Name: Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin tek yer fıstığında aflatoksin ve stilbenoid fitoaleksin miktar tayini için SPE-UPLC yöntemini. Bu yöntem, Aspergillus'a dirençli Arachis türlerini belirlemek ve fungal patojenlere karşı genetik direnç kaynaklarını karakterize etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, USDA-ARS CRIS projesi 6044-42000-011-00D ve CRIS projesi 6044-21000-005-000-D tarafından mali destek almıştır. Mini sütun tutma rafını yaptığı için Dan Todd'a teşekkür ederiz. Bu makalede ticari adlardan veya ticari ürünlerden bahsedilmesi, yalnızca belirli bilgiler sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay verildiği anlamına gelmez.

1. Mantar mücadelesi için tohumların hazırlanması
<ol><li>Aflatoksijenik Aspergillus flavus NRRL 3357'yi bir test tüpünde 30 ° C'de 6 gün boyunca eğimli bir Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde inkübe edin. Tween 20 (1 L damıtılmış steril suda 100 μL Tween) ile 10 mL su ile test tüpünden mantar sporlarını hasat edin, bir huniye yerleştirilmiş cam yününden süzün ve sporları kullanım kılavuzuna bakarak bir hemositometre ile sayın.</li>
	<li>Spor süspansiyonunu steril su ile 1.000 spor / μL konsantrasyonuna seyreltin. Konsantrasyonu bir hemositometre ile onaylayın. NOT: Spor süspansiyonunu zorlu deneylerden en geç 2 saat önce hazırlayın.</li>
	<li>Fıstık kabuklarını yavaşça kırın ve kabuklarını çıkarın. Tohumları, tohum hacmi beher hacminin 1 / 5'ini geçmeyecek şekilde steril bir behere yerleştirin, beher hacminin yaklaşık% 70'ine% 0.05 hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin ve tohumların 3 saat boyunca su emmesine izin verin.</li>
	<li><li></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank"></a><ol start="6"><li></li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li> </li><li> </li><li> </li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank"></a><ol start="4"><li></li><li></li></ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank"></a><ol start="6"><li></li><li> </li><li></li><li> </li></ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank"></a><ol start="10"><li></li></ol><ol><li> </li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><li> </li></ol>

Yabani Yerfıstığı Türlerinin Aflatoksin Birikimine Direnç Açısından Değerlendirilmesi

