Name: Demir Açlığı ve Anaerobik Büyümeyi Takiben Yersinia psödotuberculosis Tip III Sekresyon Sistemi Aktivitesinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin, Yersinia pseudotuberculosis'un demir ve oksijen seviyelerine bağlı olarak Tip III sekresyon sistemi aktivitesini nasıl düzenlediğini. Bu yöntem, bakteriyel virülans mekanizmalarını anlamak ve enfeksiyon stratejileri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Demir Tükenmesi ve Anaerobik Stres Altında Yersinia Pseudotuberculosis'te T3SS Aktivitesi

<ol><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+structure%2C+function+regulation+of+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).</li>
<li>Springer International Publishing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+Type+III+Protein+Secretion+Systems%22">Bacterial Type III Protein Secretion Systems</a>. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).</li>
<li>Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+type+III+secretion+system+as+a+tool+for+studying+cytosolic+innate+immune+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance.</a> Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Singhal, R., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+battle+in+the+gut%3A+Hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+metabolic+and+inflammatory+responses+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine.</a> J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).</li>
<li>Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+for+iron%3A+the+alternative+siderophore+iron+scavenging+systems+in+highly+virulent+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).</li>
<li>Lesic, B., Carniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Transfer+of+the+high-pathogenicity+island+of+Yersinia+pseudotuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis.</a> J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).</li>
<li>Green, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+virulence+and+protects+against+reactive+oxygen+species+produced+by+phagocytic+cells+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection.</a> PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).</li>
<li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+Ysc-Yop+%26%2334%3BType+III%26%2334%3B+weaponry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia Ysc-Yop &#34;Type III&#34; weaponry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).</li>
<li>Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+type+III+secretion+mechanisms+for+YopE+in+Yersinia+enterocolitica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica.</a> Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).</li>
<li>Straley, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+low-Ca2%2B+response+virulence+regulon+of+human-pathogenic+yersiniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathog%22%5BJournal%5D)">The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae.</a> Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).</li>
<li>Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+has+a+tropism+for+B+and+T+cell+zones+of+lymph+nodes+that+is+independent+of+the+type+III+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system.</a> PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).</li>
<li>Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+pseudotuberculosis+YopD+mutants+that+genetically+separate+effector+protein+translocation+from+host+membrane+disruption%3A+YopD+central+region+promotes+Yop+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation.</a> Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).</li>
<li>Hooker-Romero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+oxygen+tension+regulate+the+Yersinia+Ysc+type+III+secretion+system+to+enable+disseminated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection.</a> PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).</li>
<li>Balderas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scale+analysis+reveals+IscR+directly+and+indirectly+regulates+virulence+factor+genes+in+pathogenic+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia.</a> mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).</li>
<li>Bearden, S. W., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yfe+system+of+Yersinia+pestis+transports+iron+and+manganese+and+is+required+for+full+virulence+of+plague%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague.</a> Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%3A+Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis.</a> FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).</li>
<li>Wijerathne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+new+class+of+%5B2Fe-2S%5D+protein+that+functions+in+bacterial+iron+homeostasis%2C+requires+a+structural+anion+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site.</a> Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).</li>
<li>Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ABC+transporter+system+of+Yersinia+pestis+allows+utilization+of+chelated+iron+by+Escherichia+coli+SAB11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11.</a> J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).</li>
<li>Miller, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IscR+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+type+III+secretion+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence.</a> PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 mL Luer-Lok Uçlu şırınga</td><td>BD</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS Koşu Tamponu&nbsp;</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>0.25 M Tris baz, 1.92 M Glisin, 1 L hacimde %1 SDS</td></tr><tr><td>%12.5 SDS-Page Jel</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL kültür tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>İlk gece için&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüpleri</td><td>Falcom</td><td>352196</td><td>Süpernatan toplama için</td></tr><tr><td>250 mL kültür şişesi</td><td>Belco</td><td>251000250</td> 500 mL Filtre Sistemi Corning 431097 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 N Hidroklorik asit çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732185</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Chemical</td><td>A949-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Bio Rad ChemiDoc MP Görüntüleme Sistem</td><td>Bio Rad</td><td>Model Numarası: Üniversal Başlık III</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kültür tüpleri</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-34</td><td>Anaerobik kültür için</td></tr><tr><td>Chelex 100 Reçine</td><td>Bio Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Chelex M9 +%0,9 Glikoz ortamı</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>6 g/L Na<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt>, 3 g/L KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt>, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH<alt>4</alt>Cl, %1 kasamino asitler, <güçlü>%0.9 dekstroz</güçlü>, %0.0005 tiamin, 5 g/L Chelex 100 Reçine. Ortamı oda sıcaklığında 18 saat karıştırın, 500 mL Corning filtrasyon ünitesi kullanarak süzün, ardından 1 mM MgSO4 </alt>nihai çözelti için MgSO4 ekleyin</td></tr><tr><td>Nihai Numune Tamponu (FSB)</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>0,1 M Tris-HCl, %4 SDS, %20 gliserol, %0,2 Bromofenol Mavisi</td></tr><tr><td>FSB: DTT çözümü</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>FSB+0.2M DTT</td></tr><tr><td>Görüntü Laboratuvarı Yazılımı</td><td>Bio Rad</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z</td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>Isotemp Isı Bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860021</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plakaları</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>10 g Tripton, 5 g Maya özü, 10 g NaCl, 1 L toplam hacimde 15 g Agar. Otoklavlanmış</td></tr><tr><td>M9 +% 0.2 Glikoz Ortamı</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>6 g / L Na2HPO4, 3 g / L KH2PO 4, 0.5 g / L NaCl, 1 g / L NH < alt >4Cl, 1 mM MgSO<alt>4</alt>, 1 mg/L FeSO<alt>4</alt>7H<alt>2</alt>O, %1 kasamino asitler, <güçlü>%0.2 dekstroz</güçlü>, %0.0005 tiamin ve nbsp;</td></tr><tr><td>Şırınga için Millex-GP PES 0.22um filtre eki</td><td>FeSO47H2O filtrasyonu için</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td></tr><tr><td>Şırınga için Millex-GV PVDF 0.22um filtre eki</td><td>Süpernatant filtrasyonu için</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RS</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Lekesiz Standart</td><td>Bio Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Jel Aparatı</td><td>Bio Rad</td><td>Model Numarası: Mini PROTEAN Tetra Hücresi</td><td></td></tr><tr><td>SilverXpress Gümüş Boyama Kiti&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr><tr><td>BellyDancer Shaker</td><td>IBI Bilimsel</td><td>BDRAA1155</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit çözeltisi 6.1N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Vinil Anaerobik Oda</td><td>Coy Lab Ürünleri</td><td></td><td>https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details</td></tr><tr><td><güçlü>qPCR Primer dizileri&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA ileri - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA ters - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd ileri - ccagcatcagccccatacag</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd ters - tggcttgtcggatgcacttc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE ileri - CCATAAACCGGTGGTGAC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE ters - CTTGGCATTGAGTGATACTG</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demir açlığı ve anaerobik büyümeyi takiben yersinia psödotuberculosis tip iii sekresyon sistemi aktivitesinin Ölçülmesi

