Name: Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Keşfedin in vivo elektroporasyon ve kısa süreli reinnervasyon yöntemleriyle kranial levator auris longus kasında sinir-kas kavşağı rejenerasyon mekanizmalarını. Bu protokol, kas kaynaklı proteinlerin postsinaptik asetilkolin reseptörlerinin stabilizasyonundaki rollerini araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Levator Auris Longus Kasında Elektroporasyon ve Sinir Hasarı

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+Coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+function+recovery%3A+Deciphering+a+regenerative+niche+at+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).</li>
<li>Kobayashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+duration+of+muscle+denervation+on+functional+recovery+in+the+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model.</a> Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).</li>
<li>Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+murine+neuromuscular+synapse+relies+on+long-lasting+morphological+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations.</a> BMC Biol. 20 (1), 158(2022).</li>
<li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+A+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+Amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-and+postsynaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J Vis Exp. (55), e3124(2011).</li>
<li>Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+causes+differential+effects+on+postsynaptic+stability+in+normal+and+denervated+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses.</a> Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).</li>
<li>Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+electrotransfer+of+plasmid+into+skeletal+muscle+by+pretreatment+with+hyaluronidase%3A+Increased+expression+with+reduced+muscle+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage.</a> Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).</li>
<li>Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp. (32), e1520(2009).</li>
<li>Ojeda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+An+amenable+model+system+to+study+the+role+of+postsynaptic+proteins+to+the+maintenance+and+regeneration+of+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse.</a> Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).</li>
<li>Olmstead, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facial+nerve+axotomy+in+mice%3A+A+model+to+study+motoneuron+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury.</a> J Vis Exp. (96), e52382(2015).</li>
<li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury%3A+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).</li>
<li>Lloyd, M., Wolfensohn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+use+of+distress+scoring+systems+in+the+application+of+humane+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Humane+Endpoints+in+Animal+Experiments+for+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints.</a> Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+Red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Perez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p75%28ntr%29+neurotrophin+receptor+is+required+to+organize+the+mature+neuromuscular+synapse+by+regulating+synaptic+vesicle+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).</li>
<li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+anatomy+of+the+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction.</a> Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biol. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Ma, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+axonal+growth+promotes+motor+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+motor+recovery+after+prolonged+denervation+of+the+neuromuscular+junction+is+not+due+to+regenerative+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure.</a> Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tdtomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections%3A+Insight+and+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+A+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
<li>Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+electroporation+as+a+plasmid+delivery+system+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle.</a> Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).</li>
<li>Pérez-García, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+musk+activity+delays+denervation+and+improves+motor+function+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice.</a> Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#5/45 Dumont forseps&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Kullanmadan önce sterilize edin</td></tr><tr><td>anti 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>Seyreltik 1: 300</td></tr><tr><td>anti S100 Kullanıma Hazır</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>Seyreltik 1: 5</td></tr><tr><td>anti SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>Seyreltik 1: 50</td></tr><tr><td>Klorheksidin glukonat %2</td> <td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğuk ışık diseksiyon stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>Model SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Seyreltik 1: 100</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>Dumont Mini Forseps kullanmadan önce sterilize edin</td></tr><tr><td>&ndash; Stil 5</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>11200-14</td><td>Kullanmadan önce sterilize edin</td></tr><tr><td>ECM 830 elektroporatör</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Altın iğne tipi elektrotlar&nbsp;</td><td>Genetrodes, BTX</td><td>45-0114</td><td>10 mm düz</td></tr><tr><td>Hamilton şırınga&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>İnhalasyon anestezi makinesi</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000 Masa Üstü</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>Fareler</td><td>Instituto de Salud Publica - Şili</td><td></td><td>Yetişkin (3-6 aylık) CF-1 fareleri, her iki cinsiyetten (30-45 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>Tıraş</td><td>bıçakları Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812. J</td><td>Emilebilir poliglikolik asit ipliği&nbsp;</td></tr><tr><td>tdDomates plazmidi</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>tdCMV promotörü</td></tr><tr><td>Tramadol hidroklorür kontrolü altında domates plazmidi %5 (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Bahar</td><td>Makası Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>Kullanmadan önce sterilize edin</td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>W7024</td><td>Seyreltik</td></tr><tr><td>&alfa;-BTX Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>Seyreltik 1: 500</td></tr></tbody></table>

kranial levator auris longus İskelet kasının kombine İn vivo elektroporasyonu ve kısa süreli reinnervasyonu