<ol><li>Janila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+breeding+for+introgression+of+fatty+acid+desaturase+mutant+alleles+%28ahFAD2A+and+ahFAD2B%29+enhances+oil+quality+in+high+and+low+oil+containing+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes.</a> Plant Sci. 242, 203-213 (2016).</li>
<li>Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-linear+relationships+between+aflatoxin+B1+levels+and+the+biological+response+of+monkey+kidney+vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells.</a> Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).</li>
<li>American Association for Cancer Research: AACR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+chemicals+and+industrial+processes+associated+with+cancer+in+humans+based+on+human+and+animal+data%3A+IARC+Monographs+Volumes+1+to+20%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20.</a> Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).</li>
<li>Turner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+epidemiology+of+chronic+aflatoxin+driven+impaired+child+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth.</a> Scientifica. , 21(2013).</li>
<li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aflatoxicosis+in+developing+countries%3A+a+review+of+toxicology%2C+exposure%2C+potential+health+consequences%2C+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li>
<li>van Egmond, H. P., Jonker, M. A. Worldwide regulations on aflatoxins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Egmond%2C+HP+%22Aflatoxinandfood+safety%22">Aflatoxinandfood safety</a>. Abbas, H. K. , Taylor and Francis. Baca Raton, Florida. 77-93 (2005).</li>
<li>European Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commission+Regulation+%28EC%29+1525%2F98%5BTitle%5D)+AND+%22Off.+J.+Eur.+Comm.+L%22%5BJournal%5D)">Commission Regulation (EC) 1525/98.</a> Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).</li>
<li>Bressano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+peanut+smut+resistance+from+landraces+to+elite+peanut+cultivars+%28Arachis+hypogaea+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L).</a> PLoS ONE. 14 (2), e0211920(2019).</li>
<li>de Blas, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+smut+resistance+in+wild+Arachis+species+and+its+introgression+into+peanut+elite+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines.</a> Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).</li>
<li>Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+disease+resistance+genes+from+Arachis+kempff-mercadoi+into+cultivated+groundnut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Breeding%22%5BJournal%5D)">Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut.</a> Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).</li>
<li>Moretzsohn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+peanut+%28Arachis+hypogaea+L.%29+and+its+wild+relatives+based+on+the+analysis+of+hypervariable+regions+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome.</a> BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).</li>
<li>Arias, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+to+screen+wild+peanut+species+for+aflatoxin+accumulation+and+genetic+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting.</a> BMC Plant Biol. 18 (1), 170(2018).</li>
<li>Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+of+kernel+water+activity%2C+soil+temperature%2C+maturity%2C+and+phytoalexin+production+in+preharvest+aflatoxin+contamination+of+drought-stressed+peanuts%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts.</a> Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).</li>
<li>Paxton, J. D. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxton%2C+JD+%22Mycotoxins+and+phytoalexins%22">Mycotoxins and phytoalexins</a>. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 485-499 (1991).</li>
<li>Cole, R. J., Dorner, J. W. Peanut phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCole%2C+RJ+%22Mycotoxins+and+phytoalexins%22">Mycotoxins and phytoalexins</a>. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 501-509 (1991).</li>
<li>Subba Rao, P. V., Strange, R. N. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSubba+Rao%2C+PV+%22Handbook+of+phytoalexin+metabolism+and+action%22">Handbook of phytoalexin metabolism and action</a>. Daniel, M., Purkayastha, R. P. , Marcel Dekker. New York. 199-227 (1995).</li>
<li>Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+of+phytoalexin+production+and+disease+resistance+in+selected+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes.</a> J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).</li>
<li>Paxton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoalexins%3A+a+working+redefinition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Phytoalexins: a working redefinition.</a> J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).</li>
<li>Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMansfield%2C+JW+%22Phytoalexins%22">Phytoalexins</a>. Bailey, J. A., Mansfield, J. W. , John Wiley. New York. 153-288 (1982).</li>
<li>Strange, R. N. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrange%2C+RN+%22Plant+response+to+foliar+pathogens%22">Plant response to foliar pathogens</a>. Ayers, P. G. , Biosis Scientific. Oxford. 39-56 (1992).</li>
<li>Sobolev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activity+of+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+phytoalexins+and+selected+natural+and+synthetic+stilbenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids.</a> J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).</li>
<li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+production+of+phytoalexins+by+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+kernels+in+response+to+invasion+by+Aspergillus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species.</a> J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).</li>
<li>Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+stilbenoids+from+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+seeds+challenged+by+an+Aspergillus+caelatus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain.</a> J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).</li>
