Name: Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği protokolünü. Bu yöntem, yerel DNA dizileri üzerinde hızlı nükleozom montajı sağlar ve reaktif kullanımını azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Tek moleküllü çalışmalar için yerinde nükleozom sulandırması

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x HR tamponu</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp; tris&nbsp; asetat pH 7.5, 20 mM magnezyum asetat, 50 mM potasyum klorür, 0.1 mg/mL BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su)</td> <td>N / A</td><td>N / A</td><td>137 mM sodyum klorür, 2.7 mM potasyum klorür, 10 mM sodyum fosfat dibazik, 1.8 mM potasyum fosfat monobazik&nbsp;</td></tr><tr><td>Asetik asit, buzul</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>Tris asetat yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Çözün H2O'da ve 0.22 um filtreden geçer</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimide Mono-Reaktif</td><td>Boya Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimid işlevselleştirilmiş Cy3 florofor</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td> Soğutmalı Etil alkollü <td>tezgah üstü santrifüj</td></tr><tr><td>, Saf</td><td>Millipore Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>H2O'da 0,5 M'ye</td></tr> çözün <tr><td>İnsan histon oktameri (H4, L50C; H2A, K119C)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Rekombinant histon proteinleri ve etiketleme mutasyonlarını barındıranlar, daha önce tarif edildiği gibi kurum içinde saflaştırıldı (bkz. ref. 33, 34, 35, 36). Kısaca rekombinant histonlar BL21 (De3) pLySS hücrelerinde (Promega) eksprese edildi. İnklüzyon cisimleri sonikasyondan sonra izole edildi ve histonlar denatüre edici koşullar altında ekstrakte edildi. Histonlar tampon A'ya (7 M üre, 10 mM tris hidroklorür pH 8.0, 100 mM sodyum klorür, 1 mM EDTA ve 5 mM 2-merkaptoetanol) diyalize edildi ve çözelti, Q Sefaroz Hızlı Akış (Cytiva) ile yüklü bir yerçekimi kolonuna eklendi. Akış daha sonra yerçekimi kolonu yüklü bir SP Sefaroz Hızlı Akış'a (Cytiva) eklendi ve histonlar, 600 mM sodyum klorür ile takviye edilmiş tampon A eklenerek kolondan ayrıştırıldı. Etiketleme mutasyonlarını barındıran histonlar (H4, L50C; H2A, K119C) saflaştırıldı ve daha sonra 20: 1 boya-protein molar oranı kullanılarak maleimid ile işlevselleştirilmiş boyalar (Cytiva, Lumidyne) yoluyla istenen florofora konjuge edildi (bkz. ref. 33, 34). Histon oktamerleri, denatüre edici koşullar altında her bir vahşi tip veya florofor etiketli histonun eşit bir molar oranı eklenerek birleştirildi, 2 M sodyum klorür içeren yüksek tuzlu bir tampona diyaliz edildi ve daha sonra daha önce tarif edildiği gibi boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırıldı (bkz. ref. 36, 37). Alternatif olarak, bireysel histon proteinleri ve hazır histon oktamerleri ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Epicypher).&nbsp;</td></tr><tr><td>Görüntü arabelleği</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 20 mM tris hidroklorür pH 8.0, 100 mM sodyum klorür</td></tr><tr><td>Klenow Parçası (3' ila 5' ekzo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA (dam-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Metilasyon içermeyen ve lambda; DNA</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Teknolojileri</td><td>9</td><td>Maleimid işlevselleştirilmiş LD655 florofor</td></tr><tr><td>Bağlayıcı histon H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Şirket içinde yapılan saflaştırılmış rekombinant protein (bkz. ref. 38)</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICKS</td><td>N/A</td><td>Çift tuzak konfigürasyonu; üretici tarafından sağlanan cihaz için standart malzemeler</td></tr><tr><td>Magnezyum asetat çözeltisi</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>HR tamponu yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Klenow Fragment kit ile birlikte verilir</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>H2O'da çözün ve 0.22 um filtreden geçirin</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>PBS ve HR tamponu yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS</td></tr><tr><td>S. cerevisiae</em</td> yapmak için kullanın> <td>Nap1 N/A</td><td>N/A</td><td>Nap1, daha önce açıklandığı gibi şirket içinde saflaştırılmıştır (bkz. ref. 33, 34). Alternatif olarak, Nap1 ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Active Motif).</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>H2O'da 3 M'ye Çözün</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>PBS ve görüntü tamponu yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>PBS SPHERO Biotin Kaplı Parçacıklar (3.0-3.4 ve mikro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop Spektrofotometre</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>H2O'da çözün ve uygun pH'a ayarlayın; Görüntü arabelleği ve tris asetat yapmak için kullanın</td></tr></tbody></table>

tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Adım 3'te (Şekil 1A) açıklanan kurulum kullanılarak, DNA bağı boyunca nükleozom oluşumu, bir 2D taramada kırmızı floresan odakların görünümü (Şekil 1B, solda) veya bir kimografide zaman içinde yörüngeler (Şekil 1B, sağ) olarak görselleştirildi. Düzgün bir şekilde sarılmış nükleozomlar, konfokal tespitin kırınım sınırı (~ 300 nm) içinde zaman içinde sabit olan floresan yörüngeleri verdi. Özellikle, kırınım sınırı altında birbirine yakın oluşan çoklu nükleozomlar uzamsal olarak çözülemez ve daha parlak odaklar veya yörüngeler olarak görünür. Bununla birlikte, tek tek nükleozomal yörüngelerin fotoağartma adımları analiz edildi ve sıklıkla 1 adımlı (Şekil 1C) veya 2 adımlı (Şekil 1D) fotoağartma olayları gösterdi, bu da odakların bu numunedeki H4 proteininin yaklaşık% 70 etiketleme oranı göz önüne alındığında çoğunlukla mononükleozomlar içerdiğini gösterir. Ayrıca, bu deneysel koşulda tek bir LD655 florofor için ortalama foton sayısına dayanarak, her bir nükleozom yörüngesindeki etiketli H4 kopyalarının sayısı tahmin edildi ve nükleozom lokuslarının ağırlıklı olarak (%&gt;75) 1 veya 2 etiketli H2A kopyası içerdiğini gösterdi (Şekil 1E), yine bunların esas olarak uzamsal olarak ayrılmış mononükleozomlar olarak yüklendikleri fikriyle tutarlıdır. Diğer daha parlak odaklar, muhtemelen kırınım sınırı içinde çoklu nükleozomları temsil eden 3'ten fazla etiketli H4 kopyası içeriyordu.
Nükleozom oluşumu, histon oktamerlerinin etrafına daha fazla DNA sarılırken OT'lerin konumları sabit kaldığında, bağ boyunca gerilimde bir artışla da izlendi (Şekil 1B, altta). Nap1'in yokluğunda, histon oktamerleri hala DNA'yı bağlayabilir, ancak OT pozisyonları tutulduğunda ilişkili gerilim sabit kaldığından, çoğunlukla sargısız kalabilir (Şekil 1F). Histon oktamerlerinin DNA'ya spesifik olmayan bağlanmasının Nap1 varlığında bile meydana gelmesi mümkündür. Başka bir deneyde, Cy3 etiketli H2A içeren nükleozomları oluşturmak için aynı protokol gerçekleştirildi ve bu, LD655 etiketli H4 ile yapılanlarla benzer sonuçlar verdi (Şekil 1G), bu da sağlam oktamerlerin nükleozomlara birleştirildiğini gösterir.
Adım 4'te (Şekil 2A) açıklanan kurulum kullanılarak, bağ mesafesi arttıkça nükleozomun açılması zamanla bir kimografi üzerinde görselleştirildi (Şekil 2B). Daha önce, histon oktamerleriningenellikle 30,31 açıldıktan sonra DNA'ya bağlı kaldığı ve bu nedenle floresan yörüngelerin genellikle yüksek gerilimlerde bile devam ettiği bildirilmişti. Nükleozomun açılması, ilişkili FD eğrisi üzerinde de izlendi (Şekil 2C). FD eğrisinin ölçülebilir özellikleri, nükleozom(lar)ın açıldığı kuvveti (Şekil 2C ekindeki "Geçiş F"ye bakınız) ve ayrıca histon oktamerinden salınan DNA'nın uzunluğunu içerir (Şekil 2C ekindeki "ΔL"ye bakın), ~24 nm'nin katları halinde bulunur, tek tek nükleozomların27 DNA'sının iç dönüşlerinin bağımsız olarak açılmasıyla tutarlı olarak, 30. Bu parametreler, her bir bağda oluşan nükleozomların sayısını tahmin etmek veya nükleozom mekaniğinin ek aşağı akış analizi için kullanılabilir. Bu nedenle, mekanik çekme deneylerinden elde edilen iç dönüş kopmalarının sayısı, monomer yoğunluğuna dayalı olarak her bir nükleozom yörüngesindeki tahmini etiketli H4 kopya sayısı ile karşılaştırıldı, bu da sayıların büyük ölçüde tutarlı olduğunu gösterdi (Şekil 2D-G'de gösterilen örnekler). Bununla birlikte, Şekil 1F'de gösterildiği gibi, numunedeki H4 proteininin ~p etiketli verimliliği ve DNA'ya herhangi bir kalıntı Nap1'den bağımsız histon bağlanması nedeniyle mükemmel bir şekilde eşleşmedikleri kaydedildi. Son olarak, beklendiği gibi, Nap1'e bağlı çıplak DNA bağlarının gerilmesi (histonlar olmadan) kuvvet kaynaklı geçişler oluşturmaz (Şekil 2H), bu da Nap1'in tek başına DNA'yı önemli ölçüde bozmadığını gösterir.
Adım 5'te (Şekil 3A) açıklanan kurulum kullanılarak, bağlayıcı histon H1'in kromatine bağlanması, kromatin bağı boyunca yeşil floresan odakların görünümü olarak görselleştirildi (Şekil 3B). Özellikle, H1'e bağlı nükleozomlar, zamanla durağan görünen çift renkli yörüngeler ( Şekil 3B'deki beyaz oklara bakın) üretti. Ek olarak, nükleozomsuz DNA bölgeleri boyunca yayılan H1 yörüngeleri gözlenmiştir ( Şekil 3B'deki yeşil yıldızlara bakınız).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> Şekil 1: Nap1 aracılı in situ nükleozom oluşumu. (A) Nap1 aracılı in situ nükleozom oluşum protokolünde açıklanan deney düzeneğinin şeması (adım 3). Bir çift boncuk optik olarak bölüm 1'de yakalandı ve tek bir λ DNA molekülü, bölüm 2'de biyotin-streptavidin bağlantısı yoluyla boncuklar arasına bağlandı. Tether daha sonra DNA boyunca gerçek zamanlı nükleozom oluşumu için LD655 etiketli histon oktamerleri (kırmızı) ve Nap1 içeren bölüm 4'e taşındı. (B) LD655-H4 etiketli nükleozom içeren bir DNA bağının temsili 2D taraması (solda) ve kimografisi (sağda). İlgili kuvvet okuması (altta), OT konumları sabit tutulduğunda bağ bölüm 4'e hareket ettirildiğinde hemen kuvvette bir artış gösterir ve bu da nükleozom sarılmasını gösterir. Daha parlak yörüngeler, ~ 300 nm'lik kırınım sınırı içinde bulunan birden fazla bitişik nükleozomu ifade eder. (C) LD655-H4 içeren bir nükleozomun 1 aşamalı foto-ağartma olayını (beyaz ok) gösteren örnek kimografi. (D) LD655-H4 içeren bir nükleozomun 2 aşamalı foto ağartma olayını (beyaz oklar) gösteren örnek kimografi. (E) Floresan yoğunluklarından tahmin edilen yörünge başına LD655 etiketli H4 sayısının nispi frekansı. (F) Nap1'in yokluğunda histon oktamerleri ile bağlanmış bir ipin temsili kimografisi. İlişkili kuvvet okuması (altta), histon oktamerleri DNA'yı bağlarken bile değişmeden kalır. (G) Cy3-H2A etiketli nükleozom içeren bir DNA bağının temsili kimografisi. İlişkili kuvvet okuması (altta), OT konumları sabit tutulduğunda nükleozomlar oluştuğundan, bağ 4. bölüme (oktamerler ve Nap1 içeren) hareket ettirildiğinde hemen kuvvette bir artış gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> Şekil 2: Nükleozom açma deneyi. (A) Nükleozomların açılması protokolünde açıklanan deney düzeneğinin şeması (adım 4). Nükleozomları içeren DNA bağı, boncuklar arası mesafenin arttırıldığı ve nükleozomların açıldığı proteinsiz bir görüntü tamponu içeren bölüm 3'e taşındı. (B) Boncuklar arası mesafeyi kademeli olarak artırarak yüksek kuvvetlere çekilen nükleozom içeren bir DNA bağının temsili kimografisi. Alt boncuğa doğru floresan yoğunluğundaki azalma, muhtemelen DNA'nın çizgi tarama odağının biraz dışına eğilmesinden kaynaklanıyordu. (C) 8-37 pN arasında meydana gelen kuvvet kaynaklı iç dönüş açma geçişlerini gösteren ilişkili FD eğrisi. İç kısım, sarılmamış mesafenin (tek tek nükleozomların DNA'sının iç dönüşü için ΔL = ~ 24 nm) ve geçiş kuvvetinin (Geçiş F) kaydedilebildiği ve daha fazla analiz edilebildiği örnek bir geçişin yakınlaştırma görünümünü gösterir. Bu bağ için, 26 nükleozom açıldı ve ip, kimografideki beyaz noktalı çizgi ile gösterildiği gibi ~ 65 pN'de yırtıldı. (D,E) Örnek LD655-H4 nükleozom içeren bağ, yörünge başına H4 sayısının floresan yoğunluğu ( kimograf, D'de belirtilmiştir) yoluyla tahmin edildiği ve sarılmış nükleozomların sayısının kuvvet kaynaklı mesafe değişiminin boyutu yoluyla tahmin edildiği yüksek kuvvetlere çekilir (ilgili kuvvet-mesafe eğrisi, E'de belirtilmiştir). (F,G) (D,E)'deki gibi başka bir örnek. (H) DNA bağları (n = 5) sadece Nap1 içeren bir kanalda inkübe edildikten sonra yüksek kuvvetlere çekilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> Şekil 3: Protein-kromatin etkileşiminin görselleştirilmesi. (A) Proteinlerin kromatin protokolüne bağlanmasının görselleştirilmesinde açıklanan deney düzeneğinin şeması (adım 5). Nükleozomları içeren DNA bağı, 10 nM Cy3 etiketli histon H1 (yeşil) içeren bölüm 5'e taşındı. (B) Nükleozom içeren bir DNA bağına bağlanan H1'in temsili iki renkli kimografisi. H1-nükleozom kolokalizasyon olayları beyaz oklarla gösterilir. Bağlanmamış nükleozom yörüngesi macenta ok ile gösterilir. Çıplak DNA üzerinde yayılan H1 molekülleri yeşil yıldızlarla gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

in-situ-nucleosome-assembly-for-single-molecule-correlative-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Bu videoda, birleştirilmiş nükleozomları görselleştirmek için statik atomik kuvvet mikroskobunu gösteriyoruz. Bu yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği, nükleozom yapısının incelenmesine izin verir.

Birleştirilmiş nükleozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için statik atomik kuvvet mikroskobu

Bu videoda, nükleozom komplekslerinin dinamiklerini incelemek için yüksek hızlı hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu, AFM, görüntüleme tekniklerini gösteriyoruz. AFM ucu nükleozomun yüzeyini tararken, nükleozom yüksekliğindeki değişiklikleri tespit eder ve zaman içinde DNA'nın açılmasını kaydeder.

Nükleozom dinamiklerini yakalamak için yüksek hızlı hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu

Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Burada, slayta monte kromozomlar üzerinde tekrarlayan heterokromatik dizileri görselleştirmek için floresan DNA in situ hibridizasyon (DNA ISH) gerçekleştirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Yöntem minimal reaktifler gerektirir ve kısa veya uzun problarla, farklı dokularla kullanım ve floresan veya floresan bazlı olmayan sinyallerle algılama için çok yönlüdür.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Mevcut protokol, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin, bilinen hacmin, genom boyutunun ve hücre döngüsü aşamasının Voronoi mozaiklemesini kullanarak yapışık hücre çekirdekleri içindeki mutlak DNA yoğunluklarını ölçen bir yöntemi açıklamaktadır.

Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Hücre Çekirdeğinde Mutlak DNA Yoğunluğunun Haritalanması

Bu protokol, DNA içsel floresan spektrumlarının örnek hazırlanması, veri toplama ve analizi üzerine ayrıntılı işlemler sağlar.

İçsel Kontrast kullanarak DNA moleküllerinin spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemesi

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

Öğrenin, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği protokolünü. Bu yöntem, yerel DNA dizileri üzerinde hızlı nükleozom montajı sağlar ve reaktif kullanımını azaltır.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Daha fazla video keşfet