Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Kuduz yüzde yüz ölümcül ve en çok ihtiyacı olanlara hayat kurtarıcı tedavi sağlamak için hızlı ve doğru teşhis gereklidir. Güvenilir laboratuvar testi, kuduz kontrolü için gerçekten çok önemlidir. CDC, LN34 adlı doğrulanmış gerçek zamanlı Alisa virüs testi kullanılarak nicel ters transkriptaz PCR veya RT-PCR ile kuduz testi için adım adım bir protokol geliştirmiştir; bu protokol laboratuvarların tanı doğruluğunu artırmasını ve kuduz önleme çabalarını desteklemesini sağlamaktadır.

On yıllar boyunca kuduz testi, DFA veya FAT adı verilen doğrudan floresan antikor testlerine dayanıyordu. Ancak, birçok uluslararası laboratuvar, mükemmel hassasiyeti ve doğruluğu nedeniyle kuduz testi için RT-PCR de kullanır. Kuduz için DFA testi özel mikroskop, soğuk zincir depolama, personel eğitimi ve reaktiflerin özel eğitimi gerektiriyor; son yıllarda PCR ve RT-PCR artık patojen testlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Birçok laboratuvarda zaten PCR ve RT-PCR ekipman ve uzmanlığı vardır ve gerekli reaktifler ticari satıcılardan temin edilebilmektedir. Maliyet, insanlarda en çok kuduz vakasının yaşandığı bölgelerde kuduz testi için büyük bir engeldir. CDC, kalite kontrollerini iyileştiren ve test edilen örnek başına maliyeti düşüren LN34 testinin çoklu bir formunu geliştirmiştir.

RT-PCR, kuduz tanısında giderek daha fazla uygulanmaktadır çünkü diğer patojenlerin testinde yaygın olarak kullanılıyor ve sonuçları yorumlanması kolay. Ancak doğrulanmış bir test kullanmak son derece önemlidir ve testin beklendiği gibi performans gösterdiğinden emin olmak da aynı derecede önemlidir. Adım adım protokolümüz, laboratuvarların başlamasına yardımcı olmak için kalite kontrolleri, güvenlik önlemleri ve en iyi PCR uygulamalarını içerir.

Başlamak için, koruyucu gözlük, kapalı ön önlük ve iki çift eldiven gibi kişisel koruyucu ekipman takın. Çalışma yüzeyini kuaterner amonyum bileşiği veya kuduz virüsü etkisiz hale getirmek için uygun bir dezenfektan ile temizleyin ve dezenfekte edin. Çalışma yüzeyine plastik astarlı emici bir ped serin; temiz, tek kullanımlık bistüri kullanarak beyin sapı ve beyincik kesitinin tam kesitini temsil eden doku toplayın.

Homojenleştirme ve RNA çıkarımı için son olarak, gerekli dokuları tek kullanımlık bir bistürle doğrayın. Kıyma dokusunu bir sürüntüyle sürtün ve sürüntü, homojenizasyon tamponu ve boncuklarla önceden doldurulmuş bir tüpe aktarın. Dış eldiveni QAC dezenfektan ile 1:256 derecesi ile attıktan sonra, iş istasyonunu, ekipmanı ve örnek tüplerinin dışını temizleyip dezenfekte edin.

Örnekleri mini bir boncuk dövücüyle 60 saniye boyunca homojenleştirin. Ve tüpleri görsel olarak inceleyin. Örnekleri oda sıcaklığında beş dakika beklet.

Son olarak, iş istasyonunu, ekipmanları ve örnek tüplerinin dışını QAC dezenfektan ile temizleyip dezenfekte edin, ardından RNA çıkarımına geçin. Başlamak için, biyolojik güvenlik kabinesinin yüzey dekontaminasyonunu QAC ile 1:256'ya kadar seyreltilmiş şekilde gerçekleştirin. Toz veya diğer çevresel kirleticileri temizlemek için ek temizlik yapın.

Çalışma platformuna plastik astarlı emici çalışma paneli yerleştirin. Sonra, reaktifleri ve örnekleri biyogüvenlik dolabında yerleştirin. Tüm toplama tüplerini mikro santrifüj tüpleri için temiz bir rafa yerleştirin.