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

tdTomato proteini20'nin yüksek floresan kuantum verimi, onu elektroporasyon verimliliği için uygun bir izleyici yapar. Bu nedenle, in vivo elektroporasyon ile LAL kaslarında tdTomato proteininin ekspresyonu değerlendirildi (Şekil 1). LAL kasları elektroporasyondan 21 gün sonra diseke edildi. Tam montaj preparatları, LAL kasının iki innervasyon bölgesi ile ince kaudal bandını (cLAL, camgöbeği poligonu) ve beş innervasyon bölgesi 8,10 ile kalın rostral bandı (rLAL, sarı poligon) gösterir (Şekil 1B). DNA enjeksiyonunun yapıldığı bölgeye ve elektrotların konumlandırılmasına göre, özellikle rLAL kısmından elde edilen yüksek oranda kas lifleri, tdTomato ekspresyonu için pozitifti (Şekil 1B). İşlemin etkinliğini değerlendirmek için transvers kriyoseksiyonlar tarifedildiği gibi 16 yapıldı (Şekil 1C). Kantifikasyon, tdTomato ekspresyonu için pozitif liflerin f.70 ± %5.95'ini gösterir (Şekil 1D). Daha sonra, kas lifi hasarını değerlendirmek için, hasar/rejenerasyon döngülerinin bir işareti olarak merkezi çekirdeklerin (ok uçları) varlığını tanımlamak için kas zarı WGA ve çekirdekler DAPI ile etiketlendi (Şekil 1C). Kontrol ve elektropore LAL kasları arasında merkezi çekirdeğe sahip liflerin yüzdesinde anlamlı bir fark bulunmamıştır (Şekil 1E).
Fasiyal sinirin arka kulak dalının ezilmesi LAL kasını6 denerve eder (Şekil 2A). Kontrol farelerinden ve sinir yaralanmasından 5 gün, 10 gün ve 60 gün sonra farelerden alınan LAL kasları, daha önce tarif edilen yöntemler kullanılarak disseke edildi, sabitlendi ve boyandı16,21. Kısaca, SV2 antikoru sinaptik vezikülleri işaretler ve tüm presinaptik alanı 6,16,22,23,24 ortaya çıkarmak için nörofilamentlere karşı 2H3 antikoru ile birlikte kullanılır. S100B antikoru Schwann hücrelerini boyamak için kullanılırken, α-BTX postsinaptik AChR'leri tespit etti. Konfokal mikroskopi görüntülemede sinir yaralanmasından 5 gün sonra tam NMJ denervasyonu görüldü (Şekil 2B). Postsinaptik alanlar, sinir hasarından 10 gün sonra reinnerve olmuş gibi görünmektedir (Şekil 2B). 60 gün sonra (Şekil 2B), yeniden üretilen NMJ'ler kontrol etmek için benzer bir fenotip gösterdi.
Son olarak, in vivo elektroporasyon ve fasiyal sinir ezilme protokollerinin kombine kullanımı test edildi. Bunun için LAL kasları tdTomato proteinini eksprese eden bir vektör ile elektropore edildi ve 3 gün sonra sinir yaralanması yapıldı. 9 gün sonra, LAL kası diseke edildi, sabitlendi ve NMJ pre- ve postsinaptik alanları ortaya çıkarmak için boyandı (Şekil 3A). Kas liflerinde tdTomato proteininin ekspresyonu, denerve edilmiş (yeşil ok ucu) ve reinnerve NMJ'ler (sarı oklar) ile birlikte gözlenebilir (Şekil 3B). Kantifikasyon, liflerin X.37 ± %4.63'ünün tdTomato ekspresyonu için pozitif olduğunu (Şekil 3C, sol çubuk), postsinaptik alanların G.00 ± .69'unun reinnerve olduğunu ortaya koydu (Şekil 3C, sağ çubuk).