Kapasitif Biyosensör Kullanarak Dinamik Çok Parametreli Trombosit Fonksiyon Değerlendirmesi

Fizyolojik ortamlarda trombosit fonksiyonunu değerlendirmek, trombositleri bir membran kapasite sensörü ile yarı sert bir mikro ortamda aktive ederek mevcut testlerin sınırlamasını ele almak için bir test tasarlıyoruz. Test, trombosit sayısını, stimülasyon gücünü ve aktivasyon yollarını ölçer. Bu araç, hemostaz sırasında trombosit mekanizmalarını incelemek için kapsamlı bir yaklaşım sunar.

Protokolümüz, fizyolojik koşullar altında tek bir testte trombositin birden fazla parametresini değerlendirebilir. Bu protokolün iyileştirilmesine ve diğer hemostaz değerlendirme sensörlerinin geliştirilmesine odaklanacağız. El yazmasında açıklandığı gibi mikrofabrikasyon işlemi için dört inçlik bir silikon gofret alt tabakası için takım membran kapasitans çipinin veya MCC'nin düzenini tasarlamak için standart CAD düzen yazılımını kullanarak başlayın.

Biyo-işlevselleştirme için, TMCC'nin algılama elektrodunu oksijen plazması kullanarak 100 watt'ta 45 saniye boyunca temizleyin. TMCC'lerdeki numune kuyucuğuna 200 geçirmez etanol içinde bir Do Decanal çözeltisi ekleyin. TMCC'leri kuru nitrojenle dolu bir kaba koyun.

Kabı kapatın ve 24 ila 48 saat boyunca parafilm ile sarın. İki gün sonra, TMCC'nin altın yüzeyini deiyonize su ve 200 geçirmez etanol ile durulayın. TMCC'leri oda sıcaklığında nitrojen gazı ile kurutun.

PBS'deki insan fibronektin çözeltisini TMCC'nin örnek kuyucuğuna ekleyin ve iki ila sekiz saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kapasitans sensörü kurulumu için, sensörle elektrik teması kurmak için mikro konumlandırıcılara ve iğne problarına sahip bir LCR ölçer kullanın. TMCC ve BMCC'yi güvenli bir şekilde yerleştirmek için 3D baskılı plastik armatürler kullanın.

TMCC'yi BMCC üzerinde hassas bir şekilde hizalamak ve bir kapasitör oluşturmak için alt fikstürün XY ekseninde durdurucularla donatıldığından emin olun. Sekiz hertz örnekleme hızıyla 100 kilohertz'de 0,5 voltluk bir sinüzoidal sinyal uygulayın. Konsantre trombositten zengin plazma veya CPRP elde etmek için insan kan örneklerini santrifüjleyin.

CPRP'yi steril bir kaba aktarın ve trombosit sayımını yapın. İnhibitör çalışmaları için, CPRP'yi Tyrode tamponunda önceden tanımlanmış bir aspirin konsantrasyonu ile inkübe edin. Trombosit fonksiyonel tahlili için, TMCC ve BMCC'yi 3D baskılı fikstürlerde birleştirin.

Monte edilmiş MCC'lerin temel kapasitansını beş dakika boyunca ölçün, ardından TMCC'deki numune kuyucuğuna 45 mikrolitre CPRP ekleyin ve trombositlerin TMCC'deki fibronektin kaplı elektroda yapışmasına izin vermek için 30 dakika bekleyin. Daha sonra, yapışan trombositleri bozmadan numune kuyucuğundan 30 mikrolitre CPRP'yi çıkarın ve kuyucuğu Tyrode tamponu ile doldurun. Son yıkamadan sonra, istenen konsantrasyonda 10 mikrolitre agonist solüsyon ekleyin ve numuneyi 80 dakika boyunca dengeleyin.

Delta C yapışmasını belirlemek için 30 dakikalık yapışma sonrası kapasitanstaki maksimum değişikliği ölçün. Aktivasyon aşaması için, delta C aktivasyonu olarak adlandırılan kapasitanstaki maksimum değişikliği ölçün. S aktivasyonunu belirlemek için aktivasyondan 200 ila 300 saniye sonra kapasitans eğrisinin eğimini hesaplayın.

Gruplar arasındaki sonuçları karşılaştırmak için Tukey'in ameliyat sonrası testi ile varyans analizini kullanarak istatistiksel analiz yapın. Normal dağılımı test etmek için Shapiro-Wilk uyum iyiliğini kullanın. Önceden belirlenmiş bir trombosit sayısına sahip bir CPRP çözeltisi, yapışma sırasında kapasitansta doğrusal bir azalma gösterdi.

Trombin aktivasyonundan sonra üstel kararlı durum azalması gözlendi. Delta C adezyon değerleri, 1.3 milimol aspirin konsantrasyonunda önemli bir azalma ile bir dizi trombosit sayısı boyunca trombosit sayısı ile güçlü bir korelasyon gösterdi. Trombosit stimülasyonunu takiben kapasitanstaki üstel azalma oranı hücre konsantrasyonu ile artmıştır.

Kapasitans kaybının büyüklüğü de daha yüksek konsantrasyonlarla büyüdü ve delta C aktivasyonunda net bir artış eğilimi gösterdi. S aktivasyonu ve trombosit sayısı için de benzer bir eğilim gözlendi. Artan aspirin dozu ile kapasitans, delta C aktivasyonu ve S aktivasyonu azalma eğilimleri göstermiştir.

Yüksek ve orta dozlar arasında S aktivasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenirken, delta C aktivasyonunda anlamlı bir fark bulunmadı. Trombin ile aktive edilen CPRP örnekleri için kapasitans sinyalleri, artan trombin konsantrasyonu ile kapasitans azalmasının daha belirgin hale geldiğini gösterdi. Hem delta C aktivasyonu hem de S aktivasyonu, trombin seviyeleri ile istatistiksel olarak anlamlı bir eğilim sergiledi.