Name: Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Öğrenin, küçük doku ve hücre kültürü örneklerinden mitokondri izolasyonu yaparak solunum süperkomplekslerini analiz etme yöntemini. Bu teknik, OXPHOS sistemi organizasyonu ve mitokondriyal biyogenez araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ministerio de Ciencia e Innovación'dan (https://ciencia.sede.gob.es/) "PGC2018-095795-B-I00" hibe numarası ve Diputación General de Aragón'dan (DGA) (https://www.aragon.es/) PF-S ve RM-L'ye "Grupo de Referencia: E35_17R" hibe numarası ve "LMP220_21" hibe numarası ile desteklenmiştir.

Süper Kompleks Analiz için Küçük Doku Örneklerinde Mitokondriyal Fraksiyonlama

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Burada açıklanan protokollerde tanıtılan metodolojik uyarlamalar, mitokondriyal kompleks aktiviteleri korurken (yeterli miktarda numunenin mevcudiyeti tehlikeye girdiğinde çok önemlidir) kayıpları önlemeyi ve verimi artırmayı ve dokunun veya hücre hattının beklenen SC modelini yeniden üretmeyi amaçlamaktadır (bkz. Şekil 2C). Bu amaçla ve SK'leri düzgün bir şekilde tespit etmek için yüksek bir mitokondriyal saflık gerekmediğinden, bu mümkün olduğunda adım, süre ve hacim sayısı azaltılmıştır.
Bu nedenle, düşük hızlı santrifüjleme ile çekirdeklerin ve kırılmamış hücrelerin homojenizasyonu ve uzaklaştırılmasından sonra, mitokondriyi içeren süpernatantlar 1.5 mL polipropilen tüplere aktarılır ve ham mitokondriyal fraksiyonları elde etmek için müteakip santrifüjlemeler, hızı artırarak ve geleneksel protokollere göre süreleri ve hacimleri azaltarak bir mikrofüje yerleştirilir. Bu, birkaç numunenin nispeten kısa bir sürede işlenmesine izin verir: yakın bir tahmin, 10 numunenin ~2-2.5 saat içinde (homojenizasyonun başlangıcından (protokol adımı 1.6. veya dokular için eşdeğeri) bir jele yüklenmeye hazır SC fraksiyonunun elde edilmesine (protokol adımı 3.7) kadar işlenebileceği ve aktiviteleri sürdürürken kayıpları en aza indirgediğidir. Orijinal Schägger'in grup protokollerine göre bir başka değişiklik, SC fraksiyonunun elde edilmesi için membran çözündürmesinden sonra, basit bir mikrofüj santrifüjleme ile bir ultrasantrifüj adımının değiştirilmesidir (protokol adımı 3.4).
Prosedürde bazı kritik adımlar vardır. Birincisi, özellikle kültürlenmiş hücreler söz konusu olduğunda (protokol adımı 1.8'den sonraki nota bakınız) ve özellikle küçük hücreler söz konusu olduğunda, hücre kırılmasının etkinliği. Dokular ve hücre hatları, hücre kırılmasında değişken bir zorluk derecesi sunar: örneğin, kalp ve kasta, bu adım genellikle karaciğer veya dalaktan daha az verimlidir, ancak birincisi daha yüksek bir mitokondriyal içeriğe sahip olduğu için verimde telafi edilir. Kas veya kalpten izole edildiğinde mitokondriyal verimi artırmak için bir alternatif, homojenizasyondan önce numunelerin tripsin ile muamele edilmesi olacaktır. Beyin, daha önce bildirildiği gibi, daha hafif ve daha az verimli olan manuel homojenizasyon ve muhtemelen bu dokudaki hücre tiplerindeki daha yüksek varyasyon nedeniyle hücre kırılmasında düşük verimlilik gösteren başka bir dokudur 42. Bu, protokolümüzde önerildiği gibi ikinci bir homojenizasyon adımı ile kısmen telafi edilebilir (adım 2.7.4). Öte yandan, hücre kırılması aşırı ise, SC'leri içeren son numune, elektroforetik çalışmaya müdahale edebilecek nükleer DNA parçaları ile kontamine olabilir. Bu problem, mitokondriyal zarları çözündürmek için digitonin eklendiğinde numunenin viskozitesinde bir artış olarak gösterilir ve DNAse I ile muamele edilerek çözülebilir.