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg"> Şekil 1: LAL kaslarının etkili in vivo elektroporasyon aracılı gen transferi. tdTomato proteinini kodlayan bir plazmit, yetişkin farelerin in vivo elektroporasyonu ile LAL kaslarında eksprese edildi. DNA çözeltisi rLAL kas fasyasının altına enjekte edildi ve altın iğne tipi elektrotlar, 1 Hz'de (A) 20 ms süre ile 100 V /cm2'lik beş darbe vermek için kasın üzerine yerleştirildi. Tüm monte edilmiş kaslar elektroporasyondan 21 gün sonra diseke edildi ve α-BTX (beyaz) kullanılarak AChR için boyandı. rLAL kasında (B) tdTomato (kırmızı) eksprese eden elektroporasyonlu lifler gözlendi. rLAL kası enine kesit alındı ve kas zarı ve çekirdeklerini tespit etmek için sırasıyla WGA (sarı) ve DAPI (camgöbeği) (C) ile boyandı. Prosedürün etkinliği, WGA boyama (D) yoluyla toplam liflerden tdTomato eksprese eden liflerin (C'de kırmızı) yüzdesi olarak ölçüldü. Merkezi çekirdeklerin (ok uçları) oranı, kas lifi hasarı/rejenerasyonunun (E) bir parametresi olarak ölçüldü. İstatistikler, N'nin ortalama ± SEM'ini temsil eder: grup başına üç hayvan (kontrol ve elektroporasyonlu). Ölçek çubuğu = 1 mm (B), 50 μm (C). ns = anlamlı olmayan; t-testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg"> Şekil 2: Sinir ezilme yaralanması protokolü kullanılarak kısa süreli NMJ rejenerasyonu. Spesifik sinir ezilme yaralanması için, fasiyal sinirin arka kulak dalı (camgöbeği), bazı anatomik göstergeler tanımlanarak verimli bir şekilde açığa çıkarılabilir: posterior auriküler damar, digastrik kasın göbeği ve kıkırdaklı kulak kanalı (A). Yetişkin farelerden sinir ezilmesinden 5 gün, 10 gün ve 60 gün sonra kontrolden elde edilen veya diseke edilen LAL kas NMJ'lerinin temsili konfokal mikroskopi görüntüleri. NMJ'ler, motor aksonlar ve terminaller (sinaptik veziküller için SV2 artı nörofilamentler için 2H3; camgöbeği), Schwann hücreleri (anti-S100 B; sarı) ve AChR'ler (α-BTX; macenta) (B) etiketlenerek tanımlandı. Alt paneller motor aksonları (sol paneller) ve AChR (sağ paneller) kanallarını ayrı ayrı gösterir. Postsinaptik alanların konumunu sınırlamak ve innervasyon durumunu değerlendirmek için gri şekiller çizildi. Ölçek çubukları = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg"> Şekil 3: Kombine in vivo elektroporasyon ve sinir ezilme yaralanması protokolleri. LAL kası, tdTomato proteinini (kırmızı) kodlayan bir plazmid ile elektropore edildi. Fasiyal sinirin posterior auriküler dalı elektroporasyondan 3 gün sonra ezildi. 9 gün sonra, LAL kası diseke edildi (A) ve motor aksonlar ve terminaller (SV2 artı 2H3 antikorları, camgöbeği) ve AChR'ler (α-BTX; macenta) (B) etiketlenerek pre ve postsinaptik bileşenler tanımlandı. Bir denerve (yeşil ok ucu) ve yeniden sinirlenmiş bir NMJ (sarı ok) gösterilir. tdTomato protein ekspresyonu (sol çubuk) için pozitif liflerin oranının ve rejenere bir motor akson (sağ çubuk) (C) ile temas eden postsinaptik alanların oranının ölçülmesi. Sonuçlar, grup başına N: 3 farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

combined-vivo-electroporation-short-term-reinnervation-cranial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Levator auris longus (LAL) genç erişkin farelerin kas muskarinik sinyalizasyon inhibitörleri tekrarlanan yönetim ve wholemounts nöromüsküler kavşak sonraki immün (NMJs) için prosedürleri açıklar. LAL kas ifşa ettiği için benzersiz avantajları vardır.

