Name: Önceden Karıştırılmış ve Dondurularak Kurutulmuş Reaktifler ile Bakım Noktası CRISPR Tabanlı Teşhis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, bakım noktasında enfeksiyon hastalıklarının genetik materyalini tespit etmek için önceden karıştırılmış ve dondurularak kurutulmuş CRISPR tabanlı reaktiflerle izotermal amplifikasyon yöntemini. Bu yaklaşım yüksek hassasiyet sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Bakım noktasında kullanım için optimize edilmiş CRISPR tabanlı moleküler tanı protokolü

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

Nükleik asit biyobelirteçlerinin tespiti için CRISPR tabanlı tanı ilk olarak 2017'derapor edildi 1,2,3,4 ve o zamandan beri, özellikle Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) RNA'sının tespiti için Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı testlerle yeni nesil tanı olarak kanıtlanmıştır, birden fazla ülkede 5,6,7,8. Koronavirüs hastalığı 2019'un (COVID-19) ötesinde, teknolojilerin çeşitli virüs ve bakterileri 9,10,11,12,13, genetik hastalık mutasyonlarını ve delesyonlarını tespit etmek için etkili olduğu gösterilmiştir ve protein ve küçük moleküllü biyobelirteçleri tespit etmek için tasarlanabilir 2,12. CRISPR tabanlı tanılama genellikle rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) veya döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP)14,15 gibi izotermal amplifikasyon yöntemlerini, hedef tanımadan sonra "teminatal" endonükleaz aktivitesi ile RNA kılavuzluğunda CRISPR ile ilişkili (Cas) enzimler kullanılarak CRISPR tabanlı algılama ile birleştirir3. İzotermal amplifikasyon ve CRISPR tabanlı tespitin ikili kullanımı, teknolojilere, özellikle altın standart polimeraz zincir reaksiyonununkine (PCR) yaklaşan yüksek tanısal doğruluk ve tek nükleotid polimorfizmleri dahil olmak üzere küçük dizi farklılıklarını çoğullama ve tespit etme yeteneği olmak üzere birçok arzu edilen özellik kazandırır 1,9.
Bununla birlikte, CRISPR tabanlı tanılamanın en doğru sürümleri, birden fazla bileşen ve adım içerir ve uzman olmayan kişilerle veya bakım noktasında (POC) gerçekleştirilmesi karmaşık olabilir. Yüksek doğrulukta CRISPR tabanlı tanılamaların kullanımını POC ayarlarına genişletmeye yönelik bu zorluğun üstesinden gelmek için, kullanımı ve depolanması kolay olan önceden karıştırılmış, liyofilize, rekombinaz tabanlı izotermal amplifikasyon ve CRISPR tabanlı algılama reaksiyonları hazırlamak için protokoller geliştirdik7. Bu protokoller, CRISPR tabanlı tanılama7 için gerekli biyokimyasal bileşenlerin üretimi hakkında ekbilgiler, tasarım kılavuzları1 ve alternatif izotermal amplifikasyon teknikleri 2,14,15,16 ve Cas enzimleri12 kullanan formülasyonlar içeren CRISPR tabanlı tanılama14 üzerindeki mevcut mükemmel protokolleri tamamlamalıdır. Sonuç olarak, CRISPR tabanlı teşhislerin, taşınabilir ve enstrümantal içermeyen analizlerin gerekli olduğu ortamlarda hızlı, ucuz ve hassas nükleik tespitin gerçekleştirilmesine yardımcı olabileceğini umuyoruz 1,9,17.
Protokollerimizde öncelikle RPA ve Cas13 tabanlı algılama kombinasyonunu kullanıyoruz. RPA, ortama yakın sıcaklıklarda (37-42 °C) çalışır ve bu nedenle düşük enerji ve ekipman gereksinimlerine sahiptir. Diğer izotermal amplifikasyon reaksiyonları daha yüksek sıcaklıklar gerektirir (LAMP, 60-65 °C; iplikçik yer değiştirme amplifikasyonu (SDA), 60 °C; üstel amplifikasyon reaksiyonu (EXPAR), 55 °C; ve helikaz bağımlı amplifikasyon (HDA), 65 °C)2. RPA primerlerinin tasarımı da LAMP primerlerinin aksine karmaşık değildir ve çoğullanmış amplifikasyon 7,9,14'e genişletilebilir. RPA ile iki hedefin ötesinde çoğullama pratikte zor olsa da, paraziti en aza indirmek için çoğullanmış RPA primerlerinin nasıl tasarlanacağına dair net yönergeler vardır18.
