Demir Açlığı ve Anaerobik Büyümeyi Takiben Yersinia psödotuberculosis Tip III Sekresyon Sistemi Aktivitesinin Ölçülmesi

Bakteriyel patojenler, konakçı organizma içindeki farklı nişleri kolonize etmek için virülans faktörlerini kullanır. Bakteriyel patojenlerin virülans faktörü ekspresyonunu düzenlemek için konakçı dokulardaki spesifik çevresel ipuçlarını nasıl algıladığını anlamak için çalışıyoruz. İnsan patojeni Yersinia pseudotuberculosis, efektör proteinleri konakçı hücrelere enjekte etmek için tip üç sekresyon sistemi virülans faktörünü kullanır.

Tip üç salgı sistemi, bakterilerin konak savunma mekanizmalarını bozmasına ve konakçı dokuları kolonize etmesine izin verir. Bununla birlikte, Yersinia Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonu metabolik olarak külfetlidir, bu nedenle tip üç sekresyon sistemi genlerinin ekspresyonu, sıcaklık gibi çevresel ipuçlarına yanıt olarak sıkı bir şekilde düzenlenir. Önceki yayınlarımız, Yersinia Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonunun, ISCR adı verilen bir transkripsiyon faktörü aracılığıyla demir mevcudiyeti ve oksijen gerilimi tarafından kontrol edildiğini göstermiştir.

Bu bulgular önemlidir çünkü Yersinia, demir içeriği ve oksijen gerilimi bakımından değişen konakçı dokuları kolonize eder. Örneğin, bağırsak lümeni Yersinia'nın büyümesi için yeterli demir içerir, ancak düşük oksijen gerilimine sahiptir. Buna karşılık, kan gibi dokular çok düşük demir mevcudiyetine sahiptir, ancak oksijen gerilimi daha yüksektir.

Yöntemimiz, bu çevresel ipuçlarının tip üç salgı sisteminin ekspresyonunu nasıl etkilediğini incelemek için mevcut demir ve oksijen miktarında değişen kültür koşullarında Yersinia'yı yetiştirmemize izin verir. Bu yöntem, demir ve oksijen mevcudiyetinin tip üç sekresyon sisteminin ekspresyonunu kontrol ettiği moleküler mekanizmayı belirlememize ve bunun Yersinia enfeksiyonunun sonucunu nasıl kontrol ettiğini anlamamıza yardımcı olacaktır. Başlamak için, Lizojeni et suyu agar plakalarında Yersinia Pseudo tuberculosis'i çizin.

Plakaları oda sıcaklığında 48 saat inkübe edin. Görünür koloniler oluştuğunda, izole edilmiş tek bir koloniyi dört mililitre M9 ortamına aşılayın. 250 RPM'de havalandırma ile gece boyunca 26 santigrat derecede kültürleyin.

Kültürü içeren bir küveti bir spektrometreye yerleştirin, ardından 0.1'lik bir OD600 değeri elde etmek için kültürü demir takviyesi olmadan 14 mililitre steril şelatlı M9 ortamında seyreltin. Şişeleri 26 derecelik bir çalkalayıcıya yerleştirin ve sekiz saat inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, üç taze kültürü başlatmak için kültürü kullanın; ikisi anaerobik büyüme için ve biri aerobik büyüme için.

Aerobik kültürleme için, kültürü demir takviyesi olmadan 14 mililitre steril şelatlı M9 ortamında 0.1'lik bir OD600 değerine seyreltin. Daha sonra, 12 saat boyunca 26 santigrat derecede havalandırma ile kültür. Anaerobik kültürleme için, kültürü 14 mililitre steril şelatlı M9 ortamında iki asitle yıkanmış cam tüpe seyreltin.

İlk tüpte, litre başına bir miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar filtreyle sterilize edilmiş demir sülfat ekleyin. İkinci tüpte, litre başına 0.01 miligramlık bir nihai konsantrasyon için demir sülfat ekleyin. Her iki tüpü de anaerobik bir odada oda sıcaklığında 12 saat inkübe edin.