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus&#39;un Triple-immün

Kraniofasial kıkırdaklar diğer dokuları ile yakın temas içinde gelişir ve canlı hayvan işlemek için zordur. Elektroporasyon erken embriyonik etkileri atlayarak kraniyofasiyal iskeletin büyüme sırasında moleküler araçlar sunmak için kullanıyor. Bu yaklaşım, aday moleküllerin etkin bir şekilde test etmek için bize izin...

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Koku ensheathing hücreleri (OECS), birincil koku nöronların büyümesine izin vermek nöral tepe hücreleri bulunmaktadır. Bu özel özellik, hücresel nakli için de kullanılabilir. Burada bir gırtlak sinir yaralanması modelinde OECS kullanımına göre hücre transplantasyonu bir model mevcut.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Masseter sinirin donör sinir olarak kullanılması, yüz felcinde çapraz fasiyal sinir grefti ve serbest kas transferinin kriter standart iki aşamalı prosedürüne tek aşamalı bir alternatifi temsil eder. Bu tekniği gracilis kas transferi ile güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz ve endikasyonları ve sınırlamaları tartışıyoruz.

Ücretsiz Fonksiyonel kas transferi ile geri dönüşümsüz Yüz felci içinde Smile Tek aşamalı Dinamik Reanimasyon

Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

Koklear implant hayvan modelleri elektrik stimülasyonu ile kalıcı sensorinöral işitme kaybı tedavisinde teknolojik üsler bilgisine ilerletebilirsiniz. Bu çalışmada akut sağır edici ve fareler hem de işlevsel değerlendirme İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ile bir elektrot dizinin koklear implantasyon için cerrahi bir Protokolü sunar.

Koklear Implant ameliyatı ve elektriksel olarak uyarılmış işitsel beyin sapı yanıt kayıtları C57BL/6 farelerde

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Bu protokol, sıçan modelinde yüz sinir cerrahisi için tekrarlanabilir bir yaklaşım açıklar, yaralanma çeşitli indükleyici desenlerin açıklamaları da dahil olmak üzere.

Aksonal İnhibisyon ve Rejenerasyon Çalışması için Sıçan Modelinde Yüz Sinir Cerrahisi

Burada uyarılmış ve spontan elektromiyografik potansiyellerin in vivo kronolojik kayıt için implante edilebilir bir sistemin üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Sistem sinir yaralanması sonrasında laringeal kasların reinnervasyon araştırılması için uygulanır.

Vivo Elektromiyografide Kronik İçin İmplante Edilebilir Bir Sistem

Hacimsel kas kaybı (VML) yaralanmaları endojen rejeneratif yeteneği aşarak kalıcı fonksiyonel eksikliklere neden olur. Mevcut VML araştırması öncelikle uzuv ve gövde kaslarına odaklanmaktadır. VML'nin mekanik çalışmalarını kraniyofasiyal kaslara genişletmek için, bu makale, VML hasarı öncesi ve sonrası masseter kas fonksiyonunun uzunlamasına değerlendirilmesi için in vivo bir yöntemi açıklamaktadır.

Hacimsel Kas Kaybı (VML) Yaralanmasının Cerrahi Olarak Oluşturulmasını Takiben Sıçan Masseter Kasının İn vivo Fonksiyonel Değerlendirmesi

Keşfedin in vivo elektroporasyon ve kısa süreli reinnervasyon yöntemleriyle kranial levator auris longus kasında sinir-kas kavşağı rejenerasyon mekanizmalarını. Bu protokol, kas kaynaklı proteinlerin postsinaptik asetilkolin reseptörlerinin stabilizasyonundaki rollerini araştırmak için kullanılır.

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

Daha fazla video keşfet