<li>Trucksess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+column+coupled+with+solution+fluorometry+or+liquid+chromatography+postcolumn+derivatization+for+determination+of+aflatoxins+in+corn%2C+peanuts%2C+and+peanut+butter%3A+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).</li>
<li>Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+two+immunochemical+assays+in+the+analysis+of+peanuts+for+aflatoxin+at+37+field+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories.</a> J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).</li>
<li>Stroka, J., Anklam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+column+cleanup+with+liquid+chromatography+using+post-column+bromination+for+determination+of+aflatoxins+in+peanut+butter%2C+pistachio+paste%2C+fig+paste%2C+and+paprika+powder%3A+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).</li>
<li>Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sample+cleanup+during+immunoassay%3A+a+simple+method+for+rapid+detection+of+aflatoxin+B1+in+food+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples.</a> J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).</li>
<li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid%2C+and+inexpensive+cleanup+method+for+quantitation+of+aflatoxins+in+important+agricultural+products+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC.</a> J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).</li>
<li>Sobolev, V. S., Dorner, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleanup+procedure+for+determination+of+aflatoxins+in+major+agricultural+commodities+by+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography.</a> J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).</li>
<li>Levi, C. P., Borker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+green+coffee+for+potential+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination.</a> J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).</li>
<li>Levi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+study+on+a+method+for+detection+of+aflatoxins+B1+in+green+coffee+beans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans.</a> J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).</li>
<li>Scott, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note+on+analysis+of+aflatoxins+in+green+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Note on analysis of aflatoxins in green coffee.</a> J. AOAC. 51, 609(1968).</li>
<li>Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled-column+system+for+quantitating+low+levels+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins.</a> J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).</li>
<li>Kamimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+cleanup+method+for+analysis+of+aflatoxins+and+comparison+with+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods.</a> J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).</li>
<li>Hoogenboom, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+testing+of+extracts+from+aflatoxin-contaminated+peanut+meal%2C+following+chemical+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Addit.+Contam%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination.</a> Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).</li>
<li>Castro, L., Vargas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+aflatoxins+B1%2C+B2%2C+G1+and+G2+in+maize+using+Florisil+clean+up+with+thin+layer+chromatography+and+visual+and+densitometric+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cienc.+Tecnol.+Ailment.+Campinas%22%5BJournal%5D)">Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation.</a> Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).</li>
<li>Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+Control+of+Aflatoxins+in+Peanut%3A+Method+to+Analyze+Mycotoxin+Production+and+Transgene+Expression+in+the+Peanut%2FAspergillus+Pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem.</a> J. Vis. Exp. (106), e53398(2015).</li>
<li>Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+among+aflatoxin+test+results+on+runner+peanuts+harvested+from+small+field+plots%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Sci%22%5BJournal%5D)">Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots.</a> Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Önceki deneyimlerimize28 dayanarak, Aspergillus'a dirençli türleri tanımlamak ve bu fırsatçı mantara karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazm koleksiyonlarının araştırılması için uygun, basit, ucuz, çevre dostu, kimyasal bir prosedür geliştirdik. Bu yöntem, katı faz ekstraksiyonu (SPE) tekniği ile tohum ekstraktı saflaştırmasına ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) ile aflatoksin miktar tayinine dayanır ve yeterince yüksek geri kazanım, hassasiyet ve doğruluk ile karakterize edilir. Önerilen "Florisil" yöntemi, aflatoksinleri28 güçlü ve seçici bir şekilde tutmak için Florisil'in (magnezyum silika jel) benzersiz özelliğine dayanan tek mini sütun temizleme prosedürünün bir modifikasyonudur. Orijinal yöntemde olduğu gibi, tohum örnekleri MeOH-H2O karışımı ile ekstrakte edildi, ancak yayınlanan 80:20 (h / v) ile karşılaştırıldığında 90:10 (h / v) gibi farklı bir oranda. Bu değişiklik, aynı aflatoksin geri kazanım hızı ile solventlerin temizleme kolonundan akış hızını 2,5 kata kadar artırmıştır. Bu 90:10 (h/h) metanol-su karışımı, 1 g substratta 5-50 ng aflatoksin konsantrasyonlarına eşdeğer başak seviyelerinde ekstraksiyon çözücüsüne eklenen aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 standartlarının yaklaşık %100 geri kazanımını sağladı ve ayrıca çivili fıstık tohumu örneklerinden yeterince yüksek geri kazanımlar sağladı (Tablo 1).
