Name: Naegleria gruberi rDNAnın Moleküler Klonunun N. gruberi Trophozoitese Transfeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Keşfedin Naegleria gruberi trofozoitlerinde CERE tabanlı transfeksiyon protokolünü. Bu yöntem, çoklu pasajlarda stabil DNA tutulumu sağlayarak evrimsel biyoloji ve hücre biyolojisi araştırmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmalar kısmen Creighton Üniversitesi (KMD) George F. Haddix Fonu'ndan alınan bir hibe ile finanse edildi. Şekil 1 biorender.com'da oluşturulur ve Şekil 3 benchling.com'da oluşturulur.

Bu çalışmada kullanılan türlerin, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 17.004 baz çifti pGRUB yapısının dizisi Ek Dosya 1'de verilmiştir.
1. Trofozoitlerin kültürlenmesi
<ol><li>Dondurulmuş N. gruberi trofozoitlerini 37 ° C'de 3 dakika boyunca çözdürün.</li>
	<li>%10 fetal buzağı serumu (PYNFH) ortamı artı %2 tampon (disodyum fosfat, potasyum dihidrojen fosfat) ile modifiye pepton / maya özütü / nükleik asit / folik asit / hemin içinde T25 şişelerine trofozoitleri aşılayın.</li>
	<li>Trofozoitleri 25 ° C'de, amip morfolojisi sergiledikleri ~% 80 birleşene kadar kültürleyin (Şekil 2A). NOT: Başlangıçta bir trofozoit kültürünü donmuş hallerinden canlandırırken, bir T25'in birleşmesi 5-7 gün kadar sürebilir. Ortamı her 3-4 günde bir boşaltın ve yeni ortamla değiştirin.</li>
	<li>Yapışan trofozoitleri plastikten çıkarmak için birleşik şişeleri 5-10 dakika buz üzerine yerleştirin. Kalan yapışkan hücreleri çıkarmak için şişeyi hafifçe döndürün. Trofozoitler artık 'yuvarlatılmış' bir morfolojiye sahiptir (Şekil 2B).</li>
	<li>Kültürleri 1:2 ila 1:4 oranında yeni doku kültürü şişelerine bölün.</li>
	<li>PYNFH'yi çıkarın ve steril kistment ortamı (120 mM sodyum klorür, 0.03 mM magnezyum klorür, 1 mM disodyum fosfat, 1 mM potasyum dihidrojen fosfat, 0.03 mM kalsiyum klorür, 0.02 mM demir klorür, pH 6.8)22 ile değiştirin. NOT: Trofozoitlerin çoğu 72 saat içinde kistlenir (Şekil 2C). Eksistleme 72 saat içinde tamamlanmalıdır.</li>
	<li>Kistleri şişelerden çıkarın, 20 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri çıkarmak için% 10 fetal baldır serumu ile PYNFH ortamındaki kistleri yeniden askıya alın. Trofozoitler çıkmaya başlayana kadar 25 ° C'de 24 saat inkübe edin.</li>
</ol>2. Trofozoitlerin transfekte edilmesi
<ol><li>Trofozoitleri 6 oyuklu düz tabanlı bir doku kültürü plakasına (1 mL 1 x 106 trofozoit / mL) yerleştirin ve 25 ° C'de kültürleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 70 -% 80 birleşime ulaştıklarında (~ 10.4 x 104 hücre / cm2 6 oyuklu kümelerde) transfekte edin. Kullanmadan önce transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığına ısıtın.</li>
	<li>Plazmid-transfeksiyon reaktif karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın: FBS'siz 200 μL PYNFH ortamında 75 ng plazmit DNA ve 0.225 μL transfeksiyon reaktifi. Transfeksiyonu çift olarak gerçekleştirmek için yeterli plazmid-transfeksiyon reaktif karışımı hazırlayın. NOT: Bu çalışmada N. gruberi CERE'nin (pGRUB) tam uzunlukta bir klonunu içeren bir bakteri plazmidi kullanılmıştır. Negatif kontrol olarak boş plazmit (pGEM) kullanıldı (Şekil 3).</li>
	<li>Plazmid-transfeksiyon reaktif karışımını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Transfeksiyondan hemen önce trofozoit tek tabakalarından ~ 800 μL ortamı çıkarın.</li>
	<li>Plazmid-transfeksiyon reaktif karışımını trofozoitlerin üzerine koyun.</li>
	<li>Ortamın plakanın kenarlarında birikmesini önlemek için plakayı her 15 dakikada bir hafifçe döndürün.</li>
	<li>Tek katmanları 25 ° C'de 1 saat inkübe ettikten sonra 2 mL büyüme ortamı ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Kalıntı plazmit DNA'yı çıkarmak için tek katmanları 1 mL 10x DNaz tamponunda 10 U DNaz ile 37 ° C'de 15 dakika muamele edin, bir kez büyüme ortamı ile yıkayın, 2 mL taze ortam ekleyin ve 25 ° C'ye yerleştirin. Plakayı 24-36 saat inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri serbest bırakmak için plakayı 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Bir kuyuyu (1:2) iki yeni kuyuya bölün.</li>
