Name: Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Keşfedin nano ve mikrometre boyutlu veziküllerde metabolik ağların inşasını. Bu yöntem, lipit veziküllerde enzim kapsülleme ve membran protein rekonstitüsyonu kullanarak otonom büyüme yeteneğine sahip sentetik hücreler oluşturmayı amaçlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, pBAD-PercevalHR geninin klonlanması için Aditya Iyer'e ve protein üretimi ve saflaştırılmasına yardımcı olduğu için Gea Schuurman-Wolters'a teşekkür eder. Araştırma, NWO Yerçekimi programı "Sentetik Bir Hücre İnşa Etmek" (BaSyC) tarafından finanse edildi.

Kompleks Protein Ağları için Lipid Vezikül Kapsülleme Protokolü

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar rekabet eden hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Mikrometre altı boyutta lipid veziküller (proteoLUV'ler) içeren (membran) proteinin sentezi ve proteoLUV'lerin dev-unilamellar veziküllere (proteoGUV'lar) dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, diğer membran proteinlerinin 13,19,30,40 sulandırılması ve burada sunulan L-arginin parçalanması ve gliserol 3-fosfat sentez yolları dışındaki metabolik ağların kapsüllenmesi için uygulanabilir olmalıdır.
Lipozomlardaki zar proteinlerinin sulandırılması genellikle lipit zarı içindeki proteinlerin rastgele bir oryantasyonunu verir. ArcD ve Glpt için, oryantasyon önemli değildir, çünkü proteinler çift yönlü olarak çalışır ve çözünen maddeler toplam elektrokimyasal potansiyelin işaretine bağlı olarak hareket eder. Bir yönde işlev gören proteinler için, yönelimleri 50/50 olduğunda moleküllerin yarısı aktivite için mevcut olmayacaktır.
Veziküllerin bir polikarbonat filtreden ekstrüzyonu, boyut dağılımını daraltır ve filtrelerin gözenek boyutu ne kadar küçükse veziküller o kadar homojen hale gelir. Bununla birlikte, daha küçük veziküller, daha küçük bir hacme sahip olma ve dolayısıyla vezikül başına çok az sayıda proteine (enzimler, zar proteinleri) sahip olma pahasına gelir. Bir veya daha fazla bileşeni eksik olan LUV'lerin fraksiyonunu en aza indirmek için, proteinlerin konsantrasyonu Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi ayarlanabilir, ancak çok küçük veziküllerde stokastik etkiler kaçınılmazdır.
Jel destekli şişme yöntemi, kurutulmuş bir agaroz yüzeyi üzerinde sonikasyonlu veziküllerin (SUV'lar) birikmesine dayanır. Kurutma işlemi sırasında, veziküllerin bir konsantrasyon gradyanı oluşur ve lipit konsantrasyonu, noktanın çevresinde en yüksektir. Bu, kahve lekesi etkisi41,42 olarak bilinen bir fenomenden kaynaklanmaktadır. Sonuç olarak, nokta içinde sadece küçük bir bölge, GUV oluşumu için uygun bir lipit konsantrasyonu içerir. Dairesel düzensiz konsantre lipid lekeleri, vezikül füzyonu için mevcut olmayan geniş kullanılmayan alanlara neden olur; bu nedenle, bu yaklaşımda GUV oluşumunun etkinliği düşük olur. GUV'lerin verimini artırmak için, spin kaplama42 veya kahve lekesi etkisinden41 yararlanılarak gerçekleştirilebilen tek tip bir lipit birikimi hedeflenmelidir.
Protokol hakkında daha fazla not:
Stokastik etkilerden kaçınmak için vezikül başına ortalama olarak birkaç zar proteininin (>10) sulandırılmasına dikkat edilmelidir. Bu nedenle, 400: 1 w / w'den daha yüksek lipit-protein oranlarından kaçının. Çoğu protein için rastgele bir yönelim varsayılır.
İdeal olarak, toplam zar proteinlerinin hacmi mümkün olduğu kadar küçüktür ve yine de lipozom hacminin% 10-20'sini geçmez. Daha büyük hacimlerin eklenmesi daha fazla deterjan ortaya çıkaracaktır ve önceden oluşturulmuş lipozomların çoğu parçalanabilir, bu da sulandırma verimliliği üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir.