Aflatoksinlerin Florisil adsorbandından sadece büyük hacimlerde aseton30, aseton-metanol31,32 ve aseton-su karışımları 33,34,35,36 ile ayrıştırılabileceği gösterilmiştir. Bu araştırma sırasında, asitleştirilmiş asetonitrilin, Florisil'den aflatoksinleri ayrıştırma kabiliyetinde asetona benzer şekilde davrandığını keşfettik. Bildiğimiz kadarıyla, asetonitrilin bu özelliği literatürde bildirilmemiştir. Bu özelliğin keşfi, saflaştırılmış ekstraktın doğrudan UPLC sistemine enjekte edilmesine izin verir, bu da hazırlama süresini önemli ölçüde azaltan solvent buharlaştırma adımını atlayabilir. Asetonitril aseton (aseton-asetonitril-su-%88 formik asit (65:31:3.5:0.5, h/v)) ile karıştırıldığında bile, saflaştırılmış elüatlardan suyun pürüzsüz, eksiksiz ve hızlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayarak çözücü buharlaşma süresini önemli ölçüde azalttı. Asetonitrilin varlığı, iki ek yıkama çözücüsünün, metanol ve kloroform-metanol karışımının gerekli olduğu yayınlanmış bir yönteme kıyasla, Florisil kolonundaki safsızlıkları etkili bir şekilde gidermek için tek bir çözücü, metanol-su (90:10, v/h) karışımının kullanılmasına izin verdi. 28
Ortalama olarak, aflatoksinlerin elüsyonu için 1.2 mL kullanıldığında aflatoksin B1 standart geri kazanımı ~% 98 idi. 50 mg Florisil miktarı, 1.2 mL elüsyon çözücüsünün mini sütunu namlunun tepesine kadar doldurması ve aynı zamanda tatmin edici bir geri kazanım sağlaması için seçildi (Tablo 1). Bu yaklaşım, kolon varilinin yalnızca bir kez doldurulması gerektiğinden temizleme prosedürünü hızlandırır. Bu projenin ilk aşamalarında, nispeten büyük bir parçacık boyutuna, 100-200 ağa sahip ticari bir Florisil fraksiyonunun, adsorbanın sadece 3 mm'lik bir katmanını tutan küçük bir kolon için uygun olup olmayacağı açık değildi. Bu nedenle, ABD standart test elekleri 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 ve >400 mesh kullanılarak ticari 100-200 mesh ürününden elde edilen farklı Florisil fraksiyonlarını araştırdık. Tüm bu fraksiyonlar, tatmin edici bir geri kazanım ile tekrarlanabilir, neredeyse eşleşen sonuçlar sağladı. Daha küçük parçacık boyutu fraksiyonları, UV ışığı altında kolonda daha dar aflatoksin bantları göstermesine rağmen, bu fraksiyonlar, ticari 100-200 gözenekli üründen hiçbir şekilde üstün değildi. Ek olarak, 100-200 ağ fraksiyonu, tüm prosedür için en kısa elüsyon sürelerini (8-12 dakika) gösterdi.
Gradyan UPLC çözücü dağıtımı, aflatoksinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasına ve ayrıca polar olmayan safsızlıkların kolondan tamamen uzaklaştırılmasına izin verdi (Şekil 5G). Bu yaklaşım, kusursuz kolon çalışmasına ve yüzlerce numunenin analizinin tekrarlanabilir sonuçlarına yol açtı. Florisil sütunundan çıkarılan aflatoksinlerin kimliği daha önce açıklandığı gibi doğrulandı. 28 Burada kullanılan 3 mm çaplı analitik UPLC kolonu, aynı kimyanın 2,1 mm çapındaki kolonuna kıyasla daha yüksek konsantrasyonlarda aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2'nin daha yüksek seçicilik ve daha güvenilir bir şekilde ayrıldığını göstermiştir. Ayrıca, 3 mm'lik kolonun uzun ömürlülüğü (1.200'den fazla enjeksiyon), 2.1 mm'lik kolonun (800 enjeksiyona kadar) ömründen önemli ölçüde daha yüksekti. 3 mm'lik kolon daha yüksek bir mobil faz oranı (%40 daha fazla) gerektirse de, bu dezavantaj kolonun yukarıdaki avantajlarından daha iyi performans gösterdi.
Florisil mini kolonu, Aspergillus metabolitleri ile yoğun şekilde kontamine olmuş yer fıstığı tohumlarının ekstraktlarının saflaştırılması için etkiliydi (Şekil 5G); Bu tür tohumlar ayrıca mantar istilasına yanıt olarak tohumlar tarafından üretilen yüksek seviyelerde stilbenoid fitoaleksin içeriyordu. Tüm bu safsızlıklar, tohumlardaki aflatoksin konsantrasyonunu 106 kat22'ye kadar aşabilir ve bu da bu tohumları aflatoksin analizleri için zorlu nesneler haline getirir. Şekil 5G , aflatoksin tutma süreleri içinde kromatogramda enterferans yapan piklerin eksikliğini göstermektedir, bu da aflatoksin tespitini ve kantitasyonunu test edilen tüm seviyelerde tavizsiz hale getirmiştir (Tablo 1). Tablo 1'de görüldüğü gibi, yöntemin doğruluğu ve kesinliği, aynı zamanda aflatoksin tespiti için en kritik aralık olan test edilen 1.0-50.0 ng/g aralığında yeterince yüksekti. Çeşitli yabani fıstık genotipleri için farklı seviyelerdeki geri kazanımlar tekdüzeydi ve beş farklı ekstraksiyon için standart sapmalar esasen düşüktü.
Yöntem ayrıca, 10.000 ng / g'ın üzerinde toplam aflatoksinler içeren sıfırdan son derece yüksek seviyelere kadar doğal olarak kontamine olmuş yer fıstığı, pamuk, mısır ve pirinç tohumları üzerinde de test edildi. Mısır, pamuk tohumu ve pirinçten 5 ng/g düzeyinde aflatoksin B1, B2, G1 ve G2 geri kazanımı sırasıyla %76.1 ile %93.7, %77.1 ile %86.6 ve %90.5 ile %96.2 arasında değişmiştir. Pirinçten aflatoksinlerin en yüksek geri kazanımına, eluentin "saflığı", yani neredeyse herhangi bir safsızlık eksikliği eşlik etti. Ayrıca, pirinç, ortalama olarak 19 mg / tohum test edilen en küçük tek nesneyi temsil etti.
Bir Florisil sütunu kullanılarak tek bir fıstık tohumu için (bombardıman, tartma, ekstraksiyon, santrifüjleme ve saflaştırma dahil) toplam hazırlama süresi 20 dakikayı geçmedi. Florisil mini sütununun maliyeti, ticari temizleme sütunlarından >10 kat daha azdır. Yayınlanan prosedüre kıyasla daha düşük hacimlerde adsorban, çözücü ve nitrojen gazı kullanılmasından ek tasarruf sağlanır28. Mini kolon, çalışması için pompalama veya vakum cihazları gerektirmez ve belirsiz bir raf ömrüne sahiptir.
Bitki germplazmını aflatoksinlere direnç açısından araştırmak son derece zordur çünkü mikotoksin birikimi normal bir dağılım izlemez37,38; Bu olgunun üstesinden gelmek için tek tohumlarda çok sayıda aflatoksin analizine ihtiyaç vardır. Aflatoksin içeriğinin yanı sıra, kantitatif fitoaleksin bileşimi ile ilgili bilgiler, tek bir tohumdan elde edilebilecek (Şekil 1A) ve belirli bir bitkiye kadar izlenebilecek (Şekil 1E) geniş bir bilgi birikimi ışığında oldukça değerlidir. Yöntem, arazi ırkları, gelişmiş ıslah hatları ve elit fıstık çeşitleri dahil olmak üzere yüzlerce katılımı taramak için başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, yer fıstığı ön ıslah ve ıslah araştırma programlarında kullanılmak üzere önerilmektedir ve mantar direnci için yer fıstığı genlerinin karakterizasyonuna yardımcı olabilir.

