Name: İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Keşfedin, interstisyel akışın glioblastoma invazyonuna etkisini 3D hiyaluronik asit-kollajen hidrojel modeli ve MRI görüntüleme kullanarak nasıl araştırıldığını. Bu yöntem, tümör mikroçevresinin davranışlarını anlamak için güçlü bir in vitro sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokol, Virginia Tech Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak geliştirilmiştir.
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürleri bir BSL-2 hücre kültürü kabininde gerçekleştirin. İnsan hücrelerinin kullanımı konusunda rehberlik için lütfen kurumun biyogüvenlik komitesine danışın.
1. Jel hazırlama için hesaplamalar
<ol><li>Deneme için gereken koşul sayısını hesaplayın. NOT: Bir "durum", bu örnekte kullanılan sıvı basınç kafası gibi harici olarak uygulanan değişkenlerle değil, çözeltinin içeriğiyle (örneğin, hücre konsantrasyonları, kollajen konsantrasyonları, vb.) tanımlanır.</li>
	<li>Her bir koşul çözümü için gereken toplam jel hacmini hesaplayın. NOT: 12 mm çapında doku kültürü ekleri kullanan 12 oyuklu jeller için gereken hacim, uç başına 100-150 μL'dir. İstilayı ölçerken en az üç teknik kopya önerilir. Ek olarak, pipetleme hatasından kaynaklanan hacim kaybını hesaba katmak için her koşul çözümüne ek bir çoğaltma hacmi ekleyin.</li>
	<li>Adım 1.2'den itibaren deney için gereken toplam jel çözeltisi hacmini hesaplayın.</li>
	<li>Deney için gerekli olan 3 mg / mL kollajen çözeltisinin toplam hacmini hesaplayın. Pipetleme sırasında hacim kaybını hesaba katmak için bu hacme en az ekleyin. Toplam hacim 3 mg / mL kollajen = 0.4 × Toplam jel çözeltisi hacmi</li>
	<li>Verilen son konsantrasyonlarda (cf) 3 mg / mL kollajen çözeltisindeki her bileşen için yüksek konsantrasyonlu sıçan kuyruğu kollajen I, steril 1 N NaOH, steril 10x PBS ve steril su hacimlerini hesaplayın: kollajen Ic f = 3 mg / mL, NaOH cf = kollajen I hacminin% 2.3 v / v'si ve PBS cf = 1x. Çözeltileri steril ultra saf (18.2 MΩ · cm) su ile seyreltin.</li>
	<li>3 mg / mL kollajen çözeltisi,% 1 w / v metakrillenmiş hyaluronik asit ve foto başlatıcı, 17 mg / mL lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) ve hücre kültürü ortamının hacimlerini hesaplayın verilen son konsantrasyonlarda (cf): kollajen cf = 1.2 mg / mL, hyaluronik asit cf =% 0.4 w / v, LAP cf = hyaluronik asit hacminin %2 v/v'si. Çözeltileri, hücreleri içeren hücre kültürü ortamında seyreltin.</li>
	<li>İstenen oranda her koşul çözeltisi için hücre sayısını hesaplayın (örneğin, 4:1:1 GSC'ler:astrositler:mikroglia oranında 100 uL hidrojel başına 100.000 GSC).</li>
</ol>2. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Deneyden önceki hafta, plaka GSC'leri, astrositler ve mikroglia. NOT: Plaka, işlem sırasında hem pasajı hem de hücre kaybını hesaba katmak için jeller için gerekenden yaklaşık iki kat daha fazla hücre sayısı verir.</li>
	<li>Steril 1x PBS'de 17 mg / mL'de foto başlatıcı LAP'ın çalışma solüsyonunu hazırlayın. Işıktan koruyun.</li>
	<li>Metakrillenmiş hyaluronik asidi, üreticinin talimatlarına göre 1x PBS'de sulandırın. Kapağı kapatın ve süspansiyonu 1 saat veya çözünene kadar 4 °C'de hafifçe sallayın. NOT: Bu protokolde kullanılan metakrillenmiş hyaluronik asit, üretici tarafından belirtildiği gibi 4 °C'de yaklaşık 1 ay stabildir. Işıktan koruyun.</li>
	<li>Jelin yüzeyinde 50 mW/cm2 yoğunlukta 385 nm nominal dalga boyuna sahip kolimasyonlu bir ışık yayan diyot (LED) kullanarak bir UV lambası kurun. Lambayı hücre kültürü kabinine yerleştirin. DİKKAT: UV ışığı gözlere zarar verebilir. Koruyucu gözlük takın ve doğrudan lambaya bakmayın. NOT: Canlılığın veya ölçülen işlevsel sonucun, maruz kalma süresi (45 s) boyunca 50 mW/cm2'de 385 nm ışığa maruz kalmaktan önemli ölçüde etkilenmediğinden emin olmak için ayrı deneyler yapın.</li>
	<li>Deney için besiyeri (astrobazal besiyeri +% 0.5 v/v N-2 +% 1 v/v B-27 A vitamini olmadan) hazırlayın. NOT: Steriliteyi sağlamak için ortam bileşenlerini birleştirin ve 0.22 μm gözenekli vakum sisteminden filtreleyin. Bozulmayı önlemek için büyüme faktörlerinin (N-2 ve B-27) donma-çözülme döngülerinden kaçının.</li>
	<li>Sıçrama koruması yerindeyken bir çeker ocakta 1 N NaOH hazırlayın. DİKKAT: 1 N NaOH oldukça aşındırıcıdır. Dikkatli tutun, göz koruması kullanın veya bir sıçrama koruması kullanın ve solüsyonu bir davlumbaz altında tutun.</li>
	<li>Steril ultra saf (18.2 MΩ ·cm) su hazırlayın.</li>