Ekstrüderin uygun çözelti ile önceden dengelenmesi, kapsülleme sırasında bileşenlerin seyreltilmesini önlemek için önemlidir. İdeal olarak, ön dengeleme çözeltisi aynı zamanda çözünür enzimleri de içermelidir, ancak ekstrüderin ön dengelenmesi için gereken nispeten büyük hacim nedeniyle enzimlerin dahil edilmesi çok maliyetli olabilir. Bu nedenle, tipik olarak bu bileşenleri atlıyoruz ve enzimlerin %5'lik bir seyreltmesini kabul ediyoruz.
Proteolipozom içeren karışımlara iyonoforlar eklenmelidir, çünkü moleküller oldukça hidrofobiktir ve veziküller yoksa yüzeylere adsorbe olabilir. Eklenen çözücü hacminin düşük olmasına dikkat edilmelidir (toplam reaksiyon hacminin% <1'i). Çözücülerin veziküllerdeki metabolik ağları etkilemediğini doğrulamak için kontroller yapılır. Yaklaşık 1 μM'lik iyonofor konsantrasyonları genellikle ~3 mg / mL'lik toplam lipid konsantrasyonları için güvenlidir.
Damlacıkların iyice kurumasına özen gösterilmelidir. Damlacıklar yeterince kuru değilse, lipitler lipid agregatları oluşturacağından ve şişme çözeltisi eklendiğinde MLV'ler oluşabileceğinden GUV oluşumu daha az verimlidir.
Glikoz, dış ortamın ozmolaritesini iç ortama eşleştirmek için kullanılır; ikincisi, veziküllerin yoğunluğunu arttırmak ve böylece GUV'lerin çökelmesini kolaylaştırmak için glikoz yerine sükroz içerir. Ayrıca, dış ortamdaki glikoz, faz kontrastını artırarak vezikülü daha kolay görünür hale getirir.
Stokastik etkiler GUV'lerde çok daha az sorun teşkil eder; Ancak burada, yüzey-hacim oranı kabul edilemez derecede düşük olabilir, böylece zar proteinlerinin sayısı (örneğin, taşıyıcılar) iç metabolik ağ için sınırlayıcı hale gelir. Bu protokolde açıklanan yöntem, proteoGUV'ların boyutu üzerinde hassas kontrole izin vermez, ancak çoğunluğu 5-50 μm boyut aralığındadır.
Sonuç olarak, burada sunulan çalışma, farklı boyutlardaki lipid veziküllerinde membran protein rekonstrüksiyonu ve enzim kapsüllemesi hakkında kapsamlı bir genel bakış sağlar. ATP'nin sentezi için fonksiyonel veziküllerin yapımını ve amino asitler ve gliserol gibi basit öncülerden yapı taşlarını gösteriyoruz. GUV'lerde membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması zor olmaya devam etmektedir, ancak burada sunulan protokoller, aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji araştırmalarında daha fazla gelişmenin önünü açmaktadır.

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji alanı, biyoteknolojik 3,4 veya biyomedikal amaçlar 5,6,7,8 için (minimal) hücreler 1,2 ve metabolik biyoreaktörler oluşturmaya odaklanır. Sentetik hücrelerin inşası, araştırmacıların, doğal ortamların proteinlerini taklit eden iyi tanımlanmış koşullarda proteinleri (zar) incelemelerine olanak tanıyan, proteinlerin ve reaksiyon ağlarının ortaya çıkan özelliklerinin ve gizli biyokimyasal işlevlerinin keşfedilmesini sağlayan benzersiz bir platform sağlar9. Otonom olarak işleyen bir sentetik hücreye doğru bir ara adım olarak, canlı hücrelerin metabolik enerji korunumu, protein ve lipid sentezi ve homeostaz gibi temel özelliklerini yakalayan modüller geliştirilmiştir. Bu tür modüller sadece yaşam anlayışımızı geliştirmekle kalmaz, aynı zamanda tıp8 ve biyoteknoloji10 alanlarında da potansiyel uygulamalara sahiptir.