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

Bu yöntem, salgılanan Yops'un ilgilenilen bir referans koşuluna göre çeşitli koşullar arasında göreceli olarak karşılaştırılmasına izin verir. Genel deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Tablo 1, hücre kültürü normalizasyonunun tipik olarak her bir kültür koşulu örneğinde nasıl gerçekleşeceğinin ve her bir süpernatana eklenecek TCA hacminin bir temsilini göstermektedir. Burada, wildtype (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1'in yanı sıra iki konjenik mutant, ΔyscNU ve Δ yopE kullanılarak temsili sonuçlar gösterilmiştir. ΔyopE mutantı, YopE'den yoksun bir kontrol olarak kullanılırken, Δ yscNU mutantı, işlevsel bir T3SS13,14 monte edemediği için tam birT3SS negatif kontrol olarak kullanılır. Salgılanan proteinleri içeren gümüş lekeli% 12.5 SDS-PAGE jelinin temsili bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, her numune, protein çökeltme verimliliği için bir kontrol olarak çivili BSA içeriyordu. Verilerin analizinde, anaerobik ve aerobik veri setleri, her biri ayrı ayrı normalleştirildiğinden bağımsız veri setleri olarak ele alınmalıdır. Anaerobik numunelerde, önceki sonuçlarla tutarlı olarak, düşük demir numunelerinde yüksek demir numunelerine göre ~ 38 kat daha fazla YopE mevcuttu15,16. Aerobik örneklerde, önceki sonuçlarla tutarlı olarak, düşük ve yüksek demir örneklerinde benzer miktarda salgılanan YopE gözlenmiştir16. Genel olarak, istatistiksel anlamlılık oluşturmak için her koşulun en az üç biyolojik kopyası kullanılır.
Bu protokolün yeterli demir açlığı ile sonuçlandığını doğrulamak için, tüm koşullarda vahşi tip suşta demire duyarlı genler yfeA ve bfd üzerinde qPCR analizi yapıldı. YfeA, demir taşınmasından sorumlu bir ABC taşıma sisteminin periplazmik bağlayıcı proteinidir, Bfdise demir depolarının mobilizasyonunda yer alan bakteriyoferritin ile ilişkili bir ferredoksindir 17,18,19,20. RNA, daha önce21 tarif edildiği gibi izole edildi ve beklendiği gibi, yfeA ve bfd, Şekil 3'te gösterildiği gibi, hem aerobik hem de anaerobik olarak demir içeren koşullara göre demir tükenmiş koşullarda önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Ek olarak, protein seviyesinde nispi YopE için gözlemlenen sonuçların yopE transkript seviyeleri ile tutarlı olduğunu doğrulamak için qPCR kullanarak yopE mRNA kararlı durum seviyelerini ölçtük (bkz. Şekil 3).
Son olarak, bakteriler stresli kültür koşullarında parçalanmaya eğilimli olduklarından, bu protokoldeki adımların potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar doğurabilecek bakteri lizisi ile sonuçlanmadığını göstermek önemliydi. Bunu doğrulamak için, TCA ile çökeltilmiş süpernatant numuneleri western blotlamaya tabi tutuldu ve RNA polimerazın bir alt birimi ve bir sitoplazmik protein olan YopE ve RpoA için araştırıldı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, YopE ekspresyon modeli Şekil 3'te gösterileni takip ederken, numune süpernatantlarında RpoA'nın bulunduğuna dair bir kanıt yoktu, bu da süpernatana sitoplazmik RpoA salacak gözlemlenebilir bir lizis olmadığını düşündürdü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig01.jpg"> 
Şekil 1: Değişen demir ve oksijen mevcudiyeti altında büyüyen Yersinia pseudotuberculosis için deneysel iş akışı. Kültür adımlarının grafiksel gösterimi. Asitle yıkanmış cam eşyaların 4. günden itibaren kullanılması gerektiğini unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig02.jpg"> 