İkincisi, deterjan-protein oranı çok düşükse, bu daha az verimli membran çözünmesine ve agrega oluşumu olasılığına neden olur. Bu, jellerde yüksek moleküler ağırlıklı SC'lerde düşük çözünürlük (bkz. Şekil 4) veya oligomerlere43 karşılık gelen çoklu bantlar veren CIV olarak gösterilebilir. Oran çok yüksekse, SC'lerin (esas olarak CI-SC'ler) ayrıştırılmasına yol açabilir. Üçüncüsü, tüm prosedür boyunca numunelerin ısıtılmasından kaçınmak (bkz. Şekil 4) ve SC montaj durumunu etkileyebileceğinden tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçınmak önemlidir.
Tablo 2'de, çeşitli hücre tipleri ve doku örnekleri için beklenen verimlerin bir özeti sunulmuştur. Değerler yaklaşıktır ve hücre kırılma verimliliğine ve kaynağın doğasına bağlı olacaktır. Dokular söz konusu olduğunda, başlangıç materyali donmuşsa, taze numunelere göre daha yüksek bir verim verme eğilimindedir. Yüklenebilecek şerit sayısının bir tahmini (şerit başına 50 ila 60 μg mitokondriyal protein arasında bir yük göz önüne alındığında) sunulmuştur.
Burada sunulan protokoller, küçük varyasyonlara sahip çeşitli doku ve hücre tiplerini kapsar, taze veya dondurulmuş numunelerle kullanılabilirler ve pahalı saflaştırma kitlerinin veya gradyanların kullanımını içermeyen basit ekipman ve nispeten düşük bir maliyet gerektirirler. Bununla birlikte, belirli hücre tipleri veya numuneleri ile ve ayrıca örneğin beyin sinaptik mitokondri veya kas subsarkolimal mitokondri gibi spesifik mitokondriyal popülasyonların analizin nesnesi olduğu durumlarda kullanılmak üzere bazı adaptasyonlara ihtiyaç duyabilirler.
SK'lerin kesin fizyolojik rolleri ve patolojik durumlardaki potansiyel katılımı henüz tanımlanmadığından, dinamiklerinin ve montajlarını, stabilitelerini ve işlevlerini etkileyen faktörlerin analizine ihtiyaç vardır. Protokollerimiz, özellikle çoklu deneysel koşulların karşılaştırılması gerektiğinde, küçük örneklem boyutlarına sahip ve çeşitli hücre tipleri ve dokulardan SC paternleri üzerinde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmeye izin veren değerli araçları temsil edebilir29.

Süper kompleksler (SK'ler), bireysel solunum zinciri kompleksleriarasındaki supramoleküler ilişkilerdir 1,2. SC'lerin ilk tanımlanması ve bileşimlerinin Schägger 2,3 grubu tarafından tanımlanmasından bu yana, daha sonra diğer gruplar tarafından onaylandığından, farklı stokiyometrilerde solunum kompleksleri I, III ve IV (SIRASIYLA CI, CIII ve CIV) içerdikleri tespit edilmiştir. İki ana SK popülasyonu tanımlanabilir, CI içerenler (ve tek başına CIII veya CIII ve CIV) ve çok yüksek moleküler ağırlığa sahip olanlar (MW, daha küçük SC için ~ 1.5 MDa'dan başlar: CI + CIII2) ve CIII ve CIV içerenler ancak CI içermeyenler, çok daha küçük boyutlu olanlar (~ 680 kDa'lı CIII2 + CIV gibi). Bu SC'ler, iç mitokondriyal zarda da farklı oranlarda serbest komplekslerle bir arada bulunur. Bu nedenle, CI çoğunlukla ilişkili formlarında bulunurken (yani, SC'lerde: sığır kalbinde ~% 80 ve birçok insan hücre tipinde% 90'dan fazla)3, CIV serbest formunda çok bol miktarda bulunur (sığır kalbinde% 80'den fazla), CIII daha dengeli bir dağılım gösterir (daha bol serbest formunda ~% 40, bir dimer olarak, sığır kalbinde).