Taşıma kontaminasyonu iki adımlı iş akışında büyük bir sorun olmaya devam ederken, RPA'nın üretilen amplikonlarının boyutu küçüktür ve LAMP14'ün büyük birleştirici amplikonlarına kıyasla taşınma kontaminasyonuna neden olma olasılığı daha düşüktür. RPA primerleri standart yönergelere14 göre tasarlanabilir: genellikle 25-35 nükleotid uzunluğundadırlar ve erime sıcaklıkları 54 ila 67 °C'dir. Amplikon boyutu 200 baz çiftinden küçük olmalıdır. Ters transkriptaz enzimi (RT), RNA'dan amplifikasyonu sağlamak için RPA'ya eklenebilir ve ters transkripsiyon-RPA'da (RT-RPA), elde edilen RNA'nın çözülmesine yardımcı olmak için tipik olarak başka bir enzim Ribonükleaz H (RNaz H) eklenir: DNA hibriti ve amplifikasyon reaksiyonunu teşvik eder 5,19. Cas13 tabanlı tespit için T7 transkripsiyonuna izin vermek için, T7 RNA polimeraz promotörü, ileri RPA primerinin 5' ucuna yerleştirilebilir.
RPA'dan amplikonlar üretildikten sonra, crRNA programlı Cas enzimleri ile tespit edilebilirler. Amplikon tespiti için kullanılabilecek çeşitli Cas enzimleri arasında, yüksek bölünme aktiviteleri1 ve iyi karakterize edilmiş polinükleotid bölünme tercihleri 7,9 nedeniyle RNA hedefli Cas13 varyantlarını tercih ediyoruz, ikincisi çoğullanmış tespit için kullanılabilir. Cas13 için crRNA dizisi, ara parça ve doğrudan tekrar (DR) dizileri ile üretilen RNA'daki hedef bölgeye tamamlayıcı (ters tamamlayıcı) olacak şekilde tasarlanmıştır. Arka planı ve yanlış pozitifleri artıran hedef dışı amplifikasyon ürünlerinin istenmeyen Cas tabanlı tespitini önlemek için crRNA dizisi ve RPA primerleri üst üste gelmemelidir14.
Cas tabanlı algılama, raportör nükleik asit moleküllerinin bölünmesini izlemek için farklı algılama modalitelerine dayanır (Cas13 tabanlı reaksiyonlar için RNA raportörleri)1,2,14. Farklı algılama modaliteleri arasında kolorimetri, elektrokimyasal okumalar, floresan, sıralama okumaları ve yanal akış şeritleri2 bulunur. Tek bir mavi LED ışık kaynağı kullanılarak etkili bir şekilde uyarılabilen siyanin 5 (Cy5), rodamin X (ROX) ve karboksifloresein (FAM) gibi çeşitli floroforlar ve raportörler verilen floresan okumasına odaklanıyoruz ve floresanları bir mikroplaka okuyucu veya gerçek zamanlı bir termal döngüleyici 7,14 tarafından analiz edildi. Ek olarak, floresan okumanın kurulumu kolaydır ve gerçek zamanlı kantitasyon sağlayan sürekli izlemeye izin verir. Cas enzimleri kullanılarak çoğullanmış RPA preamplifikasyonu ve çoğullanmış Cas13 tabanlı algılama, birden fazla genetik hedefinaynı anda tespiti için çok renkli floresan okumaları ile birleştirilebilir 2,7.
Protokollerimizde, önce RNA örneğini RT-RPA reaktifinin liyofilize formuna ekleyerek RNA'yı RT-RPA ile izotermal olarak çoğaltıyoruz (Şekil 1). RT-RPA sırasında, T7 promotörü, oluşturulan çift sarmallı DNA ampliconuna eklenir. Daha sonra RPA ürünleri, yine T7 RNA polimeraz içeren liyofilize Cas13 tabanlı algılamaya aktarılır. Bu tespit reaksiyonu, DNA amplikonlarını RNA'ya (T7 RNA polimeraz aracılığıyla) dönüştürecektir, bu da crRNA programlanmış Cas13 ile kolayca tespit edilebilir. Hedefle aktive edilen Cas13, tespit edilebilir floresan sinyali 2,7,14 üretmek için raportör molekülleri parçalayacaktır. Buradaki protokoller Leptotrichia wadei (LwaCas13a) tarafından tespit ile ilgili olsa da, ortogonal Cas13 ve Cas12 enzimleri 7,9 kullanılarak dört adede kadar hedefin eşzamanlı, çoğullanmış tespitine genişletilebilir. RPA ve Cas tabanlı algılama reaksiyonları, hassasiyet kaybıyla da olsa tek bir tüpte birleştirilebilir14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> Şekil 1: CRISPR tabanlı algılama iş akışı. İş akışı, iki hedef genin tespitini gösterir. İlk olarak, DNA hedefi içindeki ilgi alanları RPA ile izotermal olarak amplifiye edilir; reaksiyon, RNA hedefleri tespit edilirken ters transkripsiyon (RT-RPA) ile gerçekleştirilebilir. Daha sonra, T7 transkripsiyonu, dsDNA amplikonlarını RNA'lara dönüştürür ve bu da hedef bağlanma üzerine kollateral RNaz aktivitesini ortaya çıkarabilen Cas13-crRNA kompleksleri tarafından tanınır. Söndürülmüş floresan raportörlerinin bölünmesi, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak izlenebilen, bir LED transilluminatör tarafından görselleştirilebilen veya gerçek zamanlı bir termal döngüleyici ile kullanılabilen floresan sinyalleri üretir. Kısaltmalar: CRISPR = Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar; RT = ters transkripsiyon; RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; Cas = CRISPR ile ilişkili protein; LED = ışık yayan diyot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Burada sunulan protokollerin temel özellikleri, liyofilizasyon için ön karıştırma formülasyonlarıdır. Ön karıştırma, reaksiyon kullanımını basitleştirir ve tekrarlanabilirliği artırır, ancak RPA ve Cas tabanlı algılama içindeki birçok bileşen, özellikle ters transkripsiyon ve ATP gibi bazı kararsız kofaktörler çözeltide kararlı değildir. Bu nedenle, önceden karıştırılmış çözeltileri, uzun süreli depolama ve kolay taşıma ve dağıtım için dondurularak kurutulabilecek şekilde formüle ediyoruz 1,9,20. Önceden karıştırılmış, dondurularak kurutulmuş reaktifler, reaksiyonu10 yeniden oluşturmak için daha yüksek numune hacmi (ve dolayısıyla daha yüksek DNA/RNA girişi) eklenebileceğinden, algılama hassasiyetinin iyileştirilmesine de yardımcı olur. Formülasyonlarımızda, liyofilize RPA ve Cas bazlı tespit reaksiyonlarında kriyoprotektan olarak öncelikle trehaloz21 kullanıyoruz7. Reaktif korumasına ek olarak, trehaloz ayrıca enzim stabilizasyonunu 16,22,23,24 artırarak ve dsDNA23'ün erime sıcaklıklarını azaltarak reaksiyonları teşvik eder. Trehalozun ötesindeki diğer stabilizatörlerin5,7,21,25,26 araştırılması, farklı kullanım senaryoları için daha da optimal formülasyonlar sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Betain çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>DEPC ile Arıtılmış su</td><td>İnvitrojen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript ters transkriptaz</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>Şirket içi</td><td></td> üretim <td>Suş adı: Leptotrichia wadei, Kısaltma: Lwa, Protein adı: LwaCas13a</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür çözeltisi, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 RNA polimeraz</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum asetat çözeltisi, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Riobnükleotid Çözelti Karışımı</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td></td><td>TCI TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloz Dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hidroklorür çözeltisi, 1M, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Temel kiti</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD Çift LED Mavi/Beyaz ışıklı aydınlatıcı</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Kuru Banyo Çift Blok</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>Model: EL-02</td></tr><tr><td>Floresan mikroplaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td>30050303</td><td>Model: Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>Dondurarak Kurutucu</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad Tezgah Üstü Dondurarak Kurutucu</td></tr><tr><td>Mikroplaka 384 kuyulu</td><td>Greiner</td><td>GDE0784076</td><td>F-Alt, küçük hacimli, Hibase, Med. Ciltleme, Siyah</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı termal döngüleyici (CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Sistemi)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>Modeli: CFX Connect Optik Modülü</td></tr><tr><td>Oligonükleotid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>s-gen ileri RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-geni ters RPA primeri</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-gen ileri RPA primeri</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>n-gen ters RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>S geni için LwaCas13a-crRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAA GAAGGGGACUAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA n geni için</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ muhabiri</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA astarı</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA astarı</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

