Name: Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: Keşfedin, insan iPSC-kökenli timus organoidlerini 3D fibrin hidrojellerde yetiştirme yöntemini. Bu protokol, timik epitel hücrelerinin olgunlaşmasını destekleyerek in vitro timopoiezisi kolaylaştırır ve otoimmünite araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>iPSC'den Türetilmiş Organoidlerle Timik Mikro Ortamın Yeniden Oluşturulması

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td> <td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klonu: 3D12; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Klonu: M5E2; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klonu: HIB19; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>Klonu: MG38; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klonu: HIT3a; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Klonu: 8G12; Seyreltme: 1: 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klonu: RPA-T4; Seyreltme: 1: 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>Klon: L200; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>Klonu: HI30; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: B159; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>Klon: DREG-56; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>Klon: FN50; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>APC</td><td>Klonu: M-T701; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD</td><td>Biosciences PeCy7</td><td>Klonu: RPA-T8; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klonu: HIT8a; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td> <td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klonu: HEA-125; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td> <td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>Klon: EBA-1; Seyreltme: 1: 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinojen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RÜTBE L</td><td>Biotechne R& D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu fibrin hidrojellerinde İnsan timus organoidlerinin oluşumu

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Protokolün iş akışı Şekil 4'te özetlenmiştir. Bu 3D organoid kültür modeli için, sağladığı fiziksel ve mekanik ipuçları sayesinde, daha önce ekibimiz tarafından birincil fare mTEC'lerini birkaç gün boyunca korumak için kullanılmış olan bir trombin ve fibrinojen hidrojeli benimsedik34. Polimerizasyondan sonra, jel gevşek, sünger benzeri bir ağ yapısı göstermelidir (Şekil 5).
İlk tohumlama ve bağlanma aşamasından sonra, organoidler hem yüzeyde hem de jelin en üst katmanları içinde aşamalı olarak büyüdü ve gelişti. Jel özelliklerine, tohumlama koşullarına ve jel üzerine ekilen organoidlerin sayısına bağlı olarak, organoidler dikdörtgen yapılar oluşturmak için küresel oluşturur (Şekil 6) ve bazen daha büyük yapılar oluşturmak için birleşir. Kültürün ilk haftasından sonra organoidler içinde organizasyonun iki özel alt seviyesi gözlendi: ilk olarak, organoidlerden ışınlanan ve hidrojeli her yöne kolonize eden büyük hücreler tarafından oluşturulan uzun, hücre yüzeyi projeksiyon benzeri yapıları gözlemledik (Şekil 6 ve Şekil 7). İkincisi, bu hücre projeksiyonları etrafında yoğunlaşan daha küçük hücreler tarafından oluşturulan küme benzeri yapıları gözlemledik. Çalışma hipotezini doğrulamak için her iki hücre tipini de izole edememiş olsak da, bu fenomen, timik hemşire hücre kompleksleri11 olarak bilinen çok sayıda çok daha küçük gelişmekte olan T hücresi ile bireysel cTEC'lerin etkileşimi ile oluşan timik korteks içinde bulunan 3D düzenlemeleri anımsatmaktadır (Şekil 8).
Organoid kültür fazı sırasında birkaç zaman noktasında, timik organoidlerin hücresel bileşimini akış sitometrisi ile değerlendirdik ve birkaç anahtar bölme tanımladık: TEC (EPCAM + CD45- olarak karakterize edilir), timositler (EPCAM- CD45 + CD3 +) (Şekil 9) ve ayrıca timik hematopoietik timosit olmayan alt kümeleri içeren bir EPCAM-CD45 + CD3- bölmesi. Daha fazla ayrıntı Provin ve ark.23'te bulunabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> Şekil 1: iPSC'den TEP'e farklılaşma karakterizasyonu. (A) D13'te iPSC'den TEP'ye farklılaşma örneği, ters faz kontrast mikroskobu, 400x. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) Nokta grafiği örneği, farklılaşmanın 14. gününde DAPI hücreleri arasındaki EPCAM+ hücrelerinin oranı, FlowJo 10.0.7'den görüntü. (C) DAPI (mavi), PAX9 (kırmızı) ve KRT8'e (yeşil), immünofloresan ve iPSC'nin 16. gününde TEP farklılaşmasına karşı konfokal görüntüleme. Beyaz oklar, anti-PAX9 boyama örneklerine işaret eder. Ölçek çubuğu: 50 μm (D) iPS'den TEP'ye farklılaşma sırasında FOXN1'in (RQ'dan GAPDH'ye) ifade seviyesi. TEC: Pozitif kontrol referansı, pediatrik timus örneklerinden izole edilen birincil insan TEC'leri. Prism'den grafik (GraphPad sürüm 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> Şekil 2: Hidrojel oluşumu, organoid tohumlama ve kültür ortamı dağılımı için deney düzeneği. (A) Üst ve alt sıralara yerleştirilmiş asma uçlara dökülmüş hidrojelli kültür plakası. (B) Organoid tohumlama: 1 organoid içeren kesilmiş pipet konisi, dokunmadan hidrojelin üzerine yerleştirilir ve organoid, jelin yüzeyine nazikçe tohumlanır. (C) Kültür ortamı, pipetin ucunun asılı ekin kolları arasına yerleştirilmesiyle kültür kuyusunda biriktirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> Şekil 3: Tohumlamadan önce timik organoid kültürün D0'ı (tam protokolün 13-15. günleri). (A) Lon71.019 iPS hattından türetilen TEC'lerle üretilen organoid. (B) MIPS203.003 iPS hattından türetilen TEC'lerle üretilen organoid. Ters faz kontrast mikroskobu, 1000x. Ölçek çubukları: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> Şekil 4: Protokolün tüm adımlarının özet gösterimi. Pediatrik timus örnekleri toplanarak ayrıştırıldı ve primer Lin-CD34+ CD7+ ETP'ler akım sitometrisi ile sıralandı. iPS hücrelerinin farklılaşması bir TEP kimliğine doğru gerçekleştirildi. ETP'ler ve iPS'den türetilen TEP'ler, düşük bağlayıcı 96 oyuklu plakalarda toplandı ve tohumlandı ve gece boyunca timik organoidler halinde toplandı. Fibrin hidrojeller aprotinin, fibrinojen ve trombinden hazırlandı ve asılı eklere döküldü. Polimerizasyondan sonra, organoidler hidrojellerin üzerine ekildi ve faz 1 kültür ortamı kuyucuklara eklendi. Organoidler 6 haftaya kadar kültürde tutuldu. BioRender'da oluşturulan, yayın lisansı AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> Şekil 5: Hidrojelin organizasyonu ve yapısı. Ters faz kontrast mikroskobu, 1000x. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> Şekil 6: Olgun organoidler ve üç boyutlu yapı. (A) 3D kültürün 24. gününde timik organoid, MIPS203.003 iPS hattı. (B) 3D kültürün 32. gününde bir timik organoidin kompozit görüntüsü, Lon71.019 iPS hattı. Ters faz kontrast mikroskobu. Ölçek çubukları: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> Şekil 7: Timik organoidlerin yapı detayı. (A) 3D kültürün 32. gününde timik organoid, L71.019 iPS hattı. (B) 3D kültürün 27. gününde timik organoid, L80.002 iPS hattı. Ters faz kontrast mikroskobu, 400x. Ölçek çubukları: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> Şekil 8: 3D kültürün 32. gününde bir timik organoidin yapı detayı. Beyaz oklar, TEC hücrelerinin yakınında çoğalan küçük timosit kümelerine işaret ediyor. Ters faz kontrast mikroskobu, 400x. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> Şekil 9: Timik organoidler içindeki T hücresi bölmesinin oranı. (A) Nokta grafiği örneği, 3D kültürün 35. gününde timik organoidlerdeki canlı (DAPI-) hücreler içindeki CD45+ CD3+ hücrelerinin oranı, FlowJo 10.0.7'den görüntü. CD45+ CD3- fraksiyonu, hematopoietik timosit olmayan hücreleri içerir. (B) 3D kültürün 17, 24/25, 32 ve 39/40. günlerinde timik organoidlerdeki canlı hücreler içindeki CD45+ CD3+ hücrelerinin oranı, teknik çift veya üçlü kopyada n=2, Prism'den grafik (GraphPad sürüm 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Birim</td>
			<td>Aşama 1 orta Gün 14'ten 18. güne kadar</td>
			<td>Aşama 2 orta Gün 19'dan itibaren</td>
		</tr><tr><td>Taban</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4 Serisi</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10 Serisi</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF (Türkçe)</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RÜTBE L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCF</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Glutamax (Glutamaks)</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Takviyeler ve ilgili konsantrasyonları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Aprotininin (μL)</td>
			<td>Trombin (μL)</td>
			<td>Fibrinojen (μL)</td>
			<td>Faz 1 ortamı</td>
			<td>Organoidler (birim)</td>
		</tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 ila 5</td>
		</tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8 ila 9</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: 6, 12 ve 24 oyuklu plakalarda hidrojellerin hazırlanması ve organoidlerin tohumlanması için gerekli bileşen oranları.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.