Varlıkları artık genel olarak kabul edilse de, kesin rolleri hala tartışılmaktadır 4,5,6,7,8,9,10. Plastisite modeline göre, hücre tipine veya metabolik duruma bağlı olarak farklı oranlarda SK'ler ve bireysel kompleksler mevcut olabilir 1,7,11. Düzeneğin bu dinamik doğası, hücrelerin çevresel değişikliklere yanıt olarak mevcut yakıtların kullanımını ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sisteminin verimliliğini düzenlemesine izin verecektir 4,5,7. SK'ler ayrıca reaktif oksijen türlerinin üretim hızının kontrolüne katkıda bulunabilir ve bireysel komplekslerin stabilizasyonuna ve cirosuna katılabilir 4,12,13,14. SC montaj durumundaki modifikasyonlar, farklı fizyolojik ve patolojik durumlarla15,16 ve yaşlanma süreci17 ile ilişkili olarak tanımlanmıştır.
Bu nedenle, SC modellerindeki değişiklikler, büyüme2 için kullanılan karbon kaynağına bağlı olarak mayada ve glikoz galaktoz4 ile ikame edildiğinde kültürlenmiş memeli hücrelerinde tanımlanmıştır. Oruç tuttuktan sonra fare karaciğerinde8 ve mitokondriyal yağ asidi oksidasyonubloke edildiğinde astrositlerde de değişiklikler bildirilmiştir 18. Ek olarak, Barth sendromu19, kalp yetmezliği20, çeşitli metabolik21 ve nörolojik 22,23,24 bozukluklarda ve farklı tümörlerde SK'lerde ve OXPHOS'ta bir azalma veya değişiklikler bulunmuştur 25,26,27,28. SK montajındaki ve seviyelerindeki bu değişikliklerin bu patolojik durumlarda birincil neden olup olmadığı veya ikincil etkileri temsil edip etmediği hala araştırılmaktadır15,16. Farklı metodolojiler, SC'lerin montajı ve işlevi hakkında bilgi verebilir; Bunlar arasında aktivite ölçümleri 8,29, ultrastrüktürel analiz30,31 ve proteomik32,33 yer alır. Giderek daha fazla kullanılan ve daha önce bahsedilen metodolojilerin bazıları için başlangıç noktası olan yararlı bir alternatif, Schägger'in grubu34,35 tarafından bu amaç için geliştirilen Blue native (BN) elektroforezi ile SC montaj durumunun doğrudan belirlenmesidir.
Bu yaklaşım, mitokondriyal zarları elde etmek ve çözündürmek için tekrarlanabilir ve verimli prosedürler gerektirir ve jel içi aktivite analizi (IGA), ikinci boyut elektroforezi ve western blot (WB) gibi diğer tekniklerle tamamlanabilir. BN elektroforezi ile SK dinamiği üzerine yapılan çalışmalarda bir sınırlama, başlangıç hücrelerinin veya doku örneklerinin miktarı olabilir. SC montajı ve fonksiyonunun analizi için, Schägger'in grup yöntemlerinden uyarlanan, 20 mg kadar küçük bir dokudan başlayarak taze veya donmuş hücre veya doku örneklerine uygulanabilen bir dizi protokol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Aminokaproik asit</td><td>Fluka Analitik</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford tahlili</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Sitokrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino ve nbsp; benzidin (DAB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Yağ asitleri içermez BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör Teflon havaneli</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Hücre</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Monoklonal Antikor</td><td>İnvitrojen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE %3 ila %12 Mini Protein Jelleri</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Katot Tampon Katkı Maddesi (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Çalışma Tamponu (20x)&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Monoklonal Antikor</td><td>İnvitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolyum tuzu (NBT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb (NO3) 2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF Membran</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Fenazin metasülfat (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Yüzey</td><td>Termo Bilimsel</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Monoklonal Antikor</td><td>İnvitrojen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum süksinat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin / penisilin</td><td>PAN biyoteknoloji</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Monoklonal Antikor</td><td>İnvitrojen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini Hücreli</td><td>Canlandırıcı</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

küçük doku ve hücre kültürü Örneklerinden mitokondriyal süperkompleks analizi için mitokondri İzolasyonu 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Son on yıllarda, solunum süper komplekslerinin (SC'ler) varlığı hakkında toplanan kanıtlar, mitokondriyal elektron taşıma zinciri organizasyonu hakkındaki anlayışımızı değiştirdi ve "plastisite modeli" önerisine yol açtı. Bu model, dokuya veya hücresel metabolik duruma bağlı olarak farklı oranlarda SK'lerin ve komplekslerin bir arada bulunduğunu varsayar. SC'lerdeki düzeneğin dinamik doğası, hücrelerin mevcut yakıtların kullanımını ve elektron transferinin verimliliğini optimize etmesine, reaktif oksijen türlerinin oluşumunu en aza indirmesine ve hücrelerin çevresel değişikliklere uyum sağlama yeteneğini desteklemesine izin verecektir. 