Yer fıstığı (Arachis hypogaea L.), dünyanın en önemli gıda ürünlerinden biridir. 100'den fazla ülkede yetiştirilmekte ve toplam üretimi 45 milyon tonu aşmaktadır1. Yer fıstığı, mısır ve pamuk tohumu gibi tarımsal ürünler genellikle aflatoksin üreten toprak kaynaklı mantarlar olan Aspergillus türleri tarafından istila edilir2. Bu ürünler, çevresel koşullar yüksek sıcaklıklar ve kuraklık ile karakterize edildiğinde, hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonuna karşı özellikle hassastır. Aflatoksinler bilinen en güçlü kanserojenler arasındadır3. Dünyadaki tarımsal emtiaların dörtte birinikirletiyorlar 4 ve dünya nüfusunun yaklaşık yarısını kronik olarak aflatoksinlere maruz bırakıyorlar5. Yüksek kanserojenlikleri ve toksisiteleri nedeniyle, gıdalardaki aflatoksin varlığı, dünyanın çoğu ülkesinde pratik olarak kabul edilebilir en düşük sınırlarda düzenlenmektedir6.
Avrupa Birliği (AB), insani tüketim ürünlerindeki aflatoksin B1 için maksimum 2 ng/g ve toplam aflatoksinler (B1, B2, G1 ve G2) için maksimum 4 ng/g seviyesini yasalaştırmıştır7. Bu tür düşük limitler, aflatoksinlerle kontamine olmuş malları işleyen tarım ve gıda endüstrisi üzerinde önemli bir baskı oluşturmaktadır. Kontamine yer fıstığının aflatoksin izlemesi ve yeniden işlenmesi, aflatoksinlerin gıda zincirine girmesini önlemek için pasif ve maliyetli bir strateji olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, yer fıstığı endüstrisinin tüm büyük segmentleri, genellikle mantar hastalıklarına karşı sınırlı direnç gösteren mevcut yer fıstığı çeşitlerinin aflatoksin kontaminasyonu nedeniyle muazzam kar kayıpları yaşamaktadır. Aflatoksin problemini çözmek için ileriye dönük bir yaklaşım, gen introgresyonu yoluyla mantara dirençli yer fıstığı çeşitlerinin elde edilmesi, yani genetik bilginin dirençli yabani yer fıstığı türlerinden elit çeşitlere aktarılmasıdır. Son yıllarda 8,9, yabani yer fıstığı türleri, genetik hastalık direncinin kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır, çünkü kültür yer fıstığının dar genetik tabanı artık yer fıstığı bitkisine ihtiyaç duyulan direnç özelliklerini sağlayamamaktadır10,11. Yabani yer fıstığı türlerinden başarılı bir şekilde introgresyon, binlerce tek, küçük ve kıt tohumun analizini gerektirir (Şekil 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg"> Şekil 1: Tek tohum analizi akış şeması. (A) Farklı pazar tipi yer fıstığı çeşitlerinin karşılaştırmalı büyüklüğü ile yabani Arachis spp. (1) Virginia; (2) koşucu; (3) İspanyolca; (4) yabani Arachis spp. (B) Yabani Arachis spp. (levha A, tohum 4) üç bölüme ayrılmış, (5) embriyonik eksenli yarım tohum; Tohumun bu kısmı bir bitki yetiştirmek için kullanılır (E). (C) (6) ve (7) numaralı parçalar bir matkap ucu ile delinir ve (D) mantar sporları ile aşılanır. 30 °C'de 72 saat inkübasyondan sonra, tohum parçalarından biri (6) veya (7) aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için, diğeri ise RNA/transkriptom dizilimi için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mantar patojenlerine karşı yer fıstığı direnci, fitoaleksinler 13,14,15,16,17 ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Yer fıstığı fitoaleksinleri, ekzojen uyaranlara, özellikle mantar istilasına maruz kaldıktan sonra bitki dokularında biyosentezlenen ve biriken antimikrobiyal stilbenoidler ile temsil edilir 16,17,18. Mantar istilası bölgesinde yeterli konsantrasyonda fitoaleksin birikimi mantar büyümesini engeller ve bitki savunması için kritik öneme sahiptir 19,20,21. Fitoaleksinler inhibitör konsantrasyonlara(16,22) biriktiğinde patojen büyümeyi durdurur. Yer fıstığında aflatoksijenik mantarlara karşı savunma bileşikleri olarak stilbenoidlerin rolü, 30 yılı aşkın bir süre önce saha deneylerindedeğerlendirildi 13. Bu deneyler, yer fıstığı stilbenoidlerinin hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonunda çok önemli bir direnç faktörü olduğu hipotezini açıkça destekledi. Bu tür kanıtlar, stilbenlerin tarlada zarar görmüş yer fıstığında doğal olarak üretildiği gerçeğine dayanmaktadır; stilbenler, aflatoksijenik mantarlara karşı kayda değer biyolojik aktivite gösterir; Tohumlardaki aflatoksin kontaminasyonu, yalnızca yer fıstığı kuraklığa bağlı tohum dehidrasyonu nedeniyle fitoaleksin sentezi kapasitesini kaybettiğinde tespit edildi. Başka bir saha deneyi seti, fitoaleksin üretimi ile tarımsal açıdan önemli yer fıstığı hastalıklarına karşı yer fıstığı genotip direnci arasındaki ilişkiyi doğruladı17.
Mantar istilasına karşı yer fıstığı direncinin doğal fitoaleksin bazlı mekanizmasının daha iyi anlaşılması, aflatoksin kontaminasyonunun kontrolü için umut verici bir stratejidir 15,17.Bu nedenle, aflatoksin analizlerine ek olarak, aynı tohumların fitoaleksinler için kantitatif olarak analiz edilmesi önemlidir. Bu direnç mekanizması tam olarak araştırılmamış ve anlaşılmamış olsa da, mantara dayanıklı yeni çeşitler için yer fıstığı bitkilerinin ıslahı ve genetik olarak değiştirilmesi için çok önemlidir23. Farklı ürünlerde aflatoksin tayini için çeşitli analitik prosedürlerin varlığına rağmen, özellikle geleneksel yöntemlerin analitik ve maliyet etkin gereksinimleri karşılamadığı durumlarda, belirli araştırmalar için hala basit yöntemlere ihtiyaç vardır. Yer fıstığı endüstrisi, tarım ve özel laboratuvarlar tarafından kullanılan modern temizleme yöntemlerinin çoğu antikor bazlı24 ve immünoassay 25,26,27 cihazlarıdır. Seçici ve hassastırlar, ancak yaygın adsorbanlarla dolu mini sütunlardan önemli ölçüde daha pahalıdırlar. Ek olarak, bu yöntemlerin hiçbiri birkaç miligram ağırlığındaki numunelerin analizi için tasarlanmamıştır. Magnezyum silika jel (Florisil) ile paketlenmiş mini kolonların28 analitik kullanımına ilişkin önceki araştırmamıza dayanarak, bu prosedürü devam eden ve ileriye dönük ön ıslah ve ıslah programlarının ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirdik.
Bu çalışmanın amacı, tek yer fıstığı tohumlarında aflatoksinlerin ve fitoaleksinlerin kantitatif tayini için tahribatsız, orta verimli, çevre dostu bir yöntem geliştirmekti. Böyle bir yöntem geliştirilmiştir. Yayınlanmış yöntemlere göre avantajları, daha yüksek hassasiyet, aflatoksinleri ve fitoaleksinleri tek tohum ekstraktında analiz etme yeteneği, numuneleri tartma ihtiyacının olmaması ve daha küçük hacimli sarf malzemeleri sayesinde daha düşük maliyettir. Entegre yöntemin akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Genetik analizler ve diğer adımlar bu metinde belirtilmiş ve önerilen yöntemin önemini ve tüm prosedürle nasıl entegre edildiğini göstermek için şekilde gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Aseton, Optima Fisher</td><td>Scientific</td><td>A929-4</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Beraat BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard sütun öncesi</td><td>Waters Corporation</td><td>186003975</td><td></td></tr><tr><td>Beraat BEH C18 3 x 100mm sütun</td><td>Waters Corporation</td><td>186004661</td><td></td></tr><tr><td>Beraat BEH C18 2.1 x 100mm sütun</td><td>Sular Şirketi</td><td></td><td></td>186002352</tr><tr><td>Aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9441-1VL</td><td>5 & mikro elde etmek için ticari şişenin içeriğini 5 mL metanol içinde çözün; aflatoksinler B1 ve G1 ve 1.5 & mikro için g / mL; B2 ve G2 için g / mL</td></tr><tr><td>Aflatoksin B1 (1mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6636-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksin B2 (1mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9887-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksin G1 (1mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0138-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksin G2 (1mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0263-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksin M1 (10 & mikro; g)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CRM46319</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Granül (2kg)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>BD214510</td><td></td></tr><tr><td>Alümina oksit bazik (60-325 mesh)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A941-500</td><td></td></tr><tr><td>Bazal orta</td><td>Murashige ve Skoog</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Ruptor 24 & nbsp;</td><td>Omni International</td><td>19-042E Beher</td><td></td></tr><tr><td>(1000mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>10001L</td><td></td></tr><tr><td>Beher (250mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000250</td><td></td></tr><tr><td>Beher (400mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000400</td><td></td></tr><tr><td>Beher (600mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000600</td><td></td></tr><tr><td>Bıçak, neşter</td><td>Tüy#</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (LSE Kompakt)</td><td>Corning</td><td>Model: 6755</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, mikro</td><td>Corning Model</td><td>: 6770</td><td></td></tr><tr><td>Seramik boncuklar (2,8 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-646</td><td></td></tr><tr><td>Seramik boncuklar (6,5 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-682</td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 7 serisi Yazılım</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matkap ucu</td><td>Kyocera</td><td>07896</td><td>1,6 mm</td></tr><tr><td>Matkap ucu</td><td>Kyocera</td><td>07357</td><td>2,0 mm</td></tr><tr><td>Matkap ucu</td><td>Kyocera</td><td>07985</td><td>2,34 mm</td></tr><tr><td>Etanol (200 geçirmez)</td><td>Decon Labs</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatör, nitrojen</td><td>organimation</td><td>11106</td><td>6 konumlu</td></tr><tr><td>Excel, Microsoft</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı (# 3)</td><td>Cytiva Whatman</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı kesici, paslanmaz çelik (ID 11,5 mm)</td><td>Bilinmiyor Filtre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kağıdı, cam elyaf</td><td>Cytiva Whatman</td><td>934-AH</td><td></td></tr><tr><td>Şişe (2800mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>44202XL</td><td></td></tr><tr><td>Florisil (100-200 ağ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F101-500</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Integra Lifescience ( Miltex)</td><td>PM-0300</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit (%88, ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu (-80oC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSX70086D</td><td></td></tr><tr><td>Hunisi (15 x 80mm)</td><td>DWK Yaşam Bilimleri (Kimax)</td><td>2902060</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan (orta)</td><td>Caisson Labs&nbsp;</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>Cam çubuk (ısmarlama)</td> <td>Özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam yünü</td><td>Corning (Pyrex)</td> <td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Sap, neşter ve nbsp;</td><td>Tüy</td> <td># 7</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td>%30, Sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>Buz kovası, kapaklı yuvarlak</td><td>Corning</td><td>432122</td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka Makinesi</td><td>Percival</td><td>136VL</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech BİLİM Markası Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>8.2" x 4.39 "</td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Marka Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34256</td><td>16.4" x 14.43 "</td></tr><tr><td>Laboratuvar önlüğü</td><td>Cenmed</td><td>B113660SBXL</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini sütun rafı (özel)</td> <td>Özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikser, dokunmatik (maxi mix II)</td> <td>Termolyne</td><td>37600 (model 231)</td><td></td></tr><tr><td>Nitril eldiven &</td><td>Microflex</td><td>XC310M</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazı, sıkıştırılmış (ultra yüksek saflıkta)</td><td>Jones Kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td>Georgia-Pacific</td><td>20023 (D400)</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-636-AB15</td><td></td></tr><tr><td>pH/ATC elektrot</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-111</td><td></td></tr><tr><td>PhCR Fotokimyasal Reaktör</td><td>Sular (Vicam)</td><td>600001222</td><td></td></tr><tr><td>Pipet, pastör</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9"</td></tr> <tr><td>Pipetleyici (1 mL) (Referans 2)</td><td>Eppendorf</td><td>4924000088</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyici (10 &mu; L) (Referans)</td><td>Eppendorf</td><td>022470051D</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları: 10 &mu; L, 200 &mu; L, 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyici (200 & mikro; L)(Ergofit)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-146-679</td><td></td></tr><tr><td>Tabak, petri (100x15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Patates Dekstroz Agar (500g)</td><td>Becton Dickinson&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>BD213400</tr><tr><td>Takviyeli boncuk tüpü (2 mL)</td><td>Omni International</td><td>19-660</td><td></td></tr><tr><td>Takviyeli boncuk tüpü (7 mL)</td><td>Omni International</td><td>19-651</td><td></td></tr><tr><td>Repipetör, Dispensette III (10mL)</td><td>Brandtech</td><td>4701141</td><td></td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5010-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Kepçe (ısmarlama)</td><td>Özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vidalı kavanoz (250 mL)&nbsp;</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1395250</td><td></td></tr><tr><td>Silika jel, küresel (200-400 mesh)&nbsp;</td><td>Supelco</td><td>97727-U</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SPE özü temiz 1,5 mL polipropilen kolon&nbsp;</td><td>Amerikan Kromotografi Malzemeleri</td><td>SP-5122382</td><td></td></tr><tr><td>SPE özü temiz PP frits (1,5 mL mini sütun için)</td><td>Amerikan Kromotografi Malzemeleri</td><td>SP-3119414</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre, UV görünür</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-385-351 (Genesys 50)</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpü</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>982516X</td><td>16x125mm</td></tr><tr><td>Test tüpü (Tek Kullanımlık)(16x125mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpü (Tek kullanımlık)(150x250mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-34</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish DAD dedektörü (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D11-A-01</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Fluourescense dedektörü (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D51-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish kuaterner pompa F (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-P20-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Split Numune Alıcı FT (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-A10-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20) (enzim sınıfı)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Flakon kapakları (4 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-75A</td><td></td></tr><tr><td>Flakon kapakları (otomatik numune alma cihazı)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-60A</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler ve kapaklar (16 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7800-4</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler, cam (4 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-1</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler, polipropilen (otomatik numune alma cihazı) (400 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-11</td><td></td></tr><tr><td>Su, Optima&nbsp;</td><td>Balıkçı Bilimsel</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