Önceden karıştırılmış ve dondurularak kurutulmuş reaktifler ile bakım noktası crispr tabanlı teşhis

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

SARS-CoV-2'nin s ve n genlerinin birlikte tespitinden FAM floresan sinyali üretiminin kinetiğini ve bilgilerin liyofilize, önceden karıştırılmış reaksiyon formülasyonları için en uygun koşulları belirlemek için nasıl kullanıldığını vurguluyoruz. Tüm durumlarda, protokollerin daha iyi hassasiyetle farklılaşmasına izin vermek için, belirlenen tespit limiti (LoD) (Ct ~ 31-33) dahilinde C tdeğerlerine sahip numuneleri ve LoD'de Ct (Ct ~ 35-37)7 olan numuneleri dahil ettik.
Liyofilize, önceden karıştırılmış RT-RPA için, önceden karıştırılmış reaksiyona KOAc'ın dahil edilmesinin reaksiyon duyarlılığını olumsuz etkilediğini bulduk (Şekil 2A). Bu nedenle, önceden karıştırılmış reaksiyondan KOAc'yi çıkardık ve RNA numunesi eklendikten sonra reaksiyon başlatıcısı Mg(OAc)2 ile ekledik. Ayrıca, bir kriyoprotektan trehalozun optimal konsantrasyonunu (Şekil 2B) ve liyofilize RT-RPA reaksiyonunda triglisin7'nin etkilerini (Şekil 2C) belirlemek için benzer testler kullandık. Bu nedenle, optimal liyofilize edilmiş, önceden karıştırılmış RT-RPA reaksiyonları, %6 trehaloz ile hazırlandı, KOAc yoktu (ancak daha sonra RNA örneğinden sonra eklendi) ve protokol bölüm 1'de açıklandığı gibi triglisin ile desteklendi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> Şekil 2: Liyofilize, önceden karıştırılmış RT-RPA reaksiyonlarının optimize edilmesi. RT-RPA reaksiyonu, SAR-CoV-2'nin n genini hedef alan primerler kullanılarak hazırlandı. Mg(OAc)2 tüm önceden karıştırılmış reaksiyonlardan çıkarıldı. Önceden karıştırılmış reaksiyonlara eklenen (A) KOAc, (B) trehaloz ve (C) triglisinin etkileri değerlendirildi. Üretilen FAM floresansı yoluyla reaksiyon izleme, gerçek zamanlı bir termal döngüleyici veya bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirildi. Üçlü ölçümlerden elde edilen bireysel veriler gösterilir. Kısaltmalar: RT = ters transkripsiyon; RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar; Cas = CRISPR ile ilişkili protein; SAR-CoV-2 = Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2; Ct = döngü eşiği; FAM = karboksifloresein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Liyofilize, önceden karıştırılmış Cas13a bazlı reaksiyonlar için, doğru kriyoprotektanın önemini doğruladık: ya %6 trehaloz ya da %2 sükroz19 iyi çalıştı, %1 veya %5 w/v'de daha düşük sükroz PEG20000 liyofilizasyondan sonra reaksiyon verimliliğini korumadı (Şekil 3). MgCl2 tüm reaksiyonlardan çıkarıldı ve rehidrasyon adımında eklendi. Optimal liyofilize Cas13 bazlı tespit reaksiyonu, protokol bölüm 2'de gösterildiği gibi% 6 trehaloz ile hazırlandı.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> Şekil 3: Liyofilize edilmiş, önceden karıştırılmış Cas13 tabanlı algılama reaksiyonlarının optimize edilmesi. Tespit reaksiyonu, SARS-CoV-2 n geninden elde edilen RPA ürünü kullanılarak 37 °C'de gerçekleştirildi. Testler liyofilizasyondan önce ve sonra yapıldı. MgCl2 tüm önceden karıştırılmış reaksiyonlardan çıkarıldı. (A) trehaloz, (B) PEG20000 ve (C) sakarozun liyofilizasyondan sonra reaksiyon etkinliğini korumadaki yetenekleri değerlendirildi. Üretilen FAM floresansı yoluyla reaksiyon izleme, gerçek zamanlı bir termal döngüleyici kullanılarak gerçekleştirildi. "Liyofilizasyon sonrası" koşullar için üçlü ölçümlerden elde edilen bireysel veriler ve "liyofilizasyon öncesi" koşullardan bir kopya veriler gösterilmektedir. Şekil 3A,B, Patchsung ve ark.7'den alınmıştır. Kısaltmalar: RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; SAR-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; FAM = karboksifloresein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
RT-RPA ve Cas13 bazlı reaksiyonlar için liyofilize, önceden karıştırılmış reaktifler, en az 8 ay boyunca -20 °C'de stabildir [Şekil 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> Şekil 4: Liyofilize, önceden karıştırılmış RPA ve CRISPR-Cas13a reaktiflerinin -20 °C'de stabilite testleri. (A) 30 gün, (B) 45 gün, (C) 3 ay, (D) 5 ay, (E) 8 ayda stabilite testi. Üçlü ölçümlerden elde edilen bireysel veriler gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