Daha yakın zamanlarda, nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer ve Parkinson hastalığı), Barth Sendromu, Leigh sendromu veya kanser gibi farklı hastalıklarda SC montajında anormallikler bildirilmiştir. SK montaj değişikliklerinin hastalığın ilerlemesindeki rolünün hala doğrulanması gerekmektedir. Bununla birlikte, SC montaj durumunu belirlemek için yeterli miktarda numunenin mevcudiyeti genellikle bir zorluktur. Bu, küçük veya çoklu analizler için bölünmesi gereken biyopsi veya doku örneklerinde, yavaş büyüyen veya mikroakışkan cihazlardan gelen hücre kültürlerinde, bazı birincil kültürlerde veya nadir hücrelerde veya belirli maliyetli tedavilerin etkisinin analiz edilmesi gerektiğinde (nanopartiküller, çok pahalı bileşikler vb.) olur. Bu durumlarda verimli ve uygulaması kolay bir yöntem gerekir. Bu makale, mitokondriyal SC'lerin yapısını ve işlevini doğal elektroforez ve ardından jel içi aktivite deneyleri veya western blot ile analiz etmek için küçük miktarlarda hücre veya dokudan zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar elde etmek için uyarlanmış bir yöntem sunmaktadır.

Yukarıda açıklanan protokollere göre elde edilen mitokondri verimleri, hücre hattı veya doku tipi, numunelerin doğası (yani taze veya donmuş dokular kullanılıyorsa) veya homojenizasyon işleminin verimliliği gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişir. Farklı hücre dizilerinden ve dokulardan beklenen mitokondri verimleri Tablo 2'de toplanmıştır. Mitokondriyal fraksiyonlar elde edildikten sonra, bir sonraki adım, ham mitokondriyal numunenin çözündürülmesi ve BN-PAGE ile elektroforetik ayrılmasından sonra gerçekleştirilen solunum SC modelinin analizidir ve ardından IGA analizi veya WB immün tespiti yapılır. Şekil 1 , çalışmadan hemen sonra boyanmamış jel şeritlerinin görünüşünü ve kültürlenmiş bir hücre hattının ve bir fare karaciğeri mitokondriyal örneğinin standart Coomassie boyamasından sonraki bantların modelini göstermektedir.
Şekil 2A,B'de, IGA tahlilleri kullanıldıktan sonra insan ve fare hücrelerindeki SC montaj modelleri arasında açık farklılıklar gözlemlenebilir. Bu nedenle, serbest kompleks I, fare hücrelerinde gözlenirken, insan mitokondrilerinde tespit edilemez. Kompleks IV-IGA modeli, Şekil 2A'da analiz edilen iki fare hücre hattı arasında farklılıklar sunarken, her iki insan hücre hattında da (Şekil 2B) çok benzerdir. Bu farklılıklar, BL6 hücrelerinin SCAF18'in mutant bir varyantını eksprese etmesinden kaynaklanmaktadır.