	<li>Deneysel amaçlar için kalan kuyulardan trofozoitleri toplayın. NOT: Tüm kültürler çift olarak gerçekleştirilir. Her koşul için 1 kuyu geçiş, 1 kuyu ise CERE izolasyonu için kullanılır.</li>
</ol>3. CERE'yi Naegleria'dan izole etmek
<ol><li>Tripan mavisi dışlama boyaması ve bir hemositometre23 ile CERE izolasyonu için kullanılan her kuyucuktaki trofozoit sayısını hesaplayın.</li>
	<li>Trofozoitleri 2.0 mL'lik bir tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Trofozoitleri santrifüjleme (600 x g, 10 dakika, 4 °C) ile 100 mM sodyum klorürde (pH 7.5) bir kez yıkayın. NOT: Sodyum klorür, trofozoitlerin tüpün kenarlarına yapışmasını önler.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL 100 mM EDTA'da (pH 7.5) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri parçalamak ve trofozoitlerdeki enzimleri etkisiz hale getirmek için tüpü 98 ° C'de 15 dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin. NOT: Bu adım, Naegleria trofozoitlerinde bol miktarda bulunan DNazları inaktive eder. DNazlar, 4. adımda doğal CERE'yi ve moleküler klonu tespit etme yeteneğini etkileyebilir. Adım 3.4'te ~ 3 x 106'dan fazla hücre kullanıldığında DNA verimi azalır.</li>
	<li>Kalıntıları peletlemek için tüpleri 4 °C'de en yüksek hızda (16.000 x g) 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanları yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Etanol, süpernatanları taşıyıcı olarak 0.5 hacim 7.5 M amonyum asetat (pH 7.5), 3 hacim mutlak etanol ve 1 μL 10 mg/mL glikojen ile çökeltir.</li>
	<li>Tüpü birkaç kez ters çevirin ve tüpü en az 1 saat veya gece boyunca -80 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Numuneleri oda sıcaklığına ısıtın.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında 16.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve peleti 16.000 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleme ile %70 etanol ile yıkayın.</li>
	<li>Etanolü çıkarın ve peleti 5 dakika havayla kurutun.</li>
	<li>Kurutulmuş peleti steril deiyonize (DI) suda tekrar süspanse edin. Hacmi μL başına 10.000 trofozoite normalleştirin.</li>
	<li>PCR'de kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. Transforme trofozoitlerin PCR tespiti
<ol><li>20.000 hücre eşdeğeri DNA, 600 nM primer (Tablo 1) ve Taq polimeraz kullanın ve PCR24'ü gerçekleştirin. NOT: Yerel CERE ile klonlanmış CERE arasında ayrım yapan primerler, PCR koşulları gibi Tablo 1'de listelenmiştir. Şekil 3 , astarların yapılar üzerindeki konumunu göstermektedir. PCR, kullanılan primerlere ve kullanılan spesifik PCR karışımına bağlı olarak optimizasyon gerektirecektir.</li>
	<li>agaroz çözülene kadar 1x Tris bazı, asetik asit ve EDTA (TAE) tamponunda mikrodalga% 0.8 agaroz.</li>
	<li>Agarozu oda sıcaklığında ~50 °C'ye soğutun.</li>
	<li>Çözeltiyi, kuyular oluşturmak için bir tarak içeren bir jel döküm tepsisine dökün.</li>
	<li>Jeli katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin.</li>
	<li>Jeli elektroforez aparatına yerleştirin.</li>
	<li>Jel kaplanana kadar 1x TAE'yi elektroforez odasına boşaltın.</li>
	<li>Tarağı çıkarın.</li>
	<li>Numunelere 6x yükleme boyası (%0.25 bromphenol mavisi, %0.25 ksilen siyanol, %30 gliserol) ekleyin ve jeli yükleyin. PCR ürününün boyutunu belirlemek için bir DNA merdiveni kullanın.</li>
	<li>Elektrodu takın, güç kaynağını açın ve jeli ~ 1.5-2 saat boyunca 80 V'ta çalıştırın.</li>
	<li>Gücü kapatın ve jeli çıkarın.</li>
	<li>Jeli DNA boyası ile boyayın (ör., 10 μL 10 mg / mL etidyum bromür) 100 mL DI suda 10 dakika.</li>
	<li>Jeli DI suda 20 dakika boyunca lekesiz hale getirin.</li>
	<li>Jeli ultraviyole (UV) ışık sisteminde görselleştirin ve sonuçları belgeleyin.</li>
</ol>

Naegleria gruberi trofozoitlerinin transfeksiyonu için CERE tabanlı bir vektör kullanma

<ol><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+we+know+by+now+about+the+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">What do we know by now about the genus Naegleria.</a> Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Protozool%22%5BJournal%5D)">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li>
<li>Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+Naegleria+gruberi%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in Naegleria gruberi.</a> Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).</li>
<li>Grace, E., Asbill, S., Virga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%3A+Pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22AAC%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options.</a> AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).</li>
<li>Moseman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Battling+brain-eating+amoeba%3A+enigmas+surrounding+immunity+to+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri.</a> PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).</li>
<li>Marciano-Cabral, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of Naegleria spp.</a> Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).</li>
<li>Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri.</a> Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).</li>
<li>Zysset-Burri, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+pathogenicity+factors+of+the+free-living+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri.</a> BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).</li>
<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Naegleria+lovaniensis%2C+the+basis+for+a+comparative+approach+to+unravel+pathogenicity+factors+of+the+human+pathogenic+amoeba+N.+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri.</a> BMC Genom. 19, 654-665 (2018).</li>
<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+improves+the+draft+genome+of+the+human+pathogenic+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri.</a> Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).</li>
<li>Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Naegleria+genome%3A+A+free-living+microbial+eukaryote+lends+unique+insights+into+core+eukaryotic+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology.</a> Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+genes+of+Naegleria+gruberi+are+carried+exclusively+on+a+14-kilobase-pair+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid.</a> Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+ribosomal+RNA+genes+are+a+general+feature+of+schizopyrenid+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae.</a> J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).</li>
<li>Dao, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identify+origin+of+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+two-step+feature+selection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique.</a> Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).</li>
<li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+gruberi+strain+EGB+ribosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA.</a> Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).</li>
<li>Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Naegleria+fowleri+%28strain+LEE%29+closed+circular+extrachromosomal+ribosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element.</a> Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extrachromosomal+elements+of+the+Naegleria+amoebae%3A+How+little+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know.</a> Plasmid. 115, 102567(2021).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+australiensis+De+Jonckheere+%28strain+PP+397%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397).</a> Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+jadini+Willaert+and+Ray+%28Strain+ITMAP400%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400).</a> Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+pringsheimi+De+Jonckheere+%28strain+Singh%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh).</a> Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).</li>
<li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+single+origin+of+replication+in+the+Naegleria+gruberi+extrachromosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element.</a> Protist. 170, 141-152 (2019).</li>
<li>Sohn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+liquid+media+for+encystation+of+pathogenic+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae.</a> Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jeong, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+nfa1+gene+cloned+from+pathogenic+Naegleria+fowleri+in+non-pathogenic+N.+gruberi+enhances+cytotoxicity+against+CHO+target+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro.</a> Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+evolutionary+divergence+in+the+genus+Naegleria+by+analysis+of+ribosomal+DNA+plasmid+restriction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns.</a> Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variation+in+the+ribosomal+internal+transcribed+spacers%2C+including+the+5.8S+rDNA%2C+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp.</a> Protist. 149 (3), 221-228 (1998).</li>
<li>Rawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+prediction+of+G4+DNA+as+regulatory+motifs%3A+Role+in+Escherichia+coli+global+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation.</a> Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).</li>
<li>Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuadBase%3A+Genome-wide+database+of+G4+DNA+-+occurrence+and+conservation+in+human%2C+chimpanzee%2C+mouse+and+rat+promoters+and+146+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes.</a> Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).</li>
</ol>

Herhangi bir finansal çıkar çatışması ilan edilmedi.

Burada özetlenen protokol çok basittir, ancak her yapı, yapının doğasına ve kullanılan Naegleria türüne bağlı olarak, özellikle DNA-transfeksiyon reaktif oranının bir dereceye kadar optimizasyonu gerektirecektir. Bu protokolü kullanarak ticari olarak temin edilebilen yalnızca bir transfeksiyon reaktifini test ettik, ancak diğer birkaçının da etkili olması muhtemeldir. CERE'nin tam uzunlukta bir klonunun kullanıldığı, işlevsel bir replikasyon kaynağı içerdiği ve böylece otonom olarak replike edildiği göz önüne alındığında, yapı gerekli tüm ökaryotik replikasyon mekanizmasına sahiptir. pGEM vektörüne kısmi bir klon eklenecek olsaydı, boş pGEM vektörüne benzer şekilde fonksiyonel bir ökaryotik replikasyon kökeni içermiyorsa, transfekte edilen klonun transfeksiyondan çok kısa bir süre sonra kaybolacağı tahmin edilirdi (Şekil 2B). Ayrıca, bu veriler, prokaryotik DNA'nın varlığının, moleküler klonun trofozoit tarafından tutulma kabiliyetine müdahale etmediğini göstermektedir.
N. gruberi trofozoitleri25'in transfeksiyonunun bildirilmiş bir örneği olmasına rağmen, bu çalışmada kullanılan insert, önceki çalışmada transfekte edilenden (<1 kbp) önemli ölçüde daha büyüktür (~ 17 kbp). Naegleria tarafından tolere edilebilecek maksimum boyut plazmidinin ne olduğu bilinmemekle birlikte, laboratuvarımızdan elde edilen yayınlanmamış veriler, başka bir cinsin (Willaertia) amebae'sinin yaklaşık 24 kbp boyutunda CERE içerdiğini belirlemiştir.
Bu protokolün trofozoit içindeki DNA'yı tespit etmesini sağlamanın önemli bir adımı, artık DNA'nın (yani transfekte edilmemiş DNA'nın) kültürlerden elimine edilmesini sağlayan DNaz tedavi adımıdır (adım 2.9). Protokolün bütünlüğünü sağlamak için birkaç kalite kontrol prosedürü gerçekleştirildi. İlk olarak, yapılar sıralandı. İkinci olarak, PCR ürünleri de kimliklerini doğrulamak ve tahlilde herhangi bir kontaminasyon olmadığından emin olmak için sıralandı ve PCR ürünlerinin yanlış astarlamanın sonucu olmadığı doğrulandı.
Ökaryotik replikasyon kökenli bir plazmitin başarılı bir şekilde transfeksiyonu gösterilmiş olsa da, Şekil 4'ten , trofozoitlerin ilk geçişini takiben PCR sinyalinde bir azalma olduğu açıktır. qPCR, zaman içinde transfekte edilmiş trofozoitler üzerinde gerçekleştirildi ve pGRUB seviyesinin 1. pasajda yaklaşık 1.600 kopyadan 7. pasajda 35'e düştüğü belirlendi (veriler gösterilmemiştir), bu da transfekte edilen plazmitin muhtemelen sonraki birkaç pasaj içinde kaybolacağını gösterir. Bu beklenmedik bir durum değildir, çünkü transfekte edilen plazmit trofozoitlere yabancıdır ve amipin hayatta kalması için gereksiz veya zararlı olarak görülecektir.
Naegleria'nın CERE'si ile ilgili temel bir bilgi eksikliği var. GenBank'taki CERE dizilerinin çoğunluğu kısmi dizilerdir ve ana odak noktası, cinsi (ITS1) ve türleri (ITS2) tanımlamak için kullanılan rDNA ve dahili kopyalanmış aralayıcı (ITS) bölgeleridir1,26,27. rDNA alt birimlerinin dizisi Naegleria sp. arasında yüksek oranda korunurken, Naegleria sp.'nin NRS'si. yaklaşık 5.5 kbp ile 10 kbp arasında değişen hem boyut hem de sıra olarak büyük ölçüde değişir 1,15,16,17,18,19,20. NRS'nin Naegleria'daki işlevi büyük ölçüde keşfedilmemiş bir bölgedir, ancak bir çoğaltma kaynağı, bir promotör ve bir sonlandırma dizisi17 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere düzenleyici unsurlar içerdiği varsayılmaktadır. GenBank'taki tam CERE dizilerine dayanarak, Naegleria CERE'nin ortak bir özelliği, NRS'de A-T açısından zengin tekrar bölgelerinin varlığıdır. Bu bölgelerin işlevi şu anda bilinmemektedir.
Naegleria trofozoitlerini transfekte etme yeteneği, CERE NRS biyolojisinin çeşitli yönlerinin, özellikle de CERE replikasyonunun dinamikleri ve gereksinimlerinin incelenmesine izin verir. Escherichia coli'de, bazı genlerin28 promotör bölgelerinde G-dörtlüleri tanımlanmıştır. Fareler, sıçanlar, insanlar ve insan olmayan primatlar dahil olmak üzere çok çeşitli ökaryotların destekleyicilerinde G-dörtlü yapılar da tanımlanmıştır29. Birkaç farklı tam uzunlukta CERE dizisinin in silico analizi, NRS'nin çoklu alanlarının G-dörtlü yapılar oluşturacağının tahmin edildiğini göstermektedir. Birkaç Naegleria sp.'nin NRS'sinde tahmin edilen G dörtlü yapılarının bir alanı.18S geninin başlangıcının yukarısındadır. Trofozoitleri transfekte etme yeteneği, rDNA'nın yukarı akışındaki dizileri silerek/mutasyona uğratarak, Naegleria'nın CERE'sindeki rDNA'nın promotör bölgesinin tanımlanmasının araştırılmasına izin verecektir. Benzer şekilde, rDNA transkripsiyonunu sonlandıran dizileri tanımlamak için benzer çalışmalar yapılabilir.
Tam uzunluktaki CERE'nin trofozoitlerde bir dizi pasaj boyunca tutulması, CERE'nin replikasyonu için gerekli olan NRS'nin minimal alanını belirlemeye odaklanan çalışmalara izin verecektir. CERE'nin bir bölgesi, replikasyon20'nin varsayılan kaynağı olarak tanımlanmış olsa da, CERE replikasyonu için bölge dışındaki ikincil yapıların gerekli olup olmadığı veya bölgenin önemli ölçüde kesilip kesilemeyeceği ve ori'nin işlevsel kalıp kalmayacağı bilinmemektedir. NRS'deki tekrarlayan elementler, 15,16,17,18,19,20 yılına kadar sıralanmış tüm Naegleria sp.'de bulunur. Bu dizilerin amacı şu anda bilinmemektedir. Düzenleyici bir unsur olarak var olup olmadıkları veya silinip silinmedikleri konusunda CERE'nin trofozoitlerde çoğalıp çoğalmayacağı hala bilinmemektedir. Tekrarlayan diziler Naegleria'da türe özgüdür, ancak bir türden gelen dizilerin başka bir türde işlev görüp göremeyeceğinin bilinmemektedir. Kısacası, CERE biyolojisi ile ilgili olarak artık burada açıklanan teknik kullanılarak ele alınabilecek sayısız soru var.

Naegleria cinsi 45'ten fazla tür içerir, ancak türün tüm üyelerinin tanımlanmış olması olası değildir1. Naegleria farklı şekillerde bulunabilir: trofozoitler (amipler), kamçılılar olarak veya kaynaklar ciddi şekilde sınırlı olduğunda, kistler 1,2,3,4 olarak. Naegleria cinsi, neredeyse evrensel olarak ölümcül primer amipli meningoensefalitin nedeni olan 'beyin yiyen amip' (1,2,3,4,5,6,7'de gözden geçirilmiştir) olarak bilinen, özellikle tehlikeli bir türü olan Naegleria fowleri ile tanınır.
Naegleria, rDNA'larını nükleolde bulunan CERE üzerinde kodlar. Üç Naegleria türünün genomunun tam dizilimi, nükleer genomda rDNA'nın olmadığını doğrular 8,9,10,11. Sınırlı tam uzunluktaki CERE dizilerine bağlı olarak, CERE'nin uzunluğu yaklaşık 10 kbp ile 18 kbp arasında değişir. Naegleria'nın her türünün CERE'si, hücre başına yaklaşık 4.000 CERE'nin her birinde tek bir rDNA sistronu (5.8, 18 ve 28S ribozomal DNA içeren) taşır 12,13,14. rDNA dışında, her CERE'nin büyük bir rDNA olmayan dizisi (NRS) vardır. CERE büyüklükleri türler arasında farklılık gösterir; rDNA dizileri 1,15,16,17,18,19,20 cinsi boyunca yüksek oranda korunduğundan, farklılıklar esas olarak NRS'nin değişen uzunluğundan kaynaklanmaktadır. N. gruberi CERE NRS21 içindeki tek bir DNA replikasyon orijininin haritalanması, Naegleria CERE'nin nükleer genomdan bağımsız olarak çoğaldığı hipotezi için güçlü bir destek sağlar.
N. grubir, genellikle Naegleria biyolojisini incelemek için kullanılan patojenik olmayan bir amiptir. Naegleria amoebae'nin trofozoitler içinde CERE'yi tolere ettiği ve bağımsız olarak kopyaladığı hipotezini test etmek için N. gruberi trofozoitlerini aynı türden bir CERE klonu ile dönüştürmek için bir metodoloji geliştirdik. Bu, N. gruberi'nin tam uzunlukta bir klonu olan N. gruberi CERE'nin trofozoitlere dönüştürülmesi ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile donör CERE klonunun kaderinin takip edilmesiyle gerçekleştirildi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir. Burada sunulan veriler, donör klonunun doku kültüründe en az yedi pasaj yoluyla tespit edilebileceğini ve ayrıca kistleme ve eksistleme yoluyla korunabileceğini göstermektedir. Bu çalışmalar, CERE'nin nasıl çoğaldığını incelemek ve Naegleria'yı transfekte etmek için bir vektör olarak kullanımını araştırmak için bir araç için temel oluşturur.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Kırılmış buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kültür Şişeleri, T-75</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Kültür Plakası, 6 kuyulu</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>Elektroferez Jel Aparatı</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, %100</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Folik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Artı Merdiven</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Yeşil PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Bloğu</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Demir Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>Ligaz</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Magneisum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>Nükleik Asit</td><td>Kimyasal Impex Int' l</td> <td># 01625</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Elektrofaz Güç</td><td>Kaynağı Ünitesi Bio Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>MCB Reaktifleri</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat, dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Santrifüj</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, baz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi, %0.4</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>Tartı Kantarı</td><td>Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

naegleria gruberi rdna'nın moleküler klonunun n. gruberi trophozoites'e transfeksiyonu

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

Naegleria trophozoitlerin tüm ribozomal genleri, element (CERE) içeren kapalı dairesel bir kromozomal ekstrakromozomal DNA'da (rDNA) tutulur. CERE hakkında çok az şey bilinmesine rağmen, üç Naegleria türünün tam bir genom dizisi analizi, nükleer genomda rDNA sistronları olmadığını açıkça göstermektedir. Ayrıca, N. gruberi CERE'de replikasyonun tek bir DNA kökeni haritalanmıştır ve bu da CERE'nin nükleer genomdan bağımsız olarak replikasyon yaptığı hipotezini desteklemektedir. Bu CERE özelliği, Naegleria trofozoitlerine yabancı proteinler eklemek için tasarlanmış CERE'nin kullanılmasının mümkün olabileceğini düşündürmektedir. Naegleria'da bir CERE'nin bir vektör olarak kullanımını keşfetmenin ilk adımı olarak, N. gruberi'yi pGEM7zf+'ya (pGRUB) klonlanmış N. gruberi CERE'nin moleküler bir klonu ile transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Transfeksiyonu takiben, pGRUB, N. gruberi trofozoitlerinde en az yedi pasajın yanı sıra kistment ve eksistleme yoluyla kolayca tespit edildi. Bir kontrol olarak, trofozoitler, N. gruberi dizileri (pGEM) olmadan omurga vektörü pGEM7zf+ ile transfekte edildi. pGEM, N. gruberi'ye transfeksiyonu takip eden ilk geçişten sonra tespit edilmedi, bu da ökaryotik bir organizmada çoğalamadığını gösteriyor. Bu çalışmalar, Naegleria trofozoitleri için bir transfeksiyon protokolünü tanımlar ve pGRUB'daki bakteriyel plazmit dizisinin, transfekte edilmiş CERE klonunun başarılı transfeksiyonunu ve replikasyonunu inhibe etmediğini gösterir. Ayrıca, bu transfeksiyon protokolü, trofozoitlerde replikasyonunu yönlendiren CERE'nin minimal dizisini anlamanın yanı sıra ribozomal olmayan dizideki (NRS) düzenleyici bölgeleri tanımlamada kritik öneme sahip olacaktır.

pGRUB ile transfekte edilen trofozoitlerin PCR'si, transfekte edilen CERE'nin trofozoitlerin en az yedi pasajının yanı sıra kistment ve eksistment yoluyla tespit edildiğini göstermektedir (Şekil 4). PCR'de kullanılan primerler hem pGEM vektörüne hem de CERE dizisine tavlanır, böylece PCR'nin doğal CERE'yi tespit etmemesini sağlar. pGEM'in trofozoitlere transfeksiyonunu takiben PCR, pGEM'in negatif olduğunu gösterdi (Şekil 4), bu da boş plazmitin amipler tarafından tutulmadığını gösterdi. Şekil 4 , pGEM'in ilk pasajda kaybolduğunu göstermektedir - sonraki pasajlar, encystment ve excystment'ın tümü negatifti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg"> Şekil 1: Transfeksiyon prosedürünün akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg"> Şekil 2: Kültürde N. gruberi (NEG-M suşu) trofozoitleri. (A) 25 ° C'deki standart kültür koşulları altında, N. gruberi trofozoitleri morfolojik olarak ameboiddir ve kültür şişelerine / plakalarına yapışıktır. Ok, trofozoiti yönlü olarak itmek için kullanılan bir psödopodu gösterir. (B) N. gruberi kültürünün buz üzerinde inkübe edilmesinden sonra, trofozoitler morfolojik olarak yuvarlak hale gelir ve yapışmaz. (C) Kistment ortamında 24-48 saat inkübasyondan sonra, N. gruberi trofozoitleri kistlenir. Ölçek çubukları: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg"> Şekil 3: N. gruberi'yi (NEG-M) transfekte etmek için kullanılan pGRUB yapısı. N. gruberi'nin tam uzunluktaki CERE'si (EBM suşu, 14.007 bp; kırmızı) pGEM7Zf(+) (2.997 bp; yeşil) olarak klonlandı ve 17.004 bp'lik bir yapı elde edildi. Her plazmit üzerindeki oklar, PCR primerlerinin yerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg"> Şekil 4: N. gruberi trofozoitlerine transfekte pGRUB ve pGEM'i tespit eden PCR sonuçları. PCR, pGRUB'un transfekte edilmiş trofozoitlerde en az yedi pasaj, kistment (En) ve eksistment (Ex) yoluyla tespit edildiğini göstermektedir. pGEM, trofozoitlerin ilk geçişinden sonra kaybolur. P1 = geçit 1, P7 = geçit 7. Negatif kontroller (neg) PCR'de DNA almadı, pozitif kontroller (pos) ise PCR'ye pGRUB veya pGEM girdisidir. Beklenen ürün boyutları 656 bp (pGRUB) ve 337 bp'dir (pGEM). Panel A'nın solundaki şekiller, DNA merdiveninin en parlak bantlarının boyutunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Astar Adı</td>
			<td colspan="2">Sıra - 5'-&gt;3'</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Ürün boyutu</td>
		</tr><tr><td>pGEM-ileri</td>
			<td colspan="2">CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td>
			<td>54</td>
			<td>337 bp</td>
		</tr><tr><td>pGEM-ters</td>
			<td colspan="2">TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td>
			<td></td>
			<td>337 bp</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-ileri</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td>
			<td>60.5</td>
			<td>656 beygir</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-ters</td>
			<td colspan="2">TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td>
			<td></td>
			<td>656 beygir</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Bu çalışmalarda kullanılan PCR primerleri ve koşulları.
Ek Dosya 1: 17,004 baz çifti pGRUB yapısının dizisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, Naegleria gruberi trofozoitlerini, trofozoitlerin in vitro olarak geçirilmesi boyunca ve ayrıca kistleme ve kistleme yoluyla sürdürülen bir yapı ile transfekte etmek için bir metodolojiyi tanımlar.

Naegleria gruberi rDNA'nın Moleküler Klonunun N. gruberi Trophozoites'e Transfeksiyonu

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Biz, GFP ifade eden ve tam olarak bulaşıcı olan Maedi-visna virüs bir moleküler klon tanımlamak. Bu virüs çoğaltma floresan mikroskopisi ve akış sitometrisi ile tespit edilebilir.

Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama

Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

GL261 glioma hücreleri, glioblastomun yararlı bir immünokompetan hayvan modelini sağlar. Bu protokolün amaçları, in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak intrakraniyal tümör büyümesini izlemek için uygun teknikleri göstermek ve glioblastom tedavisi için tümör immünolojisi ve immünoterapötik yaklaşımları incelemek için lusiferaz ile modifiye edilmiş GL261 hücrelerinin faydasını doğrulamaktır.

Glioblastoma&#39;nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Keşfedin Naegleria gruberi trofozoitlerinde CERE tabanlı transfeksiyon protokolünü. Bu yöntem, çoklu pasajlarda stabil DNA tutulumu sağlayarak evrimsel biyoloji ve hücre biyolojisi araştırmaları için temel oluşturur.

Naegleria gruberi rDNA'nın Moleküler Klonunun N. gruberi Trophozoites'e Transfeksiyonu

Daha fazla video keşfet