Her beyin örneği için bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü 300 mikrolitre %100 etanol ile önceden doldurun. Homojenleştirilmiş beyin levhalarını 10.000 ila 16.000 G arasında iki dakika boyunca masaüstü bir mikro santrifüjde santrifüjleyin. Berrak pembe üst kaplamayı %100 etanol içeren yeni steril bir tüpe aktarın, pipet yapın ve 600 mikrolitre etanol süpernatant karışımını bir toplayıcı tüpteki spin kolonuna aktarın.

Sıvı kolonun içinden geçene kadar bir dakika santrifüj yapın, akışı atın ve her kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Her kolona 400 mikrolitre RNA ön yıkama tamponu ekleyin. Karışımı 10.000 ila 16.000 G arasında 30 saniye boyunca santrifüjle edin ve akışı atınız.

Her kolonu aynı toplama tüpüne geri getirin ve ön yıkama adımını ikinci kez tekrarlayın. Sonra, her kolona 700 mikrolitre RNA yıkama tamponu ekleyin. Santrifüj 10.000 ile 16.000 G arasında iki dakika boyunca koyun.

Ve dikkatlice RNase içermeyen bir tüpe aktarın. Akışı ve toplama tüpünü atın, ardından dış eldivenleri çıkarıp atın. Şimdi 50 mikrolitre DNaz ve RNase içermeyen suyu doğrudan kolon matrisine ekleyin ve 30 saniye kuluçka yapın.

Sonra 10.000 ile 16.000 G arasında bir dakika boyunca santrifüj yapın. RT-PCR testi için RNA'yı dikkatlice yeni vida üstteki düz tabanlı mikro santrifüj borusuna aktarın. Başlamak için, master karışım hazırlama alanında bir adım RT-PCR tamponu, şablon kontrolü olmadan, nukleaz içermeyen su, primerler ve probları buz üzerinde çözebilirsiniz.

Bir adım RT-PCR enzimini buz üzerine koyun. LN34 çoklanmış ve beta A Master Mix'ler için her reaktifin hacmini hesaplayın. LN34 çoklayıcı testi için her örnek için kuyular üçlü olarak belirlenir, 96 kuyu levha haritası kullanılır.

Vortexleme ve dönmeden sonra, her LN34 kuyusuna 23 mikrolitre LN34 çoklu Master Mix dağıtılır. Negatif şablon kontrol reaksiyonlarını kurmak için, her negatif şablon kontrol kuyusuna iki mikrolitre PCR kalitesinde su ekleyin. 96 kuyu plakasını buzun üzerine koyun.

İş istasyonunu %70 etanol ile temizleyin. Şimdi şablon baskı çalışma alanında, buz üzerindeki yapay RNA örneklerini ve tek kullanımlık pratik kontrol alevini eritmek için kullanılıyor. Vortekslemeden sonra, RNA örnekleri içeren kısa süreli santrifüj tüpleri ile ilgili kuyuya iki mikrolitre örnek veya pozitif kontrol RNA'sı pipetlenir.

Tüm örnekler eklendikten sonra, kuyular tamamen sızdırmazlık için optik yapıştırıcı kapağı üzerine yerleştirin. Plakayı 500 G'de oda sıcaklığında bir dakika boyunca santrifüjle edin, mühürlü plakayı aile ve VIC Hex muhabir kalıpları için kalibre edilmiş gerçek zamanlı veya nicel PCR cihazına yerleştirin. Aleti uygun döngü parametrelerine ayarlayın.

Çalışma tamamlandıktan sonra eşik değerleri LN34 için 0.2 ve beta aktin için 0.05 olarak ayarlanır. Kontrol örnek eğrilerini kalite sorunları için kontrol edin. LN34 testi, logaritmik ölçekte incelendiğinde olumlu sonuçların farklı döngü eşik değerlerinde eşiği aştığı başarılı amplifikasyon eğrileri gösterdi.

Ve hem LN34 hem de beta aktin için doğrusal ölçekte sigmoid amplifikasyon eğrileri. Negatif sonuçlar ise amplifikasyon olmadan düz çizgiler gösterdi. Anormal amplifikasyon eğrileri, bazılarının sigmoidal değil lineer floresans artışları gösterdiği tespit edildi; bu da atipik sonuçları gösteriyordu.

İlgili çok bileşenli grafikler, beklenen düzgün eğriler yerine düzensiz dalgalı floresan sinyaller gösterdi. Yalnızca döngü eşik değerlerine dayanmak yerine amplifikasyon grafiklerini analiz etme ihtiyacını vurgulamak.