Küçük numunelerle çalışmak için burada açıklanan mitokondriyal izolasyon protokolü ile elde edilen SC modelleri, daha büyük numuneler için kullanılan "geleneksel" protokollere göre korunur. Bu, Şekil 2C'de, 1 ve 6 numaralı şeritlerin (3 g karaciğer ve 1.1 g BAT'tan geleneksel bir protokol kullanılarak mitokondriyal izolasyondan sonra elde edilir) sırasıyla 2 ve 5 numaralı şeritlerle (burada sunulan protokoller kullanılarak elde edilir) karşılaştırılmasıyla görülebilir. Plastisite modelinde önerildiği gibi, solunum komplekslerinin ve SK'lerin nispi oranı, hücre tipine ve metabolik duruma bağlı olarak değişir. Şekil 2C,D'de gösterildiği gibi, farklı dokular farklı SC montaj modelleri gösterir. Bu nedenle, beyin mitokondrileri diğer dokularla karşılaştırıldığında çok düşük seviyelerde serbest kompleks I ve daha yüksek oranda SK gösterir ve BAT, düşük CV seviyeleri (Şekil 2A) ve yüksek miktarda SC III + IV (Şekil 2D) ile karakterize edilir. Kalp mitokondrileri yüksek seviyelerde SK ve CV sunar. CV montaj modelleri, kültürlenmiş hücre hattı ile bir fare karaciğeri mitokondriyal örneği arasında çok benzerdir (Şekil 2E).
SC montajı, dalak kontrolü ve tümör hücrelerinden elde edilen iki örnek için Şekil 3'te gösterildiği gibi WB tarafından da analiz edilebilir. Bu durumda, 30-50 μg mitokondriyal protein, spesifik antikorlarla farklı kompleksleri ve SK'leri tespit etmek için genellikle yeterlidir. Şekil 4 , bu protokollerin uygulanması sırasında meydana gelebilecek bazı ana tuzakları göstermektedir. Yanlış jel gradyanları, jeldeki normalden daha yüksek akrilamid konsantrasyonu nedeniyle SC'lerin şeridin üst kısmındaki kuyuya yakın kaldığı Şekil 4A, şerit 1'deki gibi anormal ve istenmeyen göç modelleri üretebilir. Numunelerin, nispeten kısa süreler için bile, yüksek sıcaklıklarda (burada 37 °C ve 10 dakika boyunca 40 °C) inkübasyonu, SC'lerin ve CI'nin bozulmasına neden olur (Şekil 4A şeritleri 2-4). Aynı şekilde, deterjan-protein oranı, iyi sonuçlar ve yeterli jel çözünürlüğü için kritik öneme sahiptir. 2 g digitonin/g protein oranının altında, bant çözünürlüğü kademeli olarak azalır ve daha düşük konsantrasyonda (0.5 g/g) sadece SK'lere karşılık gelen alanda bir yayma görülebilir (Şekil 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Şekil 1: Digitonin geçirgenliğine uğramış mitokondrinin bir kültür hücre hattından (L929Balbc) ve fare karaciğerinden BNGE tarafından ayrılmasından sonra mitokondriyal komplekslerin ve süper komplekslerin modeli. Soldaki şeritler (1 ve 2), koşudan hemen sonra lekelenmemiş jelin yalnızca CV'nin tespit edilebildiği yönünü temsil ederken, sağdaki şeritler (3 ve 4) Coomassie boyamadan sonraki bantların modelini gösterir. Kısaltmalar: BNGE = Blue Native jel elektroforezi; CV = karmaşık V; SC'ler = süper kompleksler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Şekil 2: Farklı hücre hatlarından ve fare dokularından izole edilen mitokondrinin IGA analizi. (A,B) (A) fare veya (B) insan hücre hatlarından izole edilen mitokondrideki belirtilen komplekslerin jel içi aktivitesi. L929Balbc, daha önce tarif edildiği gibi Balb/cJ fare trombositlerinden mitokondrinin ρ°L929neo hücrelerine aktarılmasıyla laboratuvarımızda üretilen bir transmisyonondriyal hücre hattıdır40,41. BL6 fibroblastları, laboratuvarımızda bir BL6 faresinin kulak biyopsisinden üretilen ölümsüzleştirilmiş bir hücre dizisidir. (C) 3 g karaciğer (şerit 1) ve 1.1 g BAT (şerit 6) ile başlayan geleneksel bir yöntem veya burada sunulan ve tüm vakalarda yaklaşık 0.1 g doku ile başlayan protokol (şerit 2, karaciğer; şerit 3, kalp; şerit 4, beyin ve şerit 5 BAT) kullanılarak izole edilen fare mitokondrilerinden CI-IGA modelleri. (D) Fare karaciğeri, kalp, beyin ve BAT mitokondrisinde CIV-IGA paternleri (panel 2C, şerit 2-5'te gösterilen CI-IGA'dan sonra gerçekleştirilir). (E) Fare kültürlenmiş hücrelerinde ve karaciğerde analiz edilen CV-IGA aktivitesi. Şerit başına yaklaşık 60-75 μg mitokondriyal protein yüklendi. Kısaltmalar: IGA = jel içi aktivite; SC'ler = süper kompleksler; CI = kompleks I; BAT = kahverengi yağ dokusu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Şekil 