Şekil 2: Kültür süpernatanlarından elde edilen TCA ile çökeltilmiş proteinin gümüş lekeli .5 SDS-PAGE jelinin sonuçları. Çökeltilmiş kültür süpernatantları% 12.5'lik bir SDS-PAGE jel üzerine yüklendi ve gümüş boyandı. (A) Anaerobik olarak yetiştirilen WT, ΔyscNU ve ΔyopE suşlarının sekresyon profili. Anaerobik WT demir dolgulu numuneye normalize edilmiş YopE'nin temsili nispi değerleri. (B) Aerobik olarak yetiştirilen WT, ΔyscNU ve Δ yopE suşlarının sekresyon profili. Aerobik WT demir dolgulu numuneye normalize edilmiş YopE'nin temsili nispi değerleri. Beyaz oklar YopE'yi (~23 kDa) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig03.jpg"> 
Şekil 3: Demire duyarlı genlerin nispi mRNA seviyeleri demir açlığını göstermektedir. RNA, Şekil 1'de tarif edilen koşullarda kültürlenen WT Y. pseudotuberculosis'ten izole edildi. qPCR, anaerobik (AC) ve aerobik (DF) koşullarda 16S rRNA'ya normalize edilmiş yfeA, bfd ve yopE seviyelerinin nispi ekspresyonunu ölçmek için kullanıldı. ****p &lt; 0.0001, eşleşmemiş bir t-testi ile belirlendiği gibi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig04.jpg"> 
Şekil 4: Süpernatant örneklerinde sitoplazmik RpoA eksikliği, kültür koşullarında hücre lizizinin eksikliğini göstermektedir. Şekil 3'ten (A) anaerobik ve (B) aerobik numunelerin 5 μL çökeltilmiş süpernatantları, bir pelet kontrolü ile birlikte% 12.5'lik bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırıldı. Proteinler, batı lekeleme için bir PVDF membranına aktarıldı. Membran kesildi ve üst yarısı bir anti-RpoA antikoru kullanılarak RpoA için problandı ve alt yarısı bir anti-YopE antikoru kullanılarak YopE için problandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">(Bir)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ANAEROBİK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koşul</td>
			<td>OD</td>
			<td>Toplanacak Hacim (mL)</td>
			<td>6.1 N TCA'lık hacim SUP'a eklendi (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Düşük Demir</td>
			<td>0.5</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Yüksek Demir</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">(B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AEROBİK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koşul</td>
			<td>OD</td>
			<td>Toplanacak Hacim (mL)</td>
			<td>SUP'a eklenen 6.1N TCA hacmi (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Düşük Demir</td>
			<td>0.9</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Yüksek Demir</td>
			<td>1.4</td>
			<td>3.857</td>
			<td>0.386</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Temsili örnek toplama iş akışı. 5. günde, (A) anaerobik numuneler için 37 ° C'de 4 saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra, en düşük OD600 değerine sahip numunenin 6 mL'si toplandı ve numune hacimlerinin geri kalanı buna göre normalize edildi. Süpernatanı filtreledikten sonra 6.1 N TCA eklendi. (B) Aerobik inkübasyonlar (26 ° C'de 2 saat ve 37 ° C'de 4 saat) tamamlandıktan sonra, en düşük OD600 değerine sahip numunenin 6 mL'si toplandı ve numune hacimlerinin geri kalanı buna göre normalize edildi. Süpernatanı filtreledikten sonra 6.1 N TCA eklendi.