Transmembran proteinler, molekülleri hücrenin içine veya dışına taşıdıkları, sinyal verdikleri ve çevrenin kalitesine yanıt verdikleri ve çok sayıda biyosentetik rol oynadıkları için hemen hemen her metabolik ağın merkezinde yer alır. Bu nedenle, sentetik hücrelerdeki metabolik modüllerin mühendisliği, çoğu durumda integral ve/veya periferik membran proteinlerinin, spesifik lipitlerden ve yüksek bütünlükten (düşük geçirgenlik) oluşan bir membran çift tabakasına yeniden yapılandırılmasını gerektirir. Bu zar proteinlerinin kullanımı zordur ve özel bilgi ve deneysel beceriler gerektirir.
Fosfolipid veziküller içindeki zar proteinlerini yeniden oluşturmak için, çoğunlukla spesifik bir proteinin fonksiyon11,12, regülasyon13, kinetik özellikler14,15, lipid bağımlılığı15,16 ve/veya stabilite17'yi incelemek amacıyla çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, deterjanla çözündürülmüş proteininlipitlerin 18 varlığında sulu ortama hızlı bir şekilde seyreltilmesini, deterjanla çözündürülmüş proteinin deterjanla destabilize edilmiş lipid vezikülleri ile inkübe edilmesiyle deterjanların uzaklaştırılmasını ve deterjan(lar)ın polistiren boncuklar19 üzerine emilmesini veya deterjanların diyaliz veya boyut dışlama kromatografisi20 ile uzaklaştırılmasını içerir. Organik çözücüler, örneğin yağ-su interfazlarının21 oluşumu yoluyla lipid vezikülleri oluşturmak için kullanılmıştır, ancak integral membran proteinlerinin çoğu, bu tür çözücülere maruz kaldıklarında inaktive edilir.
Laboratuvarımızda, büyük unilameller veziküller (LUV'ler) oluşturmak için çoğunlukla membran proteinlerini deterjan emme yöntemiyle yeniden sulandırıyoruz19. Bu yöntem, çoklu zar proteinlerinin birlikte sulandırılmasına ve enzimlerin, metabolitlerin ve probların vezikül lümeninde kapsüllenmesine izin verir22,23. Membran proteini içeren LUV'ler, elektroformasyon24 veya jel destekli şişme25 ve membran proteinlerinin26 bütünlüğünü korumak için özel koşullar kullanılarak, suda çözünür bileşenlerin kapsüllenmesi ile / kapsüllenmemesi ile dev unilamellar veziküllere (GUV'ler) dönüştürülebilir.
Bu makale, L-arginin'in L-ornitin27'ye parçalanması yoluyla ATP'yi yeniden üreten denge dışı bir metabolik ağın LUV'lerinde sulandırılması için bir protokol sunmaktadır. ATP oluşumu, fosfolipid sentezi için önemli bir yapı taşı olan gliserol-3-fosfat (G3P) üretimi ile birleştirilir22,28. Metabolik yol, bir arginin/ornitin (ArcD) ve bir G3P/Pi antiporter (GlpT) olmak üzere iki integral membran proteininden oluşur. Ek olarak, ATP'nin geri dönüşümü için üç çözünür enzim (ArcA, ArcB, ArcC) gereklidir ve GlpK, L-arginin'in parçalanmasından elde edilen ATP'yi kullanarak gliserolü gliserol 3-fosfata dönüştürmek için kullanılır, yolun şematik bir genel bakışı için Şekil 1'e bakın. Bu protokol, lipitlerin veya proteinlerin sentezi veya hücrelerin bölünmesi için daha da karmaşık reaksiyon ağlarının gelecekteki inşası için iyi bir başlangıç noktasını temsil eder. Veziküllerin lipid bileşimi, çok çeşitli integral membran proteinlerinin aktivitesini destekler ve çeşitli moleküllerin veziküllerin içine veya dışına taşınması için optimize edilmiştir 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Şekil 1: ATP üretimi ve gliserol 3-fosfat sentezi ve atılımı için yola genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Kısacası, saflaştırılmış zar proteinleri (dodesil-β-D-maltosit, DDM içinde çözündürülmüş), proteinlerin zara yerleştirilmesine izin veren Triton X-100 ile destabilize edilmiş önceden oluşturulmuş lipid veziküllerine eklenir. Deterjan molekülleri daha sonra (yavaşça) aktive edilmiş polistiren boncukların eklenmesiyle uzaklaştırılır ve bu da iyi kapatılmış proteolipozomların oluşumuna neden olur. Çözünür bileşenler daha sonra veziküllere eklenebilir ve molekülleri membran füzyonu sürecinde yakalayan donma-çözülme döngüleri yoluyla kapsüllenebilir. Elde edilen veziküller oldukça heterojendir ve çoğu çok