3: Dalak örneklerinde farklı mitokondriyal komplekslerin ve süper komplekslerin WB immün tespiti. Dalak kontrolü (Dalak M9) ve tümör (Tümör M9) örneklerinden elde edilen mitokondriyal komplekslerin ve SK'lerin Blue Native PAGE ayrılmasından sonra, bunlar bir PVDF membranına aktarıldı ve belirtilen CI, CIII, CIV ve CII alt birimlerini tanıyan antikorlarla sıralı olarak hibritleştirildi (sırasıyla paneller AD). Şerit başına yaklaşık 50 μg mitokondriyal protein yüklendi. Yıldız işaretleri, önceki bir batı lekesinden kalan sinyali gösterir. Kısaltmalar: SC = süper karmaşık; CI = kompleks I; CIII = kompleks III; CIV = karmaşık IV; CII = karmaşık II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Şekil 4: Blue-Native PAGE tarafından yapılan SC analizindeki tuzaklar. Farklı çözündürme koşulları altında (A) taze fare karaciğerinden ve (B) donmuş sıçan karaciğerinden izole edilen mitokondrinin CI IGA analizi. (A) Şerit 1, yanlış jel gradyan konsantrasyonu (normal %3-13 yerine %8-13). Şeritler 2-4, numuneler yüklemeden önce buz üzerinde 10 dakika veya sırasıyla 37 °C ve 40 °C'de inkübe edilir. (B) Çözündürme için farklı digitonin / protein oranları kullanılarak donmuş sıçan karaciğerinden elde edilen mitokondri CI için IGA'dan sonraki model. Kısaltmalar: SC = süper karmaşık; SAYFA = poliakrilamid jel elektroforezi; CI = kompleks I; IGA = jel içi aktivite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Orta</td>
			<td colspan="3">Kompozisyon</td>
		</tr><tr><td>Hipotonik tampon</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS, 83 mM sükroz, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>Hipertonik tampon</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM sükroz, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>Homojenizasyon Tamponu A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sükroz, pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>Homojenizasyon Tamponu AT</td>
			<td colspan="3">225 mM mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM sükroz, %0.01 BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>Homojenizasyon Tamponu AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM sükroz, %0.02 BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>BN numune tamponu</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM İmidazol, 2 mM Aminokaproik asit, 1 mM EDTA pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>Digitonin çözümü</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM İmidazol, 5 mM Aminokaproik, 4 mM PMSF'de digitonin</td>
		</tr><tr><td>BN yükleme tamponu</td>
			<td colspan="3">0.75 M aminokaproik asit içinde% 5 Coomassie Blue G</td>
		</tr><tr><td>BN katot tamponu A</td>
			<td colspan="3">50 mM trisin, 15 mM Bis-Tris pH =7.0 (4 °C), %0.02 G-250 (Coomassie parlak mavi G-250)</td>
		</tr><tr><td>BN katot tamponu B</td>
			<td colspan="3">50 mM trisin, 15 mM Bis-Tris pH=7.0 (4 °C), %0.002 G-250</td>
		</tr><tr><td>BN anot tamponu</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7.0</td>
		</tr><tr><td>Kompleks I IGA substratı</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1 mg/mL NADH, 2.5 mg/mL Nitroblue Tetrazolium (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Kompleks II IGA substratı</td>
			<td colspan="3">50 mM Potasyum fosfat tamponu pH 7.4, 20 mM sodyum süksinat, 0.2 mM fenazin metosülfat (PMS), 2.5 mg/mL NBT</td>
		</tr><tr><td>Kompleks III IGA substratı</td>
			<td colspan="3">50 mM Potasyum fosfat tamponu pH 7.2, %0.05 diaminobenzidin (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Kompleks IV IGA substratı</td>
			<td colspan="3">CIII artı 50 μM sitokrom c ile aynı çözelti</td>
		</tr><tr><td>Karmaşık V IGA substratı</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM glisin pH 8.3, 14 mM MgSO4, %0.2 Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Boyama çözeltisi</td>
			<td colspan="3">@ metanol ve Asetik asit içinde %0,25'te Coomassie boyası R-250</td>
		</tr><tr><td>Leke çıkarma/sabitleme solüsyonu</td>
			<td colspan="3">@ Metanol, Asetik Asit</td>
		</tr><tr><td>Transfer tamponu</td>