tek yer fıstığında (arachis spp.) aflatoksinlerin ve stilbenoid fitoaleksinlerin tahribatsız spe-uplc tabanlı miktar tayini tohum

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

Aflatoksinler, başta Aspergillus flavus olmak üzere bazı mantar türlerinin oldukça kanserojen ikincil metabolitleridir. Aflatoksinler genellikle yer fıstığı da dahil olmak üzere ekonomik açıdan önemli tarımsal ürünleri kirleterek insan ve hayvan sağlığı için yüksek risk oluşturur. Dar genetik taban nedeniyle, yer fıstığı çeşitleri mantar patojenlerine karşı sınırlı direnç gösterir. Bu nedenle, Aspergillus'a toleransı olan çok sayıda yabani fıstık türü, bilim adamları tarafından hastalık direnci kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır.
Aflatoksinlere direnç için bitki germplazmını araştırmak zordur, çünkü aflatoksin birikimi normal bir dağılım izlemez, bu da binlerce tek fıstık tohumunun analizine duyulan ihtiyacı belirler. Yeterince hidratlı yer fıstığı (Arachis spp.) tohumları, Aspergillus türleri tarafından enfekte edildiğinde, savunma fitoaleksinleri olarak kabul edilen biyolojik olarak aktif stilbenler (stilbenoidler) üretebilir. Yer fıstığı stilbenleri mantar gelişimini ve aflatoksin üretimini engeller. Bu nedenle, Aspergillus istilasına karşı tohum direncinin/duyarlılığının doğasını açıklamak için yer fıstığı stilbenoidleri için aynı tohumları analiz etmek çok önemlidir. Yayınlanan yöntemlerin hiçbiri aflatoksinler ve/veya stilben fitoaleksinler için tek tohum analizleri sunmamaktadır.
Çevre dostu, ucuz sarf malzemeleri kullanan, hassas ve seçici olan böyle bir yönteme olan talebi karşılamaya çalıştık. Ek olarak, yöntem tohumun sadece yarısını kullandığı ve embriyonik ekseni içeren diğer yarısını sağlam bıraktığı için tahribatsızdır. Böyle bir teknik, yer fıstığı bitkisinin çimlenmesine ve büyümesine, aflatoksin ve stilbenoid analizi için kullanılan aynı tohumdan tam olgunluğa izin verir. Bu yöntemin entegre kısmı olan Aspergillus ile tohumların manuel olarak zorlanması, yöntemdeki diğer adımlara göre daha fazla zaman ve emek gerektiren sınırlayıcı bir adımdır. Yöntem, Aspergillus'a dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazmının araştırılması için kullanılmıştır.

Tohumlarda aflatoksin miktar tayini için geliştirilen yöntem, yabani yer fıstığı türlerinin aflatoksin birikimine direnç açısından değerlendirilmesi prosedürünün tamamının özüdür. Özel olarak paketlenmiş mini sütunlar ve filtreler, büyük hacimli solventlerin olmaması, maliyetli ve gereksiz 0,22 veya 0,45 μm ticari filtreler ve pompalama cihazları nedeniyle önemli ölçüde tasarruf sağlar ve genel prosedürü basitleştirir. Aflatoksin analizleri yöntemi, Tablo 1'de görüldüğü gibi öğütülmüş tohumlardan test edilen 1.0-50.0 ng/g aflatoksin aralığında yüksek geri kazanım, doğruluk ve hassasiyet sağlar. Yüksek derecede kontamine olmuş numuneler, doğrusal test edilen değere seyreltildi. Şekil 5C , dört ana aflatoksinin, B1, B2, G1 ve G2'nin 5 dakikalık elüsyon süresi içinde temel olarak ayrılmasını göstermektedir, bu da yer fıstığı tohumlarının mantar mücadelesi prosedürün sınırlayıcı aşaması olduğundan ve UPLC analizlerinden değil, kabul edilebilir.
Önerilen yöntem, aflatoksin B1 için 2 pg'lik bir kantitasyon limiti ile yeterince hassastır (Şekil 5D). Ekstraktların yüksek saflığı, yabani bir Arachis türüne sahip bir tarladan hasat edilen saflaştırılmış tohum ekstraktının bir UPLC'sinden (Şekil 5E) görüldüğü gibi aflatoksinlerin kesin olarak ölçülmesine izin verir. Daha önce yayınlanmış bir mini sütun yöntemi29, önerilen yönteme (Şekil 5G) kıyasla mantarla mücadele edilen yer fıstığı tohumları (Şekil 5F) için tatmin edici saflık elde etme yeteneğine sahip değildir. Şekil 5F'den, aflatoksinler B2, G1 ve G2'nin, birçoğu aflatoksinlerden sonra ayrıştırılan stilbenoid fitoaleksinler ve mantar metabolitleri olan yüksek konsantrasyonlarda enterferans yapan safsızlıkların varlığı nedeniyle güvenilir bir şekilde tespit edilemediği ve miktarının belirlenemediği açıktır. Buna karşılık, Şekil 5G, magnezyum silika jel kolonunun aflatoksin fraksiyonundaki safsızlıkların giderilmesindeki yüksek verimliliğini göstermektedir. Mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10) karışımı ile yıkanan enterferans yapan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1'in gizlenmemiş zirvelerini gösterir. Bu kromatogram, zorlu bir yabani tür tohumunun ekstraktını temsil eder. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng/g'dır.
Yer fıstığı fitoaleksinlerinin kantitasyonu, bir tarladan elde edilen doğal bir tohum veya mantarla mücadele eden bir tohum olabilen aynı tohumdaki aflatoksinlerin analizlerine değerli bir katkı sağlar. Şekil 5H, zorlu bir tohumdan elde edilen fıstık savunma stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramını göstermektedir. Bileşiklerin ayrılması, aflatoksin analizleri için kullanılan aynı analitik kolon kullanılarak gerçekleştirilir. Kolon ve seçilen kromatografik koşullar, stilbenoidlerin güvenilir bir şekilde kantitasyonuna izin veren piklerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlar. Sorunlu tohumlarda aflatoksin-fitoaleksin ilişkisinin değerlendirilmesi bu sunumun kapsamı dışındadır ve yöntem burada, yazarların laboratuvarında birkaç yıldır kullanılan ve yararlı olduğu kanıtlanmış potansiyel bir araştırma aracı olarak önerilmektedir.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg"> Şekil 6: Majör aflatoksinlerin ve stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları. (A) Majör aflatoksinlerin yapıları: 1, B, 1; 2, B, 2; 3, G1; 4, G2. (B) Başlıca stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları: 6, resveratrol; 7, Araşidin-1; 8, Araşidin-2; 9, Araşidin-3; 10, IPD (3 "-izopentadienil-3,5,4" -trihidroksistilben); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Spike seviyesia (ng/g)</td>
			<td colspan="4">Aflatoksinler</td>
		</tr><tr><td>B1</td>
			<td>B2</td>
			<td>G1</td>
			<td>G2</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Florisil sütunu ve 1.2 mL aflatoksin fraksiyonu elüsyon karışımı kullanılarak yer fıstığı tohumlarından aflatoksinlerin geri kazanımı. [ortalama (SD), %; n = 5]. Georgia 06G yer fıstığı çeşidine ait aflatoksin içermeyen öğütülmüş numuneler (50 g), 50, 5 veya 1 ng/g seviyesinde aflatoksin stok çözeltisi içeren bir mikro şırınga yardımıyla eşit şekilde çivilenmiş ve oda sıcaklığında 16 saat bekletilmiştir . Aflatoksinler B1 ve G1 için ani değerler verilmiştir; aflatoksinlerB2 ve G2 için 0.33 çarpma faktörü kullanılmalıdır.

