RGD İşlevselleştirilmiş Avidin-Biotin Bağları Kullanarak Trombosit Migrasyonunu İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Trombositler, damar yaralanması sonrası kan kaybını önlemede, enfeksiyonlarla savaşmada ve iltihaplanma sırasında damar bütünlüğünü korumada çok önemlidir. Hemostatik tıkaçlar, trombositlerin toplu aktivasyonunu ve agregasyonunu gerektirirken, iltihaplı kan damarlarını korumadaki rolleri tek hücre düzeyinde gerçekleştirilir. Bu bağlamda, son çalışmalar, trombositlerin, yapışkan mikro ortamlarının mekanoselenmesine bağlı bir süreç olan otonom olarak göç edebildiğini bulmuştur.

Bu yaklaşım, substrat adeziv özelliklerinin hassas kontrolüne izin verir ve trombosit göçünün altında yatan mekanizmaları incelemek için basit bir in vitro test görevi görür. Sonuçlar, integrin ligandlarına bağlanan trombositlerin göç etmesinin avidin-biyotin bağını bozabilecek kuvvet uygulayabileceğini göstermektedir. Bu test, trombosit göçünü görselleştirmek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ile birleştiğinde, bu önemli trombosit fonksiyonunda farklı hücre iskeleti bileşenlerinin etkileşimini ve düzenlenmesini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Başlamak için, sonikat cam kapağı bir dakika boyunca% 20 nitrik asit içinde kayar, ardından her biri bir dakika boyunca izopropanol, etanol ve su içinde sonikasyon yapılır. Önceden temizlenmiş lamellere oksijen plazması ile iki dakika boyunca bir plazma temizleyicide işlem yapın, ardından bunları yapışkan slaytlarla birleştirin.

Şimdi kanalı 97.5 mikrolitre PLL-PEG içinde seyreltilmiş 2.5 mikrolitre PLL-PEG-biotin ile doldurun ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 100 mikrolitre nötravidin-FITC ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, 100 mikrolitre siklo-RGD biotin ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve PBS ile üç kez yıkayın.

Fareyi uyuşturduktan ve göğüs derisini çıkardıktan sonra, kalpten kan almak için iğneyi sternumun sol tarafındaki ikinci ve üçüncü kaburgalar arasına sokun. Kanı bir mililitre Tyrode tamponu ile karıştırın ve fren kapalıyken oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 70 g'da santrifüjleyin, ardından trombositten zengin plazma içeren üst kısmı alın. Üç mililitre Tyrode tamponu ile karıştırın ve trombosit aktivasyonunu önlemek için mililitre başına 100 nanogram prostasiklin ekleyin.

Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 500 mikrolitre Tyrode tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, bir hemositometre kullanarak trombosit sayılarını ölçün.

Başlamak için, biyotin-nötravidin-biyotin cRGD kaplama kanallarında fare trombositlerini alın ve bir sahne inkübatörü ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak canlı trombosit göçünü kaydedin. Trombosit yapışma veya migrasyon numaralarını saymak için, araç çubuğundaki nokta aracının açılır menüsüne sağ tıklayın ve çok noktalı aracı seçin. Nötravidin-FITC kaplamaya basılmış migrasyon yolunun uzunluğunu ölçerek sabit numunelerden migrasyon mesafesini çıkarın.

Araç çubuğundaki düz çizgi aracının açılır menüsüne sağ tıklayın ve ücretsiz el çizgisi aracını seçin. Trombositlerin şeklini ölçmek için, floresan trombositleri bölümlere ayırarak ikili maskeler oluşturmak için araç çubuğunda Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin. Analiz Et ve Ölçümleri Ayarla'da şekil tanımlayıcılarını seçin, ardından Parçacıkları Analiz Et ve Analiz Et'i kullanarak Sonuçları Görüntüle'yi seçin.

Trombositler% 2.5 PLL-PEG-biyotin konsantrasyonunda optimal migrasyon sergiledi. Migrasyon hem düşük hem de yüksek ligand yoğunluklarında azaldı. Trombositler, düşük alan ve çevre ile gösterilen% 1'lik ligand yoğunluğunda yetersiz yayılır ve bu da yetersiz integrin aktivasyonunu düşündürür.

%2.5 ligand yoğunluğunda, trombositler etkili bir şekilde yayılır, cRGD ligandlarını bozar ve göç eder. Yüksek ligand yoğunluğu, trombositlerin polarizasyon olmadan yayılmasına neden oldu ve cRGD ligandlarının kırılamaması nedeniyle migrasyonu azalttı.