: OPTIR-FISH tarafından genetik tanımlama ile metabolik aktivitenin tek hücreli analizi için genel iş akışı. (A) Bakteri hücreleri, izotopik olarak etiketlenmiş substratlarla kültürlendi. (B) Daha sonra floresan in situ hibridizasyon (FISH) gerçekleştirildi. (C) IR şeffaf slaytta numune hazırlama. (D) Parlak alan görüntüleri, optimum hücre yoğunluğuna sahip bölgeleri tanımlar. (E,H) Farklı FISH floroforlarının çok renkli floresan görüntülemesi, FISH probları tarafından belirtildiği veya bilinmediği gibi tek tek hücrelerin genetik kimliğini ortaya çıkarır. (F,G) Normal ve kaydırılmış zirvede müteakip multispektral OPTIR görüntülemesi, mikrobiyal biyokütleye izotopik katılımı ortaya koymaktadır. Etiketlenmemiş ve tam etiketli numuneler (katsayı h) için OPTIR spektrumlarına atıfta bulunarak, düzenli (cr) ve izotopik (ci) biyo bileşenlerin nispi katkısı ölçülebilir. Metabolize izotopik olarak etiketlenmiş substratlardan protein sentezi, "izotopik replasman oranı" kullanılarak ölçüldü. (I) OPTIR-FISH ile, karmaşık bir popülasyondaki mikrobiyal türlerin metabolik aktivitesinin yüksek verimli bir analizi elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="12C / 13C-glikoz kullanılarak E. coli'nin spektroskopisi; OPTRIR spektrumları; parlak alan ve OPTIR görüntüleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: Temsili OPTIR spektrumları ve görüntüleme sonuçları. (A) Amid I ve amid II bölgesini kapsayan 12C-glukoz (camgöbeği) ve 13C-glukoz (turuncu) ile kültürlenmiş E. coli hücreleri için OPTIR spektrumları. 13C-glukoz kültürü hücre için berrak kırmızıya kaymış bir amid I zirvesi (1656 cm-1 ila 1612 cm-1) gözlenir. (BD) 12 C-glikoz ve (EG) 13C-glikoz kültür koşulları altında normal amid I ve kaymış amid I bandında E. coli hücrelerinin temsili parlak alan ve OPTIR görüntüleri. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakam Bai ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="OPTIR çıkarma, E. coli ve B. teta niceleme tablosu ile parlak alan ve FISH mikroskobu görüntüleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Şekil 4: Bakteri karışımlarından elde edilen temsili görüntüler ve miktar tayini sonuçları. E. coli hücreleri 13C-glukoz ile inkübe edildi, ardından oligonükleotid probu Gam42a-Cy5 ile hibridizasyon yapıldı. B. teta hücreleri 12C-glikoz ile inkübe edildi, ardından oligonükleotid probu Bac303-Cy3 ile hibridizasyon yapıldı. (A) Parlak alan görüntüsü, hücre karışımının morfolojisini gösterir. (B) İki renkli floresan görüntüsü, E. coli (kırmızı) ve B. theta'nın (yeşil) dağılımını gösterir. (C) OPTIR çıkarma sonucu (1612 cm-1-1656 cm-1) bakteri hücrelerinin protein metabolizmasını gösterir. (D) 13C-glikozdan yeni sentezlenen 13C-proteinini temsil eden izotopik replasman oranının miktarının belirlenmesi. (İkili t-testi: p = 9.74 x 10-33). Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakam Bai ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

optical-photothermal-infrared-fluorescence-situ-hybridization-optir

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Optik çözünürlüklü foto akustik mikroskobu (OR-PAM), görüntüleme optik soğurma yeteneğine sahip gelişmekte olan bir teknoloji...

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Öğrenin OPTIR-FISH yöntemiyle tek hücreli metabolizma analizi ve hücre kimliği belirleme. Bu protokol, karmaşık ortamlarda hücre etkileşimlerini anlamak için optik fototermal kızılötesi görüntüleme ile floresan yerinde hibridizasyonu birleştirir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Daha fazla video keşfet