lamelli boyalıdır. Daha sonra, daha düzgün boyutta veziküller veren 400, 200 veya 100 nm gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat filtreden ekstrüde edilirler; Gözenek boyutu ne kadar küçükse, veziküller o kadar homojen ve tek tiptir, ancak daha küçük bir iç hacim pahasına. Dahil edilmemiş proteinler ve küçük moleküller, boyut dışlama kromatografisi ile harici çözeltiden uzaklaştırılır. ProteoLUV'lar, jel destekli şişme ile mikrometre boyutunda veziküllere dönüştürülebilir ve bu proteoGUV'lar daha sonra toplanır ve mikroskobik karakterizasyon ve manipülasyon için bir mikroakışkan çip içinde tutulur. Şekil 2 , tam protokolün şematik bir genel bakışını göstermektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Şekil 2: Mikrometre altı (LUV'ler) ve mikrometre boyutundaki (GUV'ler) lipid veziküllerinde membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve suda çözünür bileşenlerin kapsüllenmesi için protokole genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Sulandırma ve kapsülleme protokolleri iyi çalışır ve proteinlerin işlevselliği korunur, ancak proteoLUV'lar ve proteoGUV'lar boyut olarak heterojendir. Mikroakışkan yaklaşımlar 31,32, boyut olarak daha homojen olan mikrometre boyutunda veziküllerin oluşumuna izin verir, ancak zar proteinlerinin işlevsel olarak yeniden yapılandırılması genellikle mümkün değildir, çünkü çift tabakadaki artık çözücü proteinleri inaktive eder. ProteoLUV'lerin boyutları 100 ila 400 nm arasında değişir ve düşük enzim konsantrasyonlarında, kapsülleme eksik metabolik yollara sahip veziküllere yol açabilir (stokastik etkiler; bkz. Şekil 3). LUV'ler, ATP ve G3P gibi yapı taşlarının üretimi için burada gösterildiği gibi belirli metabolik modüller oluşturmak için idealdir. Bu tür proteoLUV'lar potansiyel olarak GUV'lerde kapsüllenebilir ve konakçı veziküller için organel benzeri bölmeler olarak hizmet edebilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Şekil 3: Çapı 100, 200 veya 400 nm olan vezikül başına molekül sayısı. (A) Kapsüllenmiş proteinler (enzimler, problar) 1-10 μM aralığında olduğunda. (B) Sulandırma, lipid başına 1 ila 1.000, 1 ila 10.000 ve 1 ila 100.000 membran proteini (mol / mol) arasında yapılır. Moleküllerin belirtilen konsantrasyonlarda kapsüllendiği ve bu protein-lipit oranlarında zara dahil edildiği varsayımını yapıyoruz. Bazı enzimler için, zarlara bağlandıklarını gördük, bu da veziküllerdeki görünür konsantrasyonlarını artırabilir. Kısaltma: LPR = Lipid-Protein-Oranı <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Amicon kesme filtresi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore santrifüj filtre üniteleri Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Glikoz</td><td></td> <td>Formedium-D</td><td></td></tr> <tr><td>(+) - Sükroz</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Dietil Eter</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Florimetre</td><td>Jasco</td><td>Spektroflorometre FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Yerçekimi akış sütunu</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 100 ve mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 1000 ve mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>El LCP dağıtıcı</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>El Sonikatör</td><td>Hielscher Ultrason Teknolojisi</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Falcon tüp santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>Santrifüj 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornitin</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Lazer Tarama Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Mikroakışkan çip</td><td>Ev yapımı&nbsp;</td><td>PDMS tabanlı</td><td>DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spektrometresi</td><td>İzojen Yaşam Bilimleri</td><td>ND-1000 spektrofotometre NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>GUV'ler için