Demir Açlığı ve Anaerobik Büyümeyi Takiben Yersinia psödotuberculosis Tip III Sekresyon Sistemi Aktivitesinin Ölçülmesi

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or ...

quantifying-yersinia-pseudotuberculosis-type-iii-secretion-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, biz, maya ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi bakteri tip III etkileyiciler ifadesi için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu tür fenotipleri sonradan efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir.

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Kaynak: Gupta, S., ve diğerleri. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, demir stresini indüklemek ve bakterilerin hayatta kalmasını destekleyen sideroforların salgılanmasını teşvik etmek için Mycobacterium tuberculosis'in demir sınırlı koşullar altında kültürlenmesi prosedürünü göstermektedir.

Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

Gram-negatif Yersinia türlerinin ve Yersinia olmayan Enterobacteriaceae kültürleriyle başlayın.Steril iğne aşılayıcıları kullanarak, kültürleri hem geleneksel Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin veya CIN agar hem de modifiye CIN agar üzerine noktalayın.Bakteri üremesini teşvik etmek için plakaları inkübe edin.Hem geleneksel hem de modifiye CIN agarlar, asidik yan ürünler üretmek için mannitol'ü fermente eden Yersinia ve Yersinia olmayan Enterobacteriaceae'nin büyümesini destekler.Asit üretimi pH'ı...

Modifiye Edilmiş Bir Sefsulodin-Irgasan-Novobiosin Agar Kullanılarak Yersinia Türlerinin Geliştirilmiş Diferansiyel İzolasyonu

Bu video, plazmositoid dendritik hücrelerin HIV-1 Enfekte CD4+ T hücreleri tarafından uyarılmasını takiben salınan tip-I interferonları (IFNler) ölçmek için HEK-Blue interferon-α/β raportör hücreleri kullanılarak salgılanan embriyonik alkalin fosfataz testini göstermektedir.

Salgılanan Embriyonik Alkalen Fosfataz Raportör Testi Kullanılarak Biyoaktif Tip-I İnterferonların Miktar Tayini

Burada, Cag Tip IV Salgı Sistemi (Cag-T4SS) olarak bilinen onkojenik bakteri organelini görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.  Cag-T4SS'nin, değişen demir mevcudiyeti koşullarına yanıt olarak H. pylori'nin yüzeyinde farklı şekilde üretildiğini bulduk.

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu Helikobakter pilori Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Burada metal alımı için genlerin ekspresyonunu kolaylaştırmak için metal sınırlı sıvı ortamda Neisseria gonorrhoeae büyüme için bir yöntem açıklar. Ayrıca bu koşullarda yetiştirilen gonokokların fenotipini karakterize etmek için aşağı akım deneylerini ana hatlar. Bu yöntemler, diğer bakterilerde metal duyarlı genlerin karakterizasyonu için uygun olarak uyarlanabilir.

Neisseria gonorrhoeae'nin Metal-Sınırlı Büyümesi, Ev Sahibi Ligandlardan Metal Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Metal Edinimi için

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.

Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Keşfedin, Yersinia pseudotuberculosis'un demir ve oksijen seviyelerine bağlı olarak Tip III sekresyon sistemi aktivitesini nasıl düzenlediğini. Bu yöntem, bakteriyel virülans mekanizmalarını anlamak ve enfeksiyon stratejileri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Demir Açlığı ve Anaerobik Büyümeyi Takiben Yersinia psödotuberculosis Tip III Sekresyon Sistemi Aktivitesinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet