Name: Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin, ışık levha mikroskobu ile erken zebra balığı embriyolarını canlı görüntüleme ve hücresel çözünürlükte analiz etme yöntemlerini. Bu teknik, gelişim biyolojisinde simetri oluşumunu incelemek için fotoblokajı azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Embriyoları için Rafine Multiview Işık Tabakası Mikroskobu Protokolü

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Sürümü: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>Lateks boncuklar, karboksilat ile modifiye polistiren, floresan kırmızısı, 0.5 & mu; m ortalama partikül boyutu, sulu süspansiyon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon kiti</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>H2A-mCherry plazmidinin in vitro transkripsiyonu için</td></tr><tr><td>Potasyum Chhloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Kılıf AWG 15L - 1,58 mm İç Çap x 0,15 mm Duvar +/- 0,05&nbsp;</td><td>Floroplastiklerde Adtech Yenilikleri</td><td>STW15</td><td>PTFE tüpler</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik Temizleyici</td><td>Labman</td><td>LMUC3</td><td>Ultrasonicator</td></tr><tr><td>Zeiss LightSheet 7 Sistemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erken zebra balığı embriyoları için işık levha mikroskobu görüntüleme ve montaj stratejileri

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Numuneyi hassas bir şekilde yönlendirmek, bir mikroskopi kurulumunu verimli bir şekilde kullanmanın hayati bir parçasıdır. Bununla birlikte, numunelerin bir tüpte hazırlanması gerekliliği göz önüne alındığında, çok görüntülü bir ışık tabakası sistemi kullanılırken numunelerin manuel olarak yönlendirilmesi genellikle mümkün değildir. Bu nedenle, embriyoların koryon içinde aldığı stereotipik pozisyonlar olup olmadığını kontrol etmek için, zebra balığı embriyoları p epibolide (döllenmeden yaklaşık 7 saat sonra (hpf)) görüntülendi, çünkü gastrulasyondan erken somit aşamalarına kadar hızlandırılmış görüntüleme bu çalışmanın odak noktasıydı. Numuneler% 70 epibolide görüntülemeden hemen önce hazırlandığında, embriyolar numuneler arasında sıklıkla gözlenen spesifik bir yönelim göstermedi. Bu genellikle istenen bir durum olmadığından, örnekler gastrulasyondan çok önce hazırlandı ve görüntülemenin başlangıcına kadar uygun sıcaklıkta mikrosantrifüj tüplerinde saklandı. Bu koşullar altında,% 70 epibolide (N = 3; n = 87 embriyo), embriyo yönelimleri şu şekilde sınıflandırılabilir: (1) Embriyonun hayvan-bitkisel (AV) ekseni polimer tüpün uzun eksenine dik olduğunda yatay, (2) AV ekseni polimer tüpün uzun eksenine paralel olduğunda dikey ve, (3) Eğik, AV ekseni dar bir açıda olduğunda (Şekil 3A). Yatay konum en az temsil edilirken, dikey ve eğik konumlar eşit olarak gözlendi (Şekil 4).
Embriyolar tüplerde bırakıldığında, embriyolar% 90 epiboliye kadar bu ilgili pozisyonlarda stabildi, daha sonra çoğu embriyo yönelimlerini değiştirdi. Bu nedenle, değişen yönelimleri hesaba katmak için embriyogenezin tomurcuk aşamasında (yaklaşık 10 hpf) ikinci bir yönelim dokümantasyonu turu gerekliydi. Bu, bağımsız olarak hazırlanmış numuneler için gerçekleştirildi. Erken somit evrelerinin görüntülenmesi için, daha önce, polimer tüpün uzun eksenine ortogonal notokordlu bir embriyonun, eksen15 boyunca oluşan çoklu bilateral somitlerin görüntülenmesine izin verdiği için ideal yönelim olduğu bildirilmişti. Örnekler gastrulasyondan önce hazırlandığında (N = 3, n = 93 embriyo), embriyoların yaklaşık% 25'i bu yönelimi sergiledi (Şekil 4) ve bu embriyolar, önceki raporlarla tutarlı olarak en az 8 somit aşamasına kadar bu yönelimde sabit kaldı15. Embriyoların geri kalanı tomurcuk aşamasında çeşitli başka yönelimler sergiledi ( Şekil 3B ve Şekil 4'te sınıflandırılmıştır); Bununla birlikte, birçoğu erken somit oluşumu sırasında yatay konuma yeniden yönlendirildi. İlginç bir şekilde, embriyoların benzer bir yüzdesi, numunenin gastrulasyondan önce, p epibolide veya tomurcuk aşamasından hemen önce hazırlanıp hazırlanmadığına bakılmaksızın tomurcuk aşamasında yatay bir yönelim sergiledi. Bu nedenle, numune hazırlama zamanlaması, p epibolide görüntüleme için gözlemlenenin aksine, somit aşamalarının görüntülenmesi için ilgilenilen yatay yönelim için daha az kritik görünmektedir.
Çoklu görüntüleme sisteminin avantajı, aynı numuneyi birden fazla açıdan görüntüleme yeteneğidir. Bununla birlikte, bahsedilen aşamalardaki zebra balığı embriyoları için, tüm embriyo boyunca hücresel çözünürlük elde etmek için gereken görüntüleme sayısı net değildir. Bunu karakterize etmek için, zebra balığı embriyoları, 4.57 μm'lik bir hafif tabaka kalınlığına karşılık gelen 1'lik bir yakınlaştırma faktörü ile algılama kolunda 20x/1 NA objektif kullanılarak görüntülendi. Bu ayarlar altında, embriyo, 6.5 μm piksel boyutuna ve 1920 x 1920 piksellik bir alana sahip bir sCMOS kameranın tüm görüş alanını kapladı. Aktin filamentlerini (Utr-GFP) işaretleyen transgenik bir çizgiden elde edilen 1 hücreli evre embriyolarda histon etiketli bir florofor (H2A-mCherry) için mRNA'nın mikroenjeksiyonu, embriyodaki hem çekirdeklerin hem de hücre zarlarının görüntülenmesine izin verdi. Farklı açısal aralıklara sahip embriyoların çoklu görünüm füzyonunu gerçekleştirmek için, çift transgenik embriyoların yanı sıra tüpteki boncukların 360° edinimi her 30° (% 70 epibolide n = 3 embriyo; tomurcuk aşamasında n = 3 embriyo) veya 45 ° (% 70 epibolide n = 3 embriyo; tomurcuk aşamasında n = 3 embriyo) aralıklarla, her açıda yaklaşık 100 dilim ve 2 μm'lik bir dilim aralığı ile gerçekleştirildi. Görüntü işleme sırasında alternatif açıları atlayarak, 30° ve 45° alımları ek olarak 60° ve 90° veri setlerini sağladı.
Elde edilen görüntüler daha sonra boncuk bilgileri kullanılarak kaydedildi ve kayıt detayları protokol bölümünde anlatıldığı gibi embriyo veri setine aktarıldı. BigStitcher eklentisi kullanılarak başarılı bir kayıt, 90° veri seti dışındaki farklı alımlar için elde edildi, bu da muhtemelen numunenin her açıdan daha az kapsanmasından kaynaklanıyor. Bunun üstesinden gelmek için, embriyolar her açıda yaklaşık 400 dilim ve 2 μm'lik bir dilim aralığı ile her 90°'de bir, hem p epiboli hem de tomurcuk aşamalarında görüntülendi ve bunlar başarıyla kaydedildi (her aşama için n = 3 embriyo).
Bir sonraki adım, kayıtlı veri kümelerinin çoklu görüntüleme füzyonunu ve evrişimini çözmeyi gerçekleştirmekti. Bu, hesaplamayı hızlandırmak için 4x altörnekleme ile yapıldı. Bireysel görünümlerden ve çok görüntülü yeniden yapılandırılmış bir embriyodan çekirdeklerin temsilinde görüldüğü gibi (Şekil 5), bireysel görünümler daha küçük bir görüş alanını kapsar ve bu da füzyon üzerine tüm embriyonun bir görüntüsünü verir. Temsil için, çekirdekler, FIJI'deki "Yardım" menüsünün "Güncelleme Sitelerini Yönet" bölümüne eklenebilen ve eklendikten sonra eklentiler menüsünden erişilebilen FIJI tabanlı bir eklenti olan Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon) kullanılarak tespit edildi. Algılama için, ilgili görüntüler önce XML/hdf5 formatına dönüştürüldü ve ardından Mastodon'un bir DoG dedektörü (Çap 6 μm ve Kalite Eşiği 80) ile 'Algılama' eklentisi kullanılarak nükleer algılama gerçekleştirildi.
Farklı kaynaşmış görüntüler arasında, 90° veri seti, numunenin daha derinlerinde çok yüksek bir arka plan gösterdi ve bu da onu herhangi bir nicelik tespiti yapmak için uygun olmayan hale getirdi. Bu nedenle, diğer çalışmalarda sıklıkla 90° aralıklarla görüntülenen Drosophila embriyoları gibi daha küçük örneklerin aksine 9,22, 20x/1 NA objektif kullanılarak erken zebra balığı embriyolarının görüntülenmesi için aynı şey önerilmez. 30 °, 45 ° ve 60 ° kaynaşmış veri setleri arasında, niteliksel olarak, çekirdek bilgisinde önemli bir fark yoktu (Şekil 6B, üst sıra); bununla birlikte, hücre sınırları gibi daha ince yapılar, geri kalanına kıyasla 30° kaynaşmış veri seti ile çok daha iyi çözülmüş göründü (Şekil 6C, üst satır).
Bu gözlemi doğrulamak için Mastodon, her 30°, 45° ve 60°'de bir görüntülemeden elde edilen kaynaşmış görüntülerdeki çekirdekleri tespit etmek için kullanıldı. Kaynaşmış görüntülerde, her biri embriyo yüzeyinden 20 μm derinlikte (Şekil 6A), 50 μm ve 100 μm derinlikte olmak üzere üç bölge analiz için seçildi. Görüntüler arasında çekirdek tespitinin verimliliğini karşılaştırmak için, algılama, farklı açısal aralıklardan kaynaşmış görüntülerde aynı parametrelerle yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Analiz edilen tüm bölgelerde, her 30°, 45° veya 60°'de bir görüntülemeden elde edilen kaynaşmış görüntülerden bağımsız olarak her çekirdek tespit edildi (Şekil 6B, alt sıra). Böylece, çekirdekler gibi küresel yapılar, yukarıdaki açısal aralıkların herhangi birinde bilgi kaybı olmadan görüntülenebilir.
Hücre sınırlarını analiz etmek için,24,25,26 hücrelerini segmentlere ayırmak için rutin olarak kullanılan bir FIJI eklentisi olan Doku Analizörü23 kullanıldı. Mastodon'a benzer şekilde, Doku Analiz Cihazı eklentisi FIJI'deki "Yardım" menüsünün "Güncelleme Sitelerini Yönet" bölümüne eklenebilir ve eklendikten sonra eklentiler menüsünden erişilebilir. Hücre sınırları, varsayılan parametreler ve doku derinliğine bağlı olarak 1,5 ile 2 arasında değişen güçlü bir bulanıklık ve 1'lik zayıf bir bulanıklık ile havza algoritması kullanılarak bölümlere ayrıldı. Bu parametreler tüm analizlerde sabit tutuldu ve bu da basit bir karşılaştırmayı kolaylaştırdı. Bölümlere ayrılmış görüntüler orijinal giriş görüntüleriyle manuel olarak karşılaştırıldığında, yazılımın bir hücre sınırını algılayamadığı veya var olmayan hücre sınırları çizdiği hatalar gözlemlendi (Şekil 6C, alt satır). Doku analizörü eklentisi tarafından yapılan hata sayısı, bölgede tespit edilen toplam bağ sayısına normalize edildi ve 'Sınır segmentasyon hatası' olarak hesaplandı. Bu hatalar analiz edilen tüm bölgelerde mevcut olmakla birlikte, 45° ve 60° açısal aralıklarla görüntülemeden elde edilen kaynaşmış görüntülerde hata sayısı 30°'ye kıyasla büyük ölçüde artmıştır (Şekil 6D). Bu, kaynaşmış görüntülerdeki çözünürlüğün, açısal aralık arttırıldığında giderek daha kötü olduğunu gösterdi. Bu nedenle, hücre sınırları gibi daha ince yapıları segmentlere ayırmak için daha sıkı bir açısal aralık, aşağı akış işlemlerini kolaylaştırır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg"> Şekil 1: Polimer tüpler kullanılarak numune hazırlama. (A) Depolanan mikrosantrifüj tüplerinden bir polimer tüp forseps kullanılarak alınır. (B) Tüpü 200 μL'lik bir mikropipetin ucuna takmak. (C) Embriyoların bir pipet yardımıyla tüp içine aspire edilmesi. (D,E) Tüpün dibine doğru görülebilen tomurcuk aşaması embriyolarına sahip bir polimer tüp. (F) Polimer tüpler, agarozu katılaştırmak için E3 içeren bir Petri kabına yerleştirilir. (G) Polimer tüplerin E3 ile doldurulmuş bir mikrosantrifüj tüpünde saklanması. (H) Monte edilmiş polimer tüp ile monte edilmiş numune tutucu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg"> Şekil 2: Boncuklar kullanarak çoklu görüntü analizi iş akışı ve kaydı. (A) Çoklu görüntü analizi boru hattı. (B) Resim, bir FIJI eklentisi olan BigStitcher'da, her görünümün tek bir satır olarak göründüğü ve açı, kanal, kayıt, ilgi noktaları ve PSF hakkında bilgi içerdiği "Çoklu Görünüm Gezgini" penceresini gösterir. Protokolde tartışılan tüm komutlar, açılır menüde gösterildiği gibi bir görünüm seçildiğinde ve ardından sağ tıklama yapıldığında görünür. Seçilen görünümler, gösterildiği gibi BigDataViewer penceresinde görselleştirilebilir. (C) 30° açısal aralıklarla görüntülemeden elde edilen kayıttan önce (solda) ve kayıttan sonra (sağda) temsili bir boncuk görüntüsü. Tüm açısal görünümler seçildi ve görüntülendi. Ölçek çubukları: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg"> Şekil 3: Varsayılan embriyo oryantasyonlarına genel bakış. Embriyoların p epiboli (A) ve tomurcuk aşamalarında (B) koryon içinde içine düştüğü oryantasyonların temsili görüntüleri. Her paneldeki üst sıra, ışıklı levha sisteminden elde edilen parlak alan görüntülerini, alt sıra ise temsili karikatürleri gösterir. (B) 'deki oklar, oryantasyonu tanımlamak için kullanılan notokordun konumunu gösterir. Ap, hayvan direği; Vp, bitkisel direk; A, ön; P, arka. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg"> Şekil 4: Farklı embriyo yönelimlerinin istatistikleri. (A) Yığılmış sütun, gastrulasyondan önce örnekler hazırlandığında p epibolide belirtilen yönlere düşen embriyoların yüzdelerini gösterir. (B) Yığılmış sütunlar, numunelerin gastrulasyondan önce hazırlandığı tomurcuk aşamalarında (solda), p epibolide (ortada) ve tomurcuk aşamalarında (sağda) belirtilen yönlere düşen embriyoların yüzdelerini gösterir. N, embriyoların elde edildiği bağımsız kavramaların sayısı; n, toplam embriyo sayısı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg"> Şekil 5: Çok görünümlü, yeniden yapılandırılmış bir embriyodan alınan çekirdeklerin temsili. (Bir)3D saçılma grafiği, 30̛° açısal aralıklarla görüntülenen çok görüntülü yeniden yapılandırılmış bir embriyoda tespit edilen çekirdekleri temsil eder. Her daire bir çekirdeği temsil eder ve çekirdek konumlarının merkezi çizilir. Nükleer koordinatlar, bir FIJI eklentisi olan Mastodon kullanılarak elde edildi. (B) Aynı embriyonun üç temsili görünümünden elde edilen 3B saçılma çekirdek grafikleri - tasvirler 60° aralıklıdır. Her çekirdek için renkler rastgele atandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg"> Şekil 6: Kaynaşmış görüntülerdeki hücresel ölçekli bilgilerin karşılaştırılması. (A) Soldaki görüntü, yüzeyden 20 μm derinlikte çok görüntülü yeniden yapılandırılmış bir embriyodan bir anlık görüntüyü göstermektedir. Sarı daire, daha fazla analiz için kullanılan bölgeyi gösterir. Ölçek çubukları: 50 μm (tüm panellerde). (B) Sırasıyla her 30 °, 45 ° ve 60 ° 'de bir görüntülenen üç veri setinden embriyonun yüzeyinden 20 μm derinlikte çekirdeklerin temsili ham görüntüleri (üstte). Bir FIJI eklentisi olan Mastodon tarafından aynı görüntülerde (yeşil renkte) çekirdek tespit edildi (altta). (C) Aktin markörü, Utr-GFP (üstte) kullanılarak sırasıyla her 30 °, 45 ° ve 60 ° 'de bir görüntülenen üç veri setinden embriyonun yüzeyinden 20 μm derinlikte temsili ham görüntüler. Bir FIJI eklentisi olan Tissue Analyzer tarafından segmentlere ayrılan sınırlar aynı görüntüler için gösterilir (altta). Oklar, Doku Analizörü tarafından sınır segmentasyonunda yapılan hataları gösterir, sarı ok eksik bir sınırı temsil eder ve beyaz ok, görsel olarak hiçbir sınır yokmuş gibi göründüğünde yanlış algılanan sınırları temsil eder. (D) Kutu çizimi, Doku Analiz Cihazının, her 30 °, 45 ° ve 60 ° 'de farklı derinliklerde görüntülenen çoklu görüntü yeniden yapılandırılmış embriyolar arasında yaptığı hataların yüzdesini gösterir. Hata çubukları, çeyrekler arası aralığın 1,5 katını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

light-sheet-microscopy-imaging-mounting-strategies-for-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makalede, ışık tabakası floresan mikroskobu için numune hazırlama açıklanmaktadır. Ayrıca, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmek için bir yöntem gösterir, bu da canlı embriyoların uzun süreli filmlerinin kaydedilmesine izin verir.

Işık Levha Mikroskobu Numune Hazırlama: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Montajı

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Burada, elde edilen verileri analiz etmek için ticari olarak temin edilebilen bir ışık tabakası mikroskobu ve bir görüntü işleme iş istasyonu kullanılarak oküler morfogenezin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, embriyo anestezisi, düşük erime sıcaklığında agaroza gömülme, görüntüleme odasında süspansiyon, görüntüleme parametrelerinin ayarlanması ve son olarak görüntü analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme verilerinin analiz edilmesi prosedürlerini...

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.

Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

Burada, iletilen ışık ve floresan mikroskobu kullanarak hızlandırılmış görüntüleme için civciv embriyolarını ex ovo kültürlemek için yeni bir teknik sunuyoruz. Batık filtre kağıdı sandviçi, sıvı bir kültür ortamına tamamen batırılmış civciv embriyolarının kültürlenmesine izin veren, iyi bilinen filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin1 bir çeşididir.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç Ex Ovo Time-lapse Görüntüleme

Öğrenin, ışık levha mikroskobu ile erken zebra balığı embriyolarını canlı görüntüleme ve hücresel çözünürlükte analiz etme yöntemlerini. Bu teknik, gelişim biyolojisinde simetri oluşumunu incelemek için fotoblokajı azaltır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Daha fazla video keşfet