İğneler</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4 '' 0.4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Mikroakışkanlar için İğneler</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2 '' 1.2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2 + Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nijercin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Ozmolalite ölçer</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 temel donma noktası ozmometresi</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>Plazma Aşındırma</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat filtre</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch Membran Ürün: 10417104</td><td>0.4 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Polikarbonat ultrasantrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars küvet (siyah)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 reçinesi&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & Malzemeler: INC</td>, <td>Sonics, vibrasyon hücresi</td><td></td></tr>, <tr><td>Şırınga filtresi</td>, <td>Sarstedt,</td><td>Filtropur S plus, 0.2</td>, <td>0.2 & m</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>santrifüj 5418</td><td></td></tr><tr><td>Teflon ara parçası</td><td>Ev yapımı&nbsp;</td><td>Teflon bazlı</td><td>45 x 26 x 1.5 veya 45 x 26 x 3 veya 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>UV lambası</td><td>Spektroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Spektrometresi</td><td>Jasco</td><td>V730 spektrofotometre</td><td></td></tr><tr><td>Valinomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Geniş alan floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta;-Kazein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

nano ve mikrometre boyutlu veziküllerde denge dışı metabolik ağların İnşası

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Saflaştırılmış bileşenler kullanarak entegre membran proteinleri, enzimler ve floresan bazlı sensörleri içeren karmaşık protein ağlarını veziküllere dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, biyoreaktörlerin tasarımı ve inşası ve karmaşık denge dışı metabolik reaksiyon ağlarının incelenmesi ile ilgilidir. Daha önce geliştirilmiş bir protokole göre (çoklu) membran proteinlerini büyük unilameller veziküllere (LUV'ler) yeniden yapılandırarak başlıyoruz. Daha sonra saflaştırılmış enzimler, metabolitler ve floresan bazlı sensörlerin (floresan proteinler veya boyalar) bir karışımını donma-çözülme-ekstrüzyon yoluyla kapsüllüyoruz ve dahil edilmemiş bileşenleri santrifüjleme ve/veya boyut dışlama kromatografisi ile çıkarıyoruz. Metabolik ağların performansı, floresan okuması ile ATP/ADP oranı, metabolit konsantrasyonu, dahili pH veya diğer parametreler izlenerek gerçek zamanlı olarak ölçülür. 100-400 nm çapındaki membran proteini içeren veziküllerimiz, mevcut ancak optimize edilmiş prosedürler kullanılarak dev-unilamellar veziküllere (GUV'ler) dönüştürülebilir. Yaklaşım, çözünür bileşenlerin (enzimler, metabolitler, sensörler) mikrometre boyutundaki veziküllere dahil edilmesini sağlar, böylece biyoreaktörlerin hacmini büyüklük sırasına göre yükseltir. GUV'leri içeren metabolik ağ, optik mikroskopi ile analiz edilmek üzere mikroakışkan cihazlarda tutulur.

Lipozomlarda çözünmüş zar proteinlerinin sulandırılması, önceden oluşturulmuş veziküllerin dengesizleştirilmesini gerektirir. Düşük miktarlarda Triton X-100 ilavesi, başlangıçta veziküllerin şişmesiyle ışık saçılımındaki artışa bağlı olarak 540 nm'de (A540) bir absorbans artışı ile sonuçlanır (Şekil 4). Maksimum A540 değeri, lipozomların deterjanla (Rsat) doyurulduğu noktadır, bundan sonra herhangi bir Triton X-100 ilavesi, veziküllerin kısmen çözünmesine neden olacaktır. Rsol'da lipozomlar tamamen çözündürülür (Şekil 4). Membran proteinlerinin sulandırılması için, tipik olarak Rsat'ın ötesinde (okla gösterilir) `'a kadar kararsızlaştırılmış veziküller kullanırız.