Ultra performanslı sıvı kromatografisi kullanarak tek fıstık tohumlarında aflatoksinlerin ve stilbenoid fitoaleksinlerin miktar tayini için orta verimli bir yöntem gösteriyoruz. Bu yöntem, aflatoksijenik Aspergillus türleri tarafından zorlanan yabani Arachis türlerinin analizleri için özel olarak geliştirilmiştir.

Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

Araştırmanın kapsamı, yabani Arachis germplazmının araştırılması için binlerce yer fıstığı tohumunda aflatoksinlerin ve savunma fitoaleksinlerinin miktar tayini için bir yöntem geliştirmek, aspergillusa dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmekti. Araştırma grubumuz, aflatoksin biriktirmeyen yer fıstığı germplazmını tanımlamak için en umut verici yaklaşımın, transkriptomikleri, genomikleri, fitoaleksinleri ve mikotoksin profilleri dahil olmak üzere her bir tohumun bütünsel bir analizini yapmak olduğunu bulmuştur. Yabani ve ekili fıstık tohumu analizi için protokoller geliştirdik, bu da kimyasal profilleme için tek bir tohumun 1 / 4'ünü kullanmak, Yer fıstığı tohumu örneklerinde fitoaleksinlerin etkili tohum mücadelesi, ekstraksiyonu ve doğru miktar tayini için yüksek verimli yöntemler geliştirmek anlamına geliyor.Çok sayıda yer fıstığı fitoaleksini keşfettik ve aflatoksin analizinin yanı sıra aflatoksin birikimi azalmış veya hiç olmayan yer fıstığı germplazmının taranması için verimli ve ucuz yöntemler geliştirdik. Yöntemler, genotipleme ve tohum canlılığının belirlenmesini içerir.

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Bu fungus, Aspergillus flavus aflatoksin sentezi genleri sessizleşme RNA-parazit sinyalleri içeren yerfıstığı tohumlarda aflatoksin ve transgen ekspresyonunun analizi için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bitkilerde mikotoksin RNAi aracılı kontrolü önceden bildirilmemiştir.

Yerfıstığı aflatoksin RNAi aracılı Kontrol: Yöntem Yerfıstığı Mikotoksin Üretim ve Transgen Anlatım Analiz /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Yüksek saflıkta RNA izolasyonu üzerinde inhibitör etkileri olan büyük miktarlarda yağ, protein ve polifenol içeren bitki tohumlarından RNA izolasyonu için bir yöntem oluşturmayı başardık. Yöntemimiz, tohumlarda düşük seviyeli transkriptlere sahip genlerin ekspresyonunu izlemek için uygundur.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Burada uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LERLIC-MS / MS) yöntemi bir adım adım protokol mevcut. Bu av tüfeği proteomik tarafından glutamin ve asparajin deamidasyon izoformlarının ilk kez ölçümü ve karakterizasyonu için sağlayan bir roman yöntemdir.

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Öğrenin tek yer fıstığında aflatoksin ve stilbenoid fitoaleksin miktar tayini için SPE-UPLC yöntemini. Bu yöntem, Aspergillus'a dirençli Arachis türlerini belirlemek ve fungal patojenlere karşı genetik direnç kaynaklarını karakterize etmek için kullanılır.

Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum (Video) | JoVE Journal

Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum

Daha fazla video keşfet