Thymus Kültürler Reaggregate

Medüller timik epitel hücrelerinin in vitro olarak incelenmesi, mevcut 2D kültür sistemleri in vivo senaryoyu taklit etmediği için büyük ölçüde başarısız olmuştur. Burada tarif edilen 3D kültür sistemi - modifiye edilmiş bir cilt organotipik kültür modeli - mTEC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve rastgele gen ekspresyonunun sürdürülmesini özetlemede üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Bu video, FACS izolasyonu için timik epitel hücrelerini (TEC'ler) yoğunluk gradyanı ile zenginleştirmek için bir protokol göstermektedir. Ayrıca, TEC agrega oluşumunu teşvik etmek için EAK16-II/EAKIIH6 peptitlerinin kullanımını da gösterir. EAK16-II/EAKIIH6 hidrojelin mikro ortamları, TEC'lerin hayatta kalmasını ve işlevini sürdürmek için gerekli 3 boyutlu konfigürasyonu sağlar.

EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Keşfedin, insan iPSC-kökenli timus organoidlerini 3D fibrin hidrojellerde yetiştirme yöntemini. Bu protokol, timik epitel hücrelerinin olgunlaşmasını destekleyerek in vitro timopoiezisi kolaylaştırır ve otoimmünite araştırmalarına katkı sağlar.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Daha fazla video keşfet