Sulandırılmış zar proteini ArcD, L-arginini veziküllerin içine ve L-ornitini veziküllerden dışarı taşımak için kullanılır ve ATP'yi ADP ve inorganik fosfattan geri dönüştürmek için kapsüllenmiş enzimler ArcA, ArcB ve ArcC ile birlikte kullanılır. GlpT, GlpK ile birlikte gliserol 3-fosfatın gliserol artı L-arginin parçalanması tarafından üretilen ATP'den sentezi (ve atılımı) için gerekli olan bir gliserol 3-fosfat/fosfat antiporteridir. Proteolipozomlara t = 0'da 5 mM L-arginin ilavesi, veziküllerin içindeki ATP/ADP oranını yansıtan 500 ve 430 nm uyarma39'da PercevalHR floresan oranında dik bir artışa neden olur (Şekil 5). Gliserol ilavesi üzerine, ATP, gliserol 3-fosfat sentezi için kullanılır, bu da ATP / ADP oranının28 düşmesine neden olur. L-arginin'in parçalanması ayrıca piran veya pHluorin27 kullanılarak ölçülebilen pH değişikliklerine yol açar.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Şekil 5: ATP'nin L-arginin parçalanma yolu ile geri dönüşümü. 2.7 mg lipid / mL'deki LUV'ler bir küvete yerleştirilir ve 500 nm ve 430 nm'de floresan oranı kaydedilir. t = 0'da 5 mM L-arginin eklenir. F500/F430 oranı, veziküllerin içindeki ATP/ADP oranının bir ölçüsüdür. Kısaltma: LUV'ler = büyük unilamellar veziküller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
ATP üreten LUV'ler, GUV'leri oluşturmak için de kullanılabilir. Kurutulmuş proteo-LUV'lerin bir LGT agaroz jeli üzerinde rehidrasyonu, mikrometre boyutunda veziküllerin oluşumuna neden olur (Şekil 6). Kurutulmuş LUV lekeleri içinde proteo-GUV'lerin oluşumu, büyük ölçüde yerel lipit konsantrasyonuna ve dehidrasyon derecesine bağlıdır. Bazı bölgelerde büyük GUV yamaları bulunurken, aynı damlacıktaki diğer yerlerde hiç veya birkaç GUV oluşabilir. LGT agaroz destekli şişme yoluyla GUV'lerin oluşumu, tipik olarak birkaç mikrometreden 50 μm'ye kadar bir dizi GUV boyutu ile sonuçlanır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Şekil 6: Jel destekli şişme ile oluşan proteoGUV'ların DIC görüntüleri. Ölçek çubuğu = 25 μm. Kısaltmalar: DIC = diferansiyel girişim kontrastı; GUV'ler = dev-unilammellar veziküller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
GUV'ler hasat edilir ve β kazeinli pasifleştirilmiş PDMS bazlı bir mikroakışkan cihazda tutulur (Şekil 7). Cihaz, tek bir deney içinde birçok vezikülün yakalanabileceği ve analiz edilebileceği şekilde tasarlanmıştır ve cihaz, dış ortamı (akış hızı, tampon bileşimi vb.) kontrol etmek için kullanılır. 34. Proteo-GUV'lerin verimi düşük olsa bile, GUV'lerin mikroakışkan çipten sürekli akışı birçok vezikülün toplanmasını sağlar. Yeterli sayıda GUV yakalandıktan sonra, sistem, çözünür proteinler, küçük moleküller ve floresan problar gibi harici bileşenleri uzaklaştırmak için ozmotik olarak dengelenmiş bir tamponla yıkanır. Yıkama tamponu daha sonra 50 mM KPi (pH 7.0), değişen miktarlarda glikoz (ozmolaliteyi ayarlamak için) ve 10 mM L-arginin gibi substratlar içeren eşit ozmolaliteye sahip bir substrat çözeltisi ile değiştirilir. Mikroakışkan çipin birkaç tuzağı üzerinde bir zaman serisi deneyi yapılır ve görüntüler her 90 saniyede bir alınır (PercevalHR kullanıldığında 405 nm ve 488 nm uyarma). Ayrıca, her zaman noktasında bir parlak alan görüntüsü alınır. 488 ve 405 nm'de uyarılma sonrası emisyon yoğunluklarının oranı, veziküllerdeki ADP/ATP oranının bir ölçüsüdür.