			<td colspan="3">48 mM Tris, 39 mM Glisin, metanol</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Tamponlar ve ortam bileşimi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Hücre tipi/dokusu</td>
			<td>Başlangıç tutarı</td>
			<td>Beklenen verim (μg mitokondriyal protein)</td>
			<td>Şerit sayısı (50-60 μg/şerit)</td>
		</tr><tr><td>Kültürlenmiş hücreler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468 Serisi</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>143B'den türetilmiş</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fare Fibroblastları</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Kalp</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>İskelet kası</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Karaciğer</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Dalak</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150-250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>YARASA</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200-300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Beyin</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250-300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Farklı hücre tiplerinden ve fare dokularından beklenen mitokondri verimleri. Kalp veya iskelet kasından elde edilen mitokondriyal fraksiyonlar, diğer dokulardan elde edilenlere göre daha saftır. Böylece jellere daha küçük miktarlar yüklenebilir (*).

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Araştırmamız, mitokondriyal biyogenezi, özellikle de OXPHOS Sistem organizasyonunu ve Düzenlemesini daha iyi anlamaya ve ayrıca mitokondrinin kanserden nörodejeneratif bozukluklara kadar hastalıklarda oynadığı rolü tanımlamaya odaklanmıştır. Mitokondri, hücrede çok sayıda ve temel rol oynar, tüm metabolizmasını ve hayatta kalmasını şartlandırır. Mitokondriyal karmaşıklık ve bunun sağlık ve hastalıkta hücre adaptasyon mekanizmalarına katkısı hakkındaki bilgimizi yavaş yavaş artırıyoruz.OXPHOS sistemi için yeni bir organizasyon modeli, önceki önerileri entegre eden ve işlevini optimize etmek ve hücresel adaptasyonlara izin vermek için süper komplekslerin ve serbest komplekslerin farklı oranlarda bir arada bulunduğunu varsayan plastisite modeli oluşturulmasına katkıda bulunduk. Protokolümüz, küçük dokulardan veya hücre kültürü örneklerinden başlayarak, süper kompleksleri, montajı ve durumu ve işlevi mavi doğal elektroforez veya diğer tekniklerle analiz etmek için yeterli mitokondriyal protein miktarları elde etmeye izin verir. Bunu basit bir ekipmanla kısa sürede tekrarlanabilir şekilde ve nispeten düşük maliyetlerle yapabiliyoruz.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birlikte diferansiyel hızlı santrifüjleme kullanılarak insan yumurtalık kanseri dokularından mitokondriyi izole etme prosedürü açıklanmaktadır. İzole edilmiş mitokondri, insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteomunun proteomik analizi için kullanılabilir.

Mitokondriyal İzolasyon: İnsan Yumurtalık Kanseri Doku Örneğinden Mitokondriyi İzole Etme Tekniği

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Mitokondri bitki hücre sadece küçük bir yüzdesi olarak, onlar çalışmalar bir dizi için saf gerekir. Mitokondri bitki organları çeşitli Homojenizasyon, son derece saf mitokondriyal kesir elde etmek için Diferansiyel ve yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından takip tarafından ayrılmış olabilir.

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitokondri bakteriyel ve sitoplazmik karşılıkları ayrılmaktadır ribozomlara uzmanlaşmış. İşte nasıl mitoribosomes HEK hücreleri yerli onların kompartımanda elde edilebilir göstermektedir. Mitokondri süspansiyon hücrelerden yalıtım ve bunun sonucunda mitoribosomes arınma için yöntem içerir.

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

Öğrenin, küçük doku ve hücre kültürü örneklerinden mitokondri izolasyonu yaparak solunum süperkomplekslerini analiz etme yöntemini. Bu teknik, OXPHOS sistemi organizasyonu ve mitokondriyal biyogenez araştırmalarında kullanılır.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu

Daha fazla video keşfet