SARS-CoV-2'nin s ve n genlerinin tespiti için liyofilize RT-RPA ve Cas13 tabanlı reaksiyonların LoD'si Şekil 5'te gösterilmektedir. Sinyal üretme kinetiği, yalnızca bir genin tespit edildiği duruma kıyasla çift gen tespiti üzerine geliştirilebilir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> Şekil 5: Tek gen ve çift gen tespitinin analitik duyarlılığı. (A) SAR-CoV-2'nin s genini hedefleyen liyofilize singleplex RT-RPA ve Cas tabanlı tespitin LoD'si. (B) SAR-CoV-2'nin n genini hedefleyen liyofilize singleplex RT-RPA ve Cas tabanlı tespitin LoD'si. (C) Liyofilize multipleks RT-RPA'nın LoD'si ve s ve n genlerini hedefleyen çift Cas tabanlı algılama. LoD, seri olarak seyreltilmiş SARS-CoV-2 RNA'ları kullanılarak belirlendi ve Ct değerleri n genini hedefleyen bir RT-qPCR testi kullanılarak belirlendi. 3-6 tekrarlanan ölçümden elde edilen bireysel veriler gösterilir. Kısaltmalar: LoD = algılama sınırı; RT = ters transkripsiyon; RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar; Cas = CRISPR ile ilişkili protein; SAR-CoV-2 = Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2; Ct = döngü eşiği; qPCR = kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Virüs tespitinin ötesinde, Tayland'a özgü zehirli yılan türlerini tanımlamaya yardımcı olmak için CRISPR teşhisine dayalı bir POC genotipleme aracının bir prototipini sergiliyoruz (Şekil 6). Isırık yaralarından toplanan DNA örnekleri aracılığıyla yılan türlerinin daha hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanması, panzehirlerin hızlı bir şekilde uygulanmasına yardımcı olarak hastanın hayatta kalma şansını artırabilir. Ophiophagus hannah (Kral kobra) dahil olmak üzere sekiz yılan türünün mitokondriyal sitokrom b (cytb) geni içindeki bölgeleri hedefledik (Şekil 6A) ve O. hannah cytb geninin sentetik DNA vekillerinin tespitinin attomolar duyarlılık seviyesine ulaşabileceğini gösterdik (Şekil 6B,C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> Şekil 6: Yılan ısırığı zehirlenmesinden yılan türlerini tanımlamak için CRISPR tabanlı tespit için bir prototip. (A) Ophiophagus hannah'nın cytb geninin tespiti için RPA primerleri ve LwaCas13a crRNA tasarımı. T7 promotor (T7 çıkıntısı), ileri RPA astarının 5' ucuna yerleştirildi. (B) 60 dakika boyunca FAM sinyal üretiminin kinetiği ve (C) LwaCas13a'dan elde edilen son nokta FAM floresansı, O. hannah'dan cytb gen segmentlerine karşılık gelen sentetik dsDNA girdilerinin tespiti. Farklı giriş konsantrasyonları (0, 10-9, 10-12, 10-15 ve 10-18 M) kullanıldı. Veriler, üçlü ölçümlerden elde edilen ortalama ± s.d.'dir. Kısaltmalar: RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar; Cas = CRISPR ile ilişkili protein; FAM = karboksifloresein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">CRISPR-Cas13a önceden karıştırılmış tespit reaktiflerinin liyofilizasyonu</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Adım</td>
			<td>Rampa Hızı</td>
			<td>Raf Sıcaklığı</td>
			<td rowspan="2">Zaman (ss:dd)</td>
			<td>Vakum</td>
		</tr><tr><td>(°C/dk)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(MBAR)</td>
		</tr><tr><td>Dondurma 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>kapalı</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Kuru 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>kapalı</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Kuru 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Kuru 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Önceden karıştırılmış RT-RPA ve CRISPR-Cas13a algılama reaktiflerinin liyofilizatör ayarları. Kısaltmalar: RT = ters transkripsiyon; RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar; Cas = CRISPR ile ilişkili protein.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Parametre</td>
			<td>Ayar</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Sıcaklık</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kinetik döngü</td>
			<td>Süre</td>
			<td>02:00 (aa:ss)</td>
		</tr><tr><td>Aralık süresi</td>
			<td>02:30 (aa:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Sal -layarak</td>
			<td>Süre</td>
			<td>1 saniye</td>
		</tr><tr><td>Mod</td>
			<td>Doğrusal</td>
		</tr><tr><td>Bolluk</td>
			<td>1 Milimetre</td>
		</tr><tr><td>Floresan yoğunluğu</td>
			<td>Uyarma dalga boyu</td>
			<td>488 deniz mili</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Emisyon dalga boyu</td>
			<td>520 deniz mili</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Mod</td>
			<td>Sayfanın Üstü</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Z-Konumu</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Kazanç</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Entegrasyon süresi</td>
			<td>20 μs</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Yanıp sönme sayısı</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Nükleik asit tespiti için floresan mikroplaka okuyucu programı.

