Name: Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: Keşfedin, fare retinasındaki fotoreseptör terminallerinin nanometre ölçekli 3D yapılarını FIB-SEM ile incelemek için optimize edilmiş hacim elektron mikroskobu örnek hazırlama protokolünü. Bu yöntem, sinaptik etkinlik araştırmalarında yüksek çözünürlü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Retinal Sinaptik Yapıların Hacim Elektron Mikroskobu ile 3 Boyutlu Olarak Görüntülenmesi

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Aseton Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimi</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kalıbı</td><td>Pekin Zhongjingkeyi Teknolojisi</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon reçine</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i çift ışınlı SEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-aspartik asit</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun nitrat</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Fosfat tamponunun bir bileşeni</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Fosfat tamponunun bir bileşeni</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrosiyanür</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum kakodilat</td><td>Sigma</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>Püskürtme kaplayıcı</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Tiyokarbohidrazid</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Şekil 1A'da geleneksel kimyasal çift fiksasyon yöntemi kullanılarak hazırlanan retinal fotoreseptör terminallerinin görüntüsü, Şekil 1B'de ise OTO yöntemi kullanılarak hazırlanan retinal fotoreseptör terminallerinin görüntüsü gösterilmektedir. Her ikisi de FIB-SEM ile örneklenmiştir. OTO yöntemi kullanılarak hücre zarı yapısının mümkün olduğunca korunabildiği ve hatta veziküllerin ana hatlarının bile net bir şekilde görülebildiği açıkça görülebilir. Ayrıca OTO yöntemi kullanılarak elde edilen görüntülerin kontrastı da daha nettir.
Şekil 2 , fotoreseptör terminallerinin ultrastrüktürel özelliklerini yeniden yapılandırmak için kullanılan deneysel iş akışını göstermektedir. Rekonstrüksiyon, M-koni pedikülleri, S-koni pedikülleri, rod1 sferülleri ve rod2 sferülleri dahil olmak üzere dört tip fotoreseptör terminaline odaklandı. Ana vurgu, fotoreseptör terminalleri içindeki mitokondri, sinaptik şeritler ve sinaptik vezikül havuzları gibi temel bileşenler üzerindeydi.
Şekil 3 , çubuk fotoreseptör terminallerinde yeniden yapılandırılmış mitokondri ve sinaptik şeritleri göstermektedir. Özellikle, rod2 küreciklerinin sinaptik şeritleri, tipik olarak küre başına tek bir şerit içeren belirgin bir at nalı şekli sergiler. Ayrıca, Şekil 2 , sinaptik şeritlerin üzerinde bulunan terminallerin merkezi alanı içinde tutarlı bir konuma sahip, çubuk küreciklerde iki mitokondrinin varlığını vurgulamaktadır. Tüm yapılar manuel olarak sayfa sayfa izlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg"> Şekil 1: Geleneksel kimyasal çift fiksasyon yöntemi ve OTO yöntemi için FIB-SEM kullanılarak örneklenen görüntü örnekleri. (A) Geleneksel kimyasal çift fiksasyon yöntemi. (B) OTO yöntemi. Ölçek çubuğu: 1000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg"> Şekil 2: FIB-SEM kullanan fotoreseptör terminalleri için 3D rekonstrüksiyon iş akışı. 3D veri görselleştirme yazılımı kullanılarak hizalamanın ardından, seri görüntüler manuel olarak bölümlere ayrıldı ve daha fazla analiz için işlendi. (A) Orijinal seri görüntüleri. (B) Hizalanmış görüntüler. (C) Bölümlere ayrılmış görüntüler. (D) Yeniden yapılandırılmış görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg"> Şekil 3: 3D rekonstrüksiyon. Temsili 3D rekonstrüksiyon görüntüleri, fotoreseptör terminallerini beyaz renkte, mitokondriyi turuncu renkte ve sinaptik şeritleri mavi renkte gösterir. Ölçek çubuğu: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

preparation-of-retinal-samples-for-volume-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Keşfedin, fare retinasındaki fotoreseptör terminallerinin nanometre ölçekli 3D yapılarını FIB-SEM ile incelemek için optimize edilmiş hacim elektron mikroskobu örnek hazırlama protokolünü. Bu yöntem, sinaptik etkinlik araştırmalarında yüksek çözünürlü görüntüleme sağlar.

Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Daha fazla video keşfet