Daha sonra, anaerobik kültürleri 37 santigrat dereceye kaydırarak ve dört saat boyunca inkübasyona devam ederek tip üç salgı sistemi aktivitesini indükleyin. Daha sonra, aerobik olarak büyüyen kültürleri, asitle yıkanmış iki şişeye 14 mililitre şelatlı M9 ortamı ekleyerek 0.2'lik bir OD600 değerine seyreltin. Şişelere gerekli son konsantrasyonlarda demir sülfat ekleyin.

Her iki şişeyi de iki saat boyunca 250 RPM'de 26 santigrat derecede havalandırma ile inkübe edin. İki saat sonra, tip üç salgı sistemi aktivitesini indüklemek için kültürleri dört saat boyunca 250 RPM'de havalandırma ile 37 santigrat dereceye kaydırın. Yersinia pseudotuberculosis'te tip üç sekresyon sistemini indükledikten sonra, inkübe edilmiş bu kültürün normalleştirilmiş hacimlerini 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Protein çökeltme kontrolü olarak her tüpe dört mikrolitre sığır serum albümini ekleyin. Kültürleri 3.200 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Bir şırıngaya bağlı 0.22 mikron PVDF filtresi kullanarak süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe süzün.

Ardından, süpernatan hacminin %10'una eşdeğer trikloroasetik asit ekleyin. Tüpleri bir dakika boyunca kuvvetlice girdaplayın. Tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede soğuk bir odada buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra, iki mililitrelik bir tüpe her numuneden iki mililitre ekleyin, ardından dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 21.000 G'de santrifüjleyin. Bir vakum eki kullanarak süpernatanı aspire edin. İki mililitre numuneyi aynı tüpe, santrifüje pipetlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı aspire edin.

Çökelme reaksiyonlarını iki mililitrelik tek bir tüpte birleştirin. Peletleri bir mililitre buz gibi %100 asetonla yıkayın, ardından santrifüjleme ve süpernatan aspirasyonu yapın. Süpernatanı son kez çıkardıktan sonra, peleti tezgahta bir saat kurutun.

Çökelmiş protein, tüpün kenarı boyunca bir pus gibi görünmelidir. Ardından, her peleti 50 mikrolitre F-S-B-DTT çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bir dakika boyunca iyice girdap yapın.

Daha sonra, numuneleri 95 santigrat derecede bir ısı bloğunda 15 dakika kaynatın. Ardından, oda sıcaklığında maksimum hızda kısa bir süre santrifüjleyin. Analiz için her anaerobik numuneden 15 mikrolitre ve her aerobik numuneden 10 mikrolitre %12.5 SDS-PAGE jele yükleyin.

Jel çalışması tamamlandıktan sonra, jel üzerindeki proteinleri görselleştirmek için gümüş boyama kullanın. Başlamak için, bir görüntüleme sistemine Yersinia pseudotuberculosis'in ayrılmış aerobik örneklerini içeren bir SDS-PAGE jeli yerleştirin. Yazılımda, tüm kuyucuklarda tip üç salgı sistemi efektör proteini YopE'yi temsil eden bantları seçin.

Referans YopE bandını uygun örneğe ayarlayın. Tüm YopE bantları için yazılım tarafından hesaplanan göreli niceleme değerlerini dışa aktarın. Ardından, tüm kuyucuklardaki tüm BSA bantlarını seçin.

Referans BSA bandının, referans YopE bandının örneğiyle eşleştiğinden emin olun. Tüm BSA bantları için bağıl niceleme değerlerini dışa aktarın. Normalleştirilmiş sonuçlar elde etmek için YopE değerini her koşul için BSA değerine bölün.

Gümüş lekeli SDS-PAGE jeli, anaerobik numunelerde, düşük demir numunelerinde yüksek demir numunelerine kıyasla 38 kat daha fazla YopE bulunduğunu ortaya koydu. Aerobik örneklerde, bu proteinler hemen hemen benzer miktarlarda salgılandı.