</ol>3. Hücrelerin geçirilmesi ve GSC'lerin etiketlenmesi
<ol><li>Astrositleri, mikrogliaları ve GSC'leri üreticinin talimatlarına göre geçirin.</li>
	<li>Üreticinin tavsiyesine göre GSC'leri Hoechst 33342 ile etiketleyin. DİKKAT: Hoescht 33342 ciddi göz tahrişine neden olabilir ve DNA hasarına neden olabilir. Dikkatli tutun.</li>
	<li>Tüm hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı yavaşça boşaltın ve fazla ortamı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>GSC'leri 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>GSC'leri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Deney için ortamdaki tüm hücreleri (astrobazal ortam +% 0.5 N-2 v / v +% 1 v / v B-27) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Tüm hücreleri sayın.</li>
	<li>Her koşul çözeltisi için gereken mutlak hücre sayısını, koşul çözeltisi başına bir şişeye ekleyin. Bunları kullanana kadar 37 °C, %5CO2'ye yerleştirin.</li>
</ol>4. Hidrojellerin hazırlanması
NOT: Metakrillenmiş hyaluronik asidi ve foto başlatıcıyı karanlıkta açtıktan sonra, jeller foto-çapraz bağlanana kadar adımları gerçekleştirin.
<ol><li>8-11 mg / mL (yüksek konsantrasyonlu) kollajen, 1 N NaOH, steril ultra saf (18.2 MΩ ·cm) su, steril 10x PBS, bir mikrosantrifüj tüpü (3 mg / mL kollajen çözeltisi için), metakrillenmiş hyaluronik asit ve foto başlatıcıyı buz üzerine yerleştirin. NOT: Erken çapraz bağlanmayı önlemek için kollajen solüsyonu ile temas eden tüm malzemeler buz üzerinde tutulmalıdır.</li>
	<li>Doku kültürü eklerini plakaya yerleştirin ve plakayı etiketleyin.</li>
	<li>Hesaplanan değerleri kullanarak, yüksek konsantrasyonlu kolajen, 1 N NaOH, ultra saf (18.2 MΩ · cm) su ve 10x PBS'yi birleştirerek 3 mg / mL kolajen çözeltisini hazırlayın. Bileşenleri damla damla ekleyin ve kabarcık oluşumunu önlemek için karıştırırken pipet ucunu suya batırın. NOT: Kabarcıklar oluşursa, santrifüjleme veya tüpü sert bir yüzeye vurma genellikle kabarcıkları giderir. Ayrıca, fenol kırmızısı içeren ortamlar, pH çok asidik ise sarı olacaktır; bu durumda daha fazla NaOH eklenmelidir.</li>
	<li>RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da hücreleri santrifüjleyin.</li>
	<li>Her bir hücre durumu çözeltisinin üstünden fazla ortamı nazikçe çıkarın ve durum için gereken ortam hacmini bırakın. Bu çözeltileri buzun üzerine yerleştirin. NOT: Hücre kaybını önlemek için hücreleri bu şişeden dışarı aktarmayın. Bunun yerine, tüm jel durum bileşenlerini bu şişeye ekleyin, ardından yavaşça karıştırın ve jelleri plakaya dağıtın.</li>
	<li>Adım 4.5'ten itibaren her bir hücre durumu çözeltisine 1.2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon için hesaplanan 3 mg / mL kollajen çözeltisi hacmini ekleyin.</li>
	<li>Adım 4.5'ten itibaren her bir hücre durumu çözeltisine% 0.4 w / v'lik bir nihai konsantrasyon için% 1 w / v metakrillenmiş hyaluronik asit hesaplanan hacmini ekleyin.</li>
	<li>Hesaplanan 17 mg / mL LAP hacmini, adım 4.5'ten itibaren her hücre koşulu çözeltisine ekleyin. NOT: Canlılığı en üst düzeye çıkarmak için jelleri plakaya dağıtmadan hemen önce bu çözeltiyi ekleyin; Sıvı formdaki LAP sitotoksiktir.</li>
	<li>Her seferinde bir tane, her bir durum tüpünü karıştırın ve her doku kültürü ekine 100-150 μL ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için pipet ucunu suya batırılmış halde tutun.</li>
	<li>385 nm UV lambasını (50 mW/cm2'ye ayarlanmış) sabit bir akımda açın.</li>
	<li>Her bir oyuğu 45 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakarak her bir jeli teker teker foto-çapraz bağlayın.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de 30-45 dakika boyunca yerleştirerek kolajeni çapraz bağlayın.</li>
	<li>Sıvı basınç başlığını astrobazal +% 0.5 N-2 v / v +% 1 v / v B-27 kullanarak jellere uygulayın.<ol><li>Net sıfır akış (statik): Kuyucuk plakasına 700 μL ve doku kültürü ekine 100 μL ortam ekleyin.</li>
		<li>Net akış: Kuyucuk plakasına 100 μL ve doku kültürü ekine 700 μL ortam ekleyin. NOT: Doku kültürü ekinin altına 100 μL eklemek için kılcal hareket kullanın; Bu hacim kuyu plakasını doldurmayacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakayı en az 18 saat veya 5 güne kadar 37 °C, %5CO2'de yerleştirin. NOT: Sistemler, testin ihtiyaçlarına bağlı olarak 5 güne kadar inkübe edebilir, ancak ilk istila, canlılık veya çoğalma deneyleri için 18-24 saatlik bir zaman noktası yeterlidir.</li>
</ol>5. İstila analizi için hücrelerin sabitlenmesi
NOT: Doku kültürü ekleme zarının kurumasına izin vermeyin ve hücrelerin zardan ayrılmasını önlemek için çözeltileri doğrudan zara uygulamayın.
<ol><li>Doku kültürü eklerinden ve kuyu plakasından aspire ortamı.</li>
	<li>Jelleri doku kültürü eklerinden bir P1000 ucu ile emdirin. NOT: Jeller, bu adım sırasında jelleri kuyuda bırakarak ve adım 5.4'teki notta yer alan alternatif fiksasyon protokolünü izleyerek görüntüleme için saklanabilir.</li>
	<li>Kuyu plakasını 1x PBS ile nazikçe yıkayın, böylece her bir doku kültürü ekleme zarı kaplanır.</li>
	<li>Kuyu plakasına PBS'de% 4 v / v formalin ekleyin, böylece her bir doku kültürü ekleme zarı kaplanır ve RT'de 15-20 dakika inkübe edilir. DİKKAT: Formalin şüpheli bir kanserojendir ve ciddi göz hasarına neden olabilir. Formalini, sıçrama koruması yerindeyken bir çeker ocakta kullanın. NOT: Bu inkübasyon uzunluğu, hücreleri yalnızca doku kültürü ekleme zarı üzerindeki hücrelere sabitleyecektir. Jeller görüntüleme için tutulursa, jelleri 4 ° C'de 1 saat boyunca hafifçe sallayarak sabitleyin ve jele nüfuz edecek kadar doku kültürü ekine yeterli formalin ekleyin. Sabitledikten sonra, jelleri PBS ile en az 20 dakika boyunca iyice yıkayın.</li>
	<li>Her kuyuyu 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra, her bir kuyu plakası kuyucuğuna ve doku kültürü ekine ek bir 1x PBS ekleyin.</li>
	<li>Her bir doku kültürü ekleme zarının üst tarafını silerek jel parçalarını çıkarmak için bir pamuklu çubuk kullanın. Membranların kurumasını önlemek için sildikten sonra kaybolan 1x PBS'yi her bir kuyucuğa geri koyun.</li>
	<li>Her bir kuyuyu yıkayın ve doku kültürü ekini 1x PBS'de yıkayın. NOT: Gerekirse plaka kapatılabilir ve 4 °C'ye yerleştirilebilir, ancak floresan kaybını önlemek için görüntü membranları mümkün olan en kısa sürede yerleştirilebilir.</li>
</ol>6. Görüntüleme ve niceleme
<ol><li>DAPI kanalında, her bir zarı görüntüleyin. Mümkünse, tüm kuyunun döşenmiş bir floresan görüntüsünü alın. Bu mümkün değilse, 20x'te kuyunun merkezini ve dört bölgeyi merkez noktasını kesen bir çapraz oluşumda görüntüleyin. NOT: Jel parçalarını önlemek ve ilgilenilen bölgelerin (ROI'ler) üst üste binmemesini sağlamak için kuyunun kenarlarını hariç tutun.</li>
	<li>Her görüntüdeki hücre sayısını sayın.</li>
	<li>Her kuyu için istila eden tohumlanmış GSC'lerin yüzdesini hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66604/66604eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Teknik kopyalar arasında istila yüzdesinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın.</li>
</ol>7. Alternatif son nokta: akış sitometrisi
NOT: İnvazyon analizine ek olarak veya bunun yerine, sabitlenmemiş jeller bozunabilir ve hücreler akış sitometrisi veya diğer uç nokta analizleri için hasat edilebilir. Hücre canlılığını (sabitlenebilir canlı/ölü leke), proliferasyonu (Ki67 antikoru) ve saplılığı (CD71 antikoru) analiz eden örnek bir protokol sağlanmıştır. Boyama etkinliği doğrulandıktan sonra bu protokolde diğer ilgili belirteçler ikame edilebilir. Özellikle, GSC'leri hedef alan çok çeşitli belirteçler mevcuttur (25'te gözden geçirilmiştir). Bu protokol adım 4.14'ten sonra başlar.
<ol><li>Hidrojelleri bozun. NOT: Önce deneysel ortamla (astrobazal +% 0.5 v / v N-2 +% 1 v / v B-27 A vitamini olmadan) 2x konsantrasyonda kollajenaz ve dispas çözeltileri hazırlanır, daha sonra eşit hacimde bir hidrojel içine eklenir ve 1x'lik bir nihai konsantrasyona ulaşır. Farklı hücrelerin enzimatik bozunmaya farklı tepkileri olduğundan, hücre canlılığının ve veriminin kontrol edilmesi (Şekil 2) şiddetle tavsiye edilir. Nihai kollajenaz konsantrasyonunun aralığı 0.2-0.4 mg / mL olmalıdır ve son dispas konsantrasyonu aralığı 0.01-0.04 mg / mL olmalıdır; bu örnekte, hidrojelleri parçalamak için 0.3 mg / mL kollajenaz ve 0.02 mg / mL dispas kullanılır.<ol><li>2x kollajenaz ve dispase solüsyonları hazırlayın (jel bozunma ortamı solüsyonu). Stok kollajenazı 0.6 mg / mL'ye seyreltin ve deneysel ortamla 0.04 mg / mL'ye stok dispasesini yapın (astrobazal +% 0.5 N-2 v / v +% 1 v / v B-27 A vitamini olmadan).</li>
		<li>Jelleri doku kültürü eklerinden çıkarın ve bunları V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.</li>
		<li>Her bir oyuğa hidrojel başına eşdeğer hacimde jel bozunma ortamı çözeltisi ekleyin. Örneğin, 100 μL hidrojele 100 μL jel bozunma ortamı çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 300-500 RPM'de (yörünge: 2 mm) 37 °C'de 15-30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. NOT: Hücreler enzimatik bozulmaya duyarlıysa, minimum aralık olan 15 dakikalık inkübasyonu deneyin.</li>
		<li>Hidrojelleri parçalamak için her bir hidrojeli 30-50 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. NOT: Hidrojeller tamamen bozulduktan sonra pipetlenmesi kolay olacaktır. Jeller kolayca pipetlenemiyorsa, jeller 37 °C'de 300-500 RPM'de (yörünge: 2 mm) bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika daha inkübe edilmelidir. Ardından, jelleri parçalamak için her bir hidrojeli 30-50 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.Önemli olarak, hidrojellerin parçalanması için inkübasyon süresi 1 saati geçmemelidir; Bu, düşük hücre canlılığına yol açabilir.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. NOT: Süpernatant, pipetleme yoluyla veya plakayı bir atık tepsisi üzerinde hızlı bir şekilde ters çevirerek çıkarılabilir.</li>
		<li>Hücreleri 50 μL 1x PBS ile yeniden süspanse edin ve tek bir biyolojik kopya elde etmek için üç teknik kopyayı tek bir kuyuda toplayın.</li>
		<li>Plakayı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 625 x g'da santrifüjleyin ve akış sitometrisine devam etmek için süpernatanı atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Spesifik olmayan bağlamayı engelle.<ol><li>Hücreleri 200 μL 1x PBS / kuyu ile yıkayın, plakayı 625 x g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Aksi belirtilmedikçe aşağıdaki adımların tümünü buz üzerinde gerçekleştirin.</li>
		<li>Hücreleri 200 μL bloke edici solüsyon (% 10 v / v FBS ile 1x PBS) ile yeniden süspanse edin ve plakayı RT'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri 200 μL 1x PBS / kuyu ile yıkayın, plakayı 625 x g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri canlı/ölü bir leke ile etiketleyin.<ol><li>Sabitlenebilir bir canlı/ölü yakın kızılötesi leke kullanarak hücre canlılığını test edin. Canlı / ölü lekeyi 1x PBS ile 1:1000'e kadar seyreltin.</li>
		<li>Negatif kontrol için hücreleri 200 μL% 70 etanol ile bir kuyuda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Kalan kuyucuklardaki hücreleri 200 μL 1x PBS ile yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Plakayı buz üzerinde 5-10 dakika inkübe edin, plakayı 625 x g'da 1 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>İlgili oyuklara 50 μL canlı / ölü çözelti ekleyin ve plakayı 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücreleri kuyucuk başına 200 μL akış tamponu (%2 w/v BSA ile HBSS) ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	</ol></li>
	<li>İlgilenilen hücresel belirteçler (CD71 antikoru) için yüzey immün boyama yapın.<ol><li>CD71 antikorunu akış tamponu ile (% 2 w / v BSA ile HBSS) 1: 50'de seyreltin.</li>
		<li>İlgili oyuklara 50 μL antikor çözeltisi ekleyin ve plakayı 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücreleri kuyucuk başına 200 μL akış tamponu (%2 w/v BSA ile HBSS) ile bir kez yıkayın.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	</ol></li>
	<li>İlgilenilen hücresel belirteçler (Ki67 antikoru) için hücre içi immün boyama yapın.<ol><li>Hücreleri sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için Foxp3 transkripsiyon faktörü boyama tamponu setini kullanın. Her kuyucuğa 100 μL Foxp3 fiksasyon / geçirgenleştirme çalışma solüsyonu ekleyin. Hücre peletlerini yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Plakayı karanlıkta 30-60 dakika buz üzerinde veya RT'de inkübe edin.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücreleri kuyucuk başına 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>RT'de 15 dakika boyunca 100 μL engelleme çözeltisi (% 2 v / v FBS ile 1x PBS) ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Ki67 antikorunu bloke edici solüsyonla (% 2 v / v FBS ile 1x PBS) 1: 25'te seyreltin.</li>
		<li>İlgili kuyucuklara 50 μL 1:25 Ki67 antikor çözeltisi ekleyin ve plakayı karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Plakayı 625 ° C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücreleri kuyucuk başına 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri 200 μL akış tamponu ile yeniden süspanse edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Numuneleri bir akış sitometresi kullanarak işleyin. Örnek bir geçit stratejisi Cornelison ve ark. 202212'de detaylandırılmıştır.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Hyaluronan-Kollajen I Hidrojel Sistemi ile Glioblastoma İnvazyonunun Çoğaltılması

<ol><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+statistical+report%3A+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2016-2020%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020.</a> Neuro Oncol. 25, 12 Suppl 2 1-99 (2023).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tumor-treating+fields+plus+maintenance+temozolomide+vs+maintenance+temozolomide+alone+on+survival+in+patients+with+glioblastoma%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: A randomized clinical trial.</a> JAMA. 318 (23), 2306-2316 (2017).</li>
<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Roos, A., Ding, Z., Loftus, J. C., Tran, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+microenvironmental+determinants+of+glioma+stem-like+cell+survival+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular and microenvironmental determinants of glioma stem-like cell survival and invasion.</a> Front Oncol. 7, 120(2017).</li>
<li>Yabo, Y. A., Niclou, S. P., Golebiewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+heterogeneity+and+plasticity%3A+A+paradigm+shift+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer cell heterogeneity and plasticity: A paradigm shift in glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 24 (5), 669-682 (2022).</li>
<li>Geer, C. P., Grossman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+along+white+matter+tracts%3A+A+potentially+important+mechanism+for+the+dissemination+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow along white matter tracts: A potentially important mechanism for the dissemination of primary brain tumors.</a> J Neurooncol. 32 (3), 193-201 (1997).</li>
<li>Munson, J. M., Bellamkonda, R. V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+in+a+3D+microenvironment+increases+glioma+invasion+by+a+CXCR4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow in a 3D microenvironment increases glioma invasion by a CXCR4-dependent mechanism.</a> Cancer Res. 73 (5), 1536-1546 (2013).</li>
<li>Kingsmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+differentially+increases+patient-derived+glioblastoma+stem+cell+invasion+via+CXCR4%2C+CXCL12%2C+and+CD44-mediated+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow differentially increases patient-derived glioblastoma stem cell invasion via CXCR4, CXCL12, and CD44-mediated mechanisms.</a> Integr Biol. 8 (12), 1246-1260 (2016).</li>
<li>Qazi, H., Shi, Z. -D., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+regulates+the+invasive+potential+of+glioma+cells+via+modulation+of+migratory+activity+and+matrix+metalloproteinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress regulates the invasive potential of glioma cells via modulation of migratory activity and matrix metalloproteinase expression.</a> PLoS One. 6 (5), e20348(2011).</li>
<li>Parmigiani, E., Scalera, M., Mori, E., Tantillo, E., Vannini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+stars+and+new+players+in+the+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Old stars and new players in the brain tumor microenvironment.</a> Front Cell Neurosci. 15, 709917(2021).</li>
<li>Cornelison, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patient-designed+tissue-engineered+model+of+the+infiltrative+glioblastoma+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">A patient-designed tissue-engineered model of the infiltrative glioblastoma microenvironment.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 54(2022).</li>
<li>Tchafa, A. M., Shah, A. D., Wang, S., Duong, M. T., Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+model+for+measuring+the+effects+of+interstitial+fluid+flow+on+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture model for measuring the effects of interstitial fluid flow on tumor cell invasion.</a> J Vis Exp. (65), e4159(2012).</li>
<li>Shields, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11 (6), 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C., Rozansky, H. A., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71 (3), 790-800 (2011).</li>
<li>Miteva, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ Res. 106 (5), 920-931 (2010).</li>
<li>Kingsmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+analysis+to+map+interstitial+flow+in+the+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">MRI analysis to map interstitial flow in the brain tumor microenvironment.</a> APL Bioeng. 2 (3), 031905(2018).</li>
<li>Roberts, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+migrate+in+response+to+flow+and+lymphatic+endothelial+cell+interaction+in+the+breast+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells migrate in response to flow and lymphatic endothelial cell interaction in the breast tumor microenvironment.</a> Cancers. 14 (12), 3008(2022).</li>
<li>Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microregional+extracellular+matrix+heterogeneity+in+brain+modulates+glioma+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (6), 1046-1069 (2004).</li>
<li>Choi, J. R., Yong, K. W., Choi, J. Y., Cowie, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+photo-crosslinkable+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Recent advances in photo-crosslinkable hydrogels for biomedical applications.</a> Biotechniques. 66 (1), 40-53 (2019).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 10, Unit 10.18 11-20 (2010).</li>
<li>Gelman, R. A., Williams, B. R., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibril+formation.+Evidence+for+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen fibril formation. Evidence for a multistep process.</a> J Biol Chem. 254 (1), 180-186 (1979).</li>
<li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibril+formation.+Optimal+in+vitro+conditions+and+preliminary+kinetic+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).</li>
<li>Mineo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+non-coding+RNA+HIF1A-AS2+facilitates+the+maintenance+of+mesenchymal+glioblastoma+stem-like+cells+in+hypoxic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The long non-coding RNA HIF1A-AS2 facilitates the maintenance of mesenchymal glioblastoma stem-like cells in hypoxic niches.</a> Cell Rep. 15 (11), 2500-2509 (2016).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioblastoma+stem+cells%3A+A+review+on+biomarkers%2C+signal+pathways+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeting glioblastoma stem cells: A review on biomarkers, signal pathways and targeted therapy.</a> Front Oncol. 11, 701291(2021).</li>
<li>Dirkse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-associated+heterogeneity+in+glioblastoma+results+from+intrinsic+tumor+plasticity+shaped+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stem cell-associated heterogeneity in glioblastoma results from intrinsic tumor plasticity shaped by the microenvironment.</a> Nat Commun. 10 (1), 1787(2019).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+reactivity%3A+Subtypes%2C+states%2C+and+functions+in+CNS+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte reactivity: Subtypes, states, and functions in CNS innate immunity.</a> Trends Immunol. 41 (9), 758-770 (2020).</li>
<li>Tate, K. M., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+response+in+engineered+brain+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Assessing drug response in engineered brain microenvironments.</a> Brain Res Bull. 150, 21-34 (2019).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+microfluidic+devices+for+glioblastoma+study%3A+Current+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Application of microfluidic devices for glioblastoma study: Current status and future directions.</a> Biomed Microdevices. 22 (3), 60(2020).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Jadin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+expression+in+primary+and+secondary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors.</a> Ann Transl Med. 3 (6), 80(2015).</li>
<li>Cornelison, R. C., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+translating+biomaterials+into+glioma+therapy%3A+Lessons+from+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mater%22%5BJournal%5D)">Perspective on translating biomaterials into glioma therapy: Lessons from in vitro models.</a> Front Mater. 5, 27(2018).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signaling%3A+Tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: Tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+pre-clinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models%3A+A+systematic+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Transitioning pre-clinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomed Pharmacother. 145, 112396(2022).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Ortiz-Cárdenas, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+spatially-organized+organs-on-chip%3A+Photopatterning+cell-laden+thiol-ene+and+methacryloyl+hydrogels+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Organs+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards spatially-organized organs-on-chip: Photopatterning cell-laden thiol-ene and methacryloyl hydrogels in a microfluidic device.</a> Organs Chip. 4, 100018(2022).</li>
<li>Ozulumba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+reactive+oxygen+species+production+and+increasing+gel+porosity+improves+lymphocyte+motility+and+fibroblast+spreading+in+photocrosslinked+gelatin-thiol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Mitigating reactive oxygen species production and increasing gel porosity improves lymphocyte motility and fibroblast spreading in photocrosslinked gelatin-thiol hydrogels.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+photo-cross-linking+in+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of photo-cross-linking in bioprinting.</a> Chem Rev. 120 (19), 10662-10694 (2020).</li>
<li>Ghosh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+synthesis%2C+properties+and+applications+of+gelatin+methacryloyl+hydrogel+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Adv%22%5BJournal%5D)">An insight into synthesis, properties and applications of gelatin methacryloyl hydrogel for 3D bioprinting.</a> Mater Adv. 4 (22), 5496-5529 (2023).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+hijacks+neuronal+mechanisms+for+brain+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma hijacks neuronal mechanisms for brain invasion.</a> Cell. 185 (16), 2899-2917 (2022).</li>
</ol>

Glioblastoma, klinik olarak mevcut tedavilerle sadece orta derecede uzatılan kısa sağkalım1 ile işaretlenmiş yıkıcı bir hastalıktır 2,3. Etkili tedavinin önündeki bu engel, büyük ölçüde, rezeksiyon ve tohum tekrarlayan tümörler için erişilemeyen kemodirençli glioma kök hücrelerinin (GSC'ler) yüksek derecede infiltratif doğasından kaynaklanmaktadır4. Aynı zamanda, GSC'ler oldukça plastiktir ve hayatta kalmak veistila etmek için tümör mikro ortamındaki (TME) çeşitli uyaranlara yanıt verir 5,6. Spesifik olarak, yoğun nüfuslu tümör ve sızdıran damar sistemi, tümör sınırında dik bir basınç farkı üreterek, GSC invazyonu7 ile ilişkili farklı bölgelerde interstisyel sıvı akışını (IFF) arttırır. Bu artmış IFF, 8,9,10'u etkiler ve sıklıkla farmakolojik inhibisyona uygun moleküler yollar yoluyla 8,9 GSC invazyonunu arttırır. Bununla birlikte, bu süreç, TME'deki glia'nın glioma invazyonu üzerindeki etkisi ile karıştırılır; Gerçekten de, glia'nın çeşitli bağlamlarda glioma invazyonunu modüle ettiği tanımlanmıştır11 ve laboratuvarımızdaki ön kanıtlar, glia'nın IFF ile güçlendirilmiş glioma invazyonu12 üzerinde benzer bir etkisini göstermektedir. Bu nedenle, laboratuvarımız, GSC invazyonunu ve IFF, glia ve/veya aday terapötiklerden etkilenen diğer sonuçları (yani, yüzey veya hücre içi protein ekspresyonu, RNA ekspresyonu, vb.) ölçmek için hem IFF hem de glia-GSC etkileşimlerini birleştirerek bu invaziv tümör sınır bölgelerini kopyalayan ayarlanabilir, 3D bir TME modeli geliştirmiştir12 (Şekil 1).
TME modeli, yaygın olarak yayınlanmış olan diğer doku kültürü eki bazlı interstisyel sıvı akış testlerine (yani statik/akış testleri) benzer 8,9,10,13,14,15,16,17,18. Bu modelin temel farkları, tescilli olmayan ve ayarlanabilir bir kollajen-hyaluronik asit matrisinin dahil edilmesi, astrositlerin ve mikrogliaların hasta TME'leri12'yi temsil eden oranlarda matrise dahil edilmesi ve sistemin tamamen bir kuyu plakası içine alınmasıdır. Hyaluronik asit, beyin hücre dışı matrisinin(19) temel bileşenleri arasındadır, ancak sıvı akışına izin vermek için yeterli değildir; böylece kolajen I karışıma dahil edilir. Çapraz bağlama iki adımda gerçekleşir: ultraviyole (UV) ışığa maruz kaldığında, foto başlatıcıdan serbest radikallerin üretildiği ve metakrilatlanmış hyaluronik asit molekülleri 20 arasında kimyasal çapraz bağlar oluşturduğu serbest radikal tarafından başlatılan bir zincir büyüme polimerizasyonu ve asitle korunan kollajenin nötralizasyonu ve kollajen lifleri oluşturmak için ısıya maruz kalması21,22,23.
Bu test için optimize edilmiş çeşitli parametreler, tiyol ile modifiye edilmiş hyaluronan-kollajen hidrojellerde daha önce yayınlanmış çalışmalardaaçıklanmıştır 8,12. Spesifik olarak, bu test için kullanılan hücreler (birincil insan GSC'leri24, birincil insan kortikal astrositleri ve ölümsüzleştirilmiş insan mikrogliası), GSC büyüme faktörleri ile desteklenmiş astrobazal ortamdan oluşan jellerde 3 gün boyunca en az ` yaşayabilir, %0.5 v/v N-2 ve A vitamini olmadan %1 v/v B-2712. Jellerin parçalanması gereken durumlarda (örneğin, protein ekstraksiyonu veya akış sitometrisi için), kollajenaz ve dispas kullanılır ve yeterli canlılığı korur (Şekil 2).
İstilayı ölçmek için, GSC'ler matriste glia ile birleştirilmeden önce floresan olarak etiketlenmelidir. Bu, Hoechst 33342 (aşağıda açıklandığı gibi), hücre izleyicileri12, genetik modifikasyon veya transdüksiyon ile etiketleme yoluyla elde edilebilir. Ne olursa olsun, yeni işaretleyicilerle etiketlenmiş hücrelerin canlılığı, TME modeline dahil edilmeden önce ölçülmelidir. Alternatif olarak, istila ölçülmeyecekse, ancak jeller protein ekstraksiyonları, RNA ekstraksiyonları veya diğer sonuçlar için hasat edilecekse, hücrelerin jel hazırlama işlemi sırasında genellikle floresan olarak etiketlenmesine gerek yoktur. Bu durumda, jeller ya görüntüleme için formalinle sabitlenebilir, parçalanabilir ve RNA ekstraksiyonu için hücreler parçalanabilir ya da akış sitometrisi için proteazlar kullanılarak parçalanabilir ve daha sonra Western blotları veya diğer protein çalışmaları için protein lizis tamponları ile parçalanabilir.
Burada, insan astrositlerini, mikroglialarını ve hastadan türetilen GSC'leri, hasta tanımlı bir oranda, 4: 1: 112'de, statik akış koşulları altında 1.2 mg / mL kollajen I, 4 mg / mL hyaluronan matrisine dahil etmek için bir protokol sunuyoruz. Bir tahlil için kullanılan spesifik parametreler (yani, hücresel oranlar, sertlik, hücre tipleri, vb.), canlılık yeterliyse farklı bağlamları temsil edecek şekilde değiştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig01.jpg"> Şekil 1: Bir sıvı basınç başlığı altında bir hidrojel içinde GSC'ler, astrositler ve mikrogliadan oluşan TME modelinin diyagramı. Hücreler, bir doku kültürü eki içinde bir kollajen-hyaluronik asit hidrojel içine gömülür. Yerçekimi kuvveti ağı aşağı doğru hareket ettirir. Doku kültürü ekleme zarındaki gözenekler, aşağı doğru istila eden hücrelerin doku kültürü ekinin alt yüzeyine yapışmasına izin verir ve bu hücreler sabitlenebilir, görüntülenebilir ve ölçülebilir. BioRender.com ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig02.jpg"> Şekil 2: Hidrojel bozunmasını takiben hücresel canlılık. G34'ler (GSC'ler), astrositler ve mikroglia, TME modelinde 4:1:1'de tohumlandı ve 37 °C'de 21 saat inkübe edildi. Jeller, toplam 30, 45 veya 60 dakika boyunca 0.3 mg / mL kollajenaz + 0.02 mg / mL dispas kullanılarak çıkarıldı ve bozundu, her 15 dakikada bir (30 dakikalık durum) veya 30 dakikada bir karıştırmak için pipetlendi ve sonra her 15 dakikada bir (45 dakika ve 60 dakikalık koşullar). Jeller parçalandıktan sonra, hücreler akridin turuncusu (tüm hücreler) ve propidyum iyodür (ölü hücreler) ile boyandı ve otomatik bir hücre sayacı kullanılarak sayıldı. TME modelindeki tüm hücreler için canlılık rapor edilir. Hücreler 30-60 dakika boyunca en az% 70 canlılığı korudu. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur; n = 3 biyolojik kopya. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>12 Kuyu Doku Kültürü Plakası, Steril</td><td>Celltreat Bilimsel Ürünler&nbsp;</td><td></td><td></td>229112</tr><tr><td>250 mL Filtre&nbsp; Sistem, PES Filtre Malzemesi, 0.22 & m, 50 mm, Steril</td><td>DOT Scientific</td><td>667706</td><td></td></tr><tr><td>385 nm, 1650 mW (Min) Monte LED, 1700 mA&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M385LP1-C1</td><td></td></tr><tr><td>75cm2 Doku Kültürü Şişesi - Havalandırma Kapağı, Steril</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &; m Hücre Kültürü Plakası Ekleme 12 mm Çap</td><td>Milicell</td><td>PI8P01250</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak Etanol, 200 kanıt, Akış</td><td>sitometrisi ölü hücre kontrolü için</td> Moleküler Biyoloji Sınıfı <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T038181000CS</td> Etanol.</tr><tr><td>Astrosit Ortamı (Astrofull)</td><td>ScienCell Araştırma Laboratuvarları</td><td>1801</td><td>Astrobazal, FBS ve penisilin/streptomisin içerir.</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BSA (MACS)</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD71 antikoru (eBioscience, Invitrogen)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>25-0719-41</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Odacıklı Slaytlar</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sıyırıcılar</td><td>Biologix USA&nbsp;</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2 Floresan Hücre Sayacı (Nexelcom Bioscience)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>NEXCCMK2-SK150-FCS</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj - Düşük Hızlı</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Hücre kültürü için</td> <td>5702 R</td> Santrifüj.</tr><tr><td>Şeffaf Polistiren 96 Kuyulu Mikroplakalar, Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-108</td><td>Akış sitometrisi boyama için V-alt plakalar.</td></tr><tr><td>CO<alt>2</alt>&nbsp; İnkübatör, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I, Yüksek Konsantrasyon, Sıçan Kuyruğu</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I, Sıçan Kuyruğu</td><td>Corning</td><td>354236</td> <td>Yapışan şişelerin kaplanması için "Düşük" konsantrasyon.</td></tr><tr><td>Kollajenaz (CAS # 9001-12-1)</td> <td>Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik</td><td>C7511-30</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX için Kolimasyon Adaptörü & IX, AR Kaplama: 350 - 700 nm</td><td>Thorlabs</td><td>COP1-A</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu Çubuklar, Q-ipuçları Hassas Uçlar&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B01KCJB3R2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (CAS# 9001-92-7)&nbsp;</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik</td><td>D3760</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz (Gibco)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (Gibco)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>26140079 Mikroglia kültürü için.</td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu,% 10 (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti (eBioscience, Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Glioma kök hücreleri</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Hasta kaynaklı veya ticari glioma kök hücre hatları olabilir.</td></tr><tr><td>Guava easyCyte HT Sistemi</td><td>Millipore Sigma</td><td>0500-4008</td><td>Akış sitometresi.</td></tr><tr><td>HBSS (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M) (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Darbe Modülasyonlu Yüksek Güçlü 1 Kanallı LED Sürücü, 10.0 A Maks, 50.0 V Maks&nbsp;</td><td>UV lambası için</td> <td>Thorlabs</td><td>DC2200</td> arayüzü.</tr><tr><td>Hoechst 33342 Çözelti (20 mM) (Thermo Scientific)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Astrositleri</td><td>ScienCell Araştırma Laboratuvarları</td><td>1800</td><td>Serebral korteksten türetilen birincil astrositler.</td></tr><tr><td>İnsan EGF Rekombinant Proteini (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-bazik (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Rekombinant Protein (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Ölümsüzleştirilmiş İnsan Mikrogliası - hTERT</td><td>Uygulamalı Biyolojik Malzemeler&nbsp;</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Incu-mikser MP Isıtmalı Mikroplaka Vortekser, 2 pozisyonlu</td><td>Benchmark Scientific&nbsp;</td>UV ışık yoğunluğunu ölçmek için <td>H6002</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antikoru</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-420</td><td></td></tr><tr><td>LED UV Kürleme Ölçer</td><td>Gigahertz-Optik</td><td>X1-RCH-116</td><td>Optometre.</td></tr><tr><td>Lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP)&nbsp;</td><td>Gelişmiş Biomatrix</td><td>5269-100MG&nbsp;</td><td>Foto başlatıcı.</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR (Invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L24975</td><td></td></tr><tr><td>Metakrilatlanmış hyaluronik asit (fotoHA)</td> <td>Gelişmiş Biomatrix</td><td>5212-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>75-997-203</td><td>Akış sitometrisi boyama için santrifüj.</td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100X) (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal-A Ortamı (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), Ca & olmadan pH 7.4 Mg</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>119-069-101</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, peletler ACS (CAS # 1310-73-2)</td> <td>VWR ve nbsp;</td><td>97064-476</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı (Gibco)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain AOPI Boyama Çözeltisi</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr></tbody></table>

İnterstisyel akışlı İnvaziv glioma mikroçevresinin fotopolimerize olabilen hyaluronik asit-kollajen modeli

A Photopolymerizable Hyaluronic Acid-Collagen Model of the Invasive Glioma Microenvironment with Interstitial Flow

İnvazyon (Şekil 3), canlılık ve akış sitometrisi yoluyla Ki67 ve CD71'in ekspresyonu (Şekil 4) için temsili veriler, daha önce bir tiyo-modifiye hyaluronan-kollajen hidrojel12 için yayınlandığı gibi GSC hatları için sağlanmıştır. TME modelinde astrositlerin ve mikrogliaların varlığı, hücre hattına bağlı olarak GSC invazyonu üzerinde farklı bir etkiye sahiptir (Şekil 4). Spesifik olarak, GSC'ler G44 ve G62<sup...

İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli

Glioblastoma recurrence is a major hindrance to treatment success and is driven by the invasion of glioma stem cells (GSCs) into healthy tissue that are ...

a-photopolymerizable-hyaluronic-acid-collagen-model-invasive-glioma

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, beyin tümörlerinden türetilen gliomasferlerin nasıl tek hücrelere ayrıldığını ve hyaluronik asit bazlı bir hidrojel içinde nasıl kapsüllendiğini göstermektedir. Bu süreç, yapılandırılmış, üç boyutlu bir glioblastoma modeli oluşturarak hücre-hücre etkileşimlerini teşvik eder.

Glioblastoma hücrelerinin 3 boyutlu kültürü için hyaluronik asit bazlı bir hidrojel

Bu videoda, glioblastoma ve mikroglia hücreleri bir polimer matris çözeltisi ile karıştırılır ve hücreleri gömerek bir jelin oluştuğu gözenekli bir oda ekine aktarılır. Mikroglia, glioblastoma hücrelerinin gözenekli ek yoluyla göçünü uyararak, tümör hücresinin çevre dokuya istilasını taklit eder, Hücreler daha sonra sabitlenir ve daha fazla analiz için hazırlanır.

Mikroglia Glioblastoma Ko-Kültürü Kullanılarak Matris Tabanlı Tümör İnvazyonu Modeli

Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Mevcut protokol, in vivo olarak enjekte edilebilir, biyo-duyarlı bir hidrojelin terapötik etkisini araştırmak için mikroskopi kullanarak bir glioblastoma (GBM) relaps sonrası modeli oluşturur.

Terapötik Hidrojel Araştırmaları için Glioblastoma Relaps Post-Rezeksiyon Modeli

Burada, tümör sferoidlerinin hızlı, sağlam ve ucuz bir şekilde üretilmesini ve ardından hidrojel kapsüllenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Özel ekipman gerektirmediği için yaygın olarak uygulanabilir. Sferoid-matriks etkileşimlerini araştırmak ve in vitro doku fizyolojisi veya patoloji modelleri oluşturmak için özellikle yararlı olacaktır.

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Eksojen hyaluronik asit (HA) ile yüksek çözünürlüklü kanser hücre etkileşimleri analiz olanak sağlayan yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Desenli yüzeyleri carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek imal edilir.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Biz heterojen tümör mikroçevrelerde yeniden bir mikroakışkan cihazın imalat ve operasyon için prosedür...

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

Keşfedin, interstisyel akışın glioblastoma invazyonuna etkisini 3D hiyaluronik asit-kollajen hidrojel modeli ve MRI görüntüleme kullanarak nasıl araştırıldığını. Bu yöntem, tümör mikroçevresinin davranışlarını anlamak için güçlü bir in vitro sistem sunar.

İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli

Daha fazla video keşfet