Önceden Karıştırılmış ve Dondurularak Kurutulmuş Reaktifler ile Bakım Noktası CRISPR Tabanlı Teşhis

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

point-care-crispr-based-diagnostics-with-premixed-freeze-dried

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu bir CRISPR/Cas12a sistemi ile birleştiren bir protokol sunuyoruz ve hasta başı DNA virüsü tespiti için yapay zeka destekli bir sınıflandırma ile taşınabilir akıllı telefon mikroskobu oluşturuyoruz.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

Burada, ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) ile insan örneklerinde SARS-CoV-2 virüsünü tespit etme yöntemini standartlaştırmak ve uygulamak için eksiksiz bir protokol sunuyoruz. 60 dakika içinde yapılan bu yöntem, düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir.

SARS-CoV-2 Virüsünü Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon ile Tespit Etme

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Burada, amplifikasyona hazır hücre lizzi, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR/Cas12a tahlilleri kullanarak Lotmaria passim ve Nosema ceranae gibi arı patojenlerinden DNA'yı tespit etmek için basit ve hızlı bir prosedürü açıklıyoruz.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Öğrenin, bakım noktasında enfeksiyon hastalıklarının genetik materyalini tespit etmek için önceden karıştırılmış ve dondurularak kurutulmuş CRISPR tabanlı reaktiflerle izotermal amplifikasyon yöntemini. Bu yaklaşım yüksek hassasiyet sağlar.

Önceden Karıştırılmış ve Dondurularak Kurutulmuş Reaktifler ile Bakım Noktası CRISPR Tabanlı Teşhis

Daha fazla video keşfet