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Şekil 7: Mikroakışkan çip ile veziküllerin yakalanması. (A) Dış ortamı ve akış hızını kontrol etme yeteneği ile birlikte veziküllerin yakalanması. (B) Mikroakışkan bir cihazda hapsolmuş ve 405 nm lazer (yeşil) ve 488 lazer (kırmızı) ile uyarılmış ProteoGUV'lar. Her iki kanal için emisyon &gt;500 nm'de ölçülür. Parlak alan görüntüsü, veziküllerin floresan olmadan görselleştirilmesini sağlar. Ölçek çubuğu = 25 μm. Kısaltma: GUV'lar = dev-unilamellar veziküller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Hollanda'da, BaSyC konsorsiyumu moleküler bileşenlerden sentetik hücreler inşa etmeyi hedefliyor. BaSyC konsorsiyumu, moleküler biyolojiden kimyaya, fiziğe ve hesaplamalı bilimlere kadar çeşitli araştırma gruplarından oluşmaktadır. Bu konsorsiyumun amacı, bilgiyi iletmek ve bölmek için özerk büyüme yeteneğine sahip, kendi kendini kopyalayan bir sistem oluşturmaktır.Ve şu anda daha karmaşık moleküler sistemlere entegre edilmiş moleküler ağların inşasına odaklanıyoruz. Sentetik biyolojideki son gelişmeler, hücresel işlevler için modüllerin mühendisliğini, bunları teşhis, terapi, sentetik immünoloji ve uyarlanabilir materyallerdeki uygulamalar için karmaşık ağlara entegre etmeyi içerir. Bu ilerleme, Avrupa, Amerika ve Asya'daki grupları kapsıyor ve sentetik hücre yapımına hem yukarıdan aşağıya hem de aşağıdan yukarıya yaklaşımlar geliştiriyor.Alanımızdaki mevcut teknolojiler, metabolik ağları oluşturmak ve optimize etmek için mühendislik ve evrimsel yöntemleri içerir. Moleküler seçim için yapay zekayı, bileşen izolasyonu ve ağ oluşumu için ileri biyokimyasal ve biyofiziksel teknikleri kullanıyoruz. Ayrıca floresan spektroskopisi ve mikroskopi yoluyla membran sulandırma, fiziksel kapsülleme ve görselleştirme kullanıyoruz.Modüllerin entegrasyonuyla, zar proteinlerinin ve enzimlerin sayısı büyük ölçüde artar ve bu da sulandırma ve kapsülleme teknolojilerimiz üzerinde kısıtlamalar oluşturur. Stokastik kapsülleme, mikron altı boyutlu veziküllerle ilgili bir sorun haline gelir ve lipid zarında birden fazla zar proteini yeniden oluşturulduğunda mikrometre boyutunda vezikül oluşturma verimliliği azalır. Groningen'de, ATP üretimleri için metabolik ağlar geliştirdik ve substrat besleme ve ürün ihracatı yoluyla denge dışı bir durumu sürdürdük.Ek olarak, ATP geri dönüşümünü lipid öncüllerinin sentezi ve atılımına bağlayarak, ikincil veziküllerin lipit üretmesini sağladık, bu da alanımızda önemli bir ilerlemedir.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda veziküller, transkripsiyon ve çeviri makine kapsülleme ve protein üretiminin izlenmesi hazırlanması için basit bir yöntem tarif eder. Elde edilen hücre-içermeyen sistemler gittikçe daha karmaşık hücresel taklit oluşturmak için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir.

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Mevcut protokol, biyouyumlu lipozomlar üretmek için mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajını (OLA) tanımlamaktadır. OLA, verimli kapsülleme ile monodispersed, mikron boyutunda lipozomlar üretir ve anında çip üzerinde deneylere izin verir. Bu protokolün sentetik biyoloji ve sentetik hücre araştırmaları için özellikle uygun olması beklenmektedir.

Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı

Bu makale, fazla ayrılmış dev veziküller içindeki hücre iskeleti ağlarının basit bir tek kap sulandırmasını tanıtmaktadır. Yöntem genelleştirilebilir ve çok çeşitli biyomoleküllerin kapsüllenmesi veya hapsedilmesi için uygulanabilir.

Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

Keşfedin nano ve mikrometre boyutlu veziküllerde metabolik ağların inşasını. Bu yöntem, lipit veziküllerde enzim kapsülleme ve membran protein rekonstitüsyonu kullanarak otonom büyüme yeteneğine sahip sentetik hücreler oluşturmayı amaçlar.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Daha fazla video keşfet