Name: Retrobulbar Sinüs Enjeksiyonu ile Doğum Sonrası, Juvenil ve Runted Yetişkin Fareler için Sistemik Tedavi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Öğrenin, retrobulbar sinüs enjeksiyonu yöntemiyle gen tedavisi araştırmalarında küçük ve juvenil fareler için sistemik tedavi protokolü nasıl uygulanır. Bu teknik, metabolik bozuklukların tedavisinde yeni terapilerin geliştirilmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NHGRI fare tesisi personelinin, NCI Moleküler Patoloji Laboratuvarı'nın ve özellikle Andrew Warner'ın yardımını takdir ediyoruz. R.J.C., 1ZIAHG200318-16 aracılığıyla NHGRI'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir ve bu çalışma kısmen Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 2C , BioRender ile oluşturulmuştur.

Bu protokol ve beraberindeki video, retrobulbar sinüs enjeksiyonu ile doğum sonrası, juvenil ve koşmuş yetişkin farelerin retrobulbar enjeksiyon alanı içindir; Protokol, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından G-03-4 protokol numarası altında onaylanmıştır. Diğer kurumların farklı gereksinimleri ve kısıtlamaları olabilir ve bu protokolün enstitünüzde onaylanması için değiştirilmesi gerekebilir. Bu veya başka herhangi bir hayvan prosedürünü gerçekleştirmeden önce kurumunuzun ACUC'undan onay alın.
1. Enjeksiyon öncesi hazırlık
<ol><li>AAV'yi, her enjeksiyon için steril 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile istenen enjeksiyon hacmine ve konsantrasyonuna seyreltin. Tek kullanımlık steril şırınganın doğru şekilde doldurulmasını sağlamak için her enjeksiyon için ekstra %50 hacim ekleyin. NOT: Burada, 50 μL'lik bir hacimde vücut kütlesinin kg'ı (vg/kg) başına 1 ×10 13viral genomdan oluşan bir doz vermek için bir AAV8-CAG-eGFP raportörünü seyreltiyoruz. Enjekte edilecek 50 μL'deki AAV miktarı, hayvanın enjeksiyon sırasındaki ağırlığı kullanılarak hesaplanır. Bu videoda, insanlarda sistemik doğumu çoğaltmak için AAV retrobulbar yolu ile enjekte edilmektedir. Diğer gen terapisi vektörleri (ör., lentivirüs, adenovirüs), RNA terapileri ve küçük moleküller bu prosedür kullanılarak sistemik olarak verilebilir.</li>
	<li>Masa üstü laboratuvar hayvanı anestezi sisteminin (LAAS) üreticinin talimatlarına uygun olarak doğru şekilde kurulduğundan ve doğru şekilde çalıştığından emin olun. NOT: Alternatif bir anestezi yöntemi kullanılıyorsa, enjeksiyonlara başlamadan önce anestezinin hazırlandığından emin olun. Retrobulbar enjeksiyon prosedürü çoğu anestezi ile uyumlu olmalıdır (ör., ketamin ve ksilazin gibi enjekte edilebilir bir kimyasal kısıtlama).</li>
	<li>Tek kullanımlık steril şırıngayı doldurmadan önce (burada, 31 G, 8 mm uzunluğunda, 3/10 mL kapasiteli bir insülin şırıngası), pistonun düzgün bir şekilde bastırılabilmesini sağlamak için pistonu birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Ardından, hava kabarcığı olmadığından emin olarak şırıngayı istenen hacme kadar doldurun. NOT: 150 μL'ye kadar olan hacimler enjekte edilebilir; laboratuvarımız tipik olarak 50 μL'lik bir hacim enjekte eder.</li>
</ol>2. Laboratuvar hayvanı anestezi sistemi (LAAS) ile izofluran gazının uygulanması yoluyla fare sedasyonu
<ol><li>Gazın yalnızca indüksiyon odasına aktığından emin olun. İki yönlü vanayı yeniden solumayan (NRB) devreye kapatın.</li>
	<li>1 L/dk'lık bir akış hızı olacak şekilde akış ölçerin ön tarafındaki yeşil oksijen akış düğmesini açın.</li>
	<li>Buharlaştırıcının üst kısmındaki kola basarak ve kadranı istenen konsantrasyona çevirerek izofluranı %≤4'e çevirin.</li>
	<li>Fareyi şeffaf indüksiyon odasına yerleştirin. Hayvanın nefes almasını ve hareketini dikkatlice izleyin. Hayvan yaslandıktan sonra, buharlaştırıcı düğmesini izofluranın %2-2,5'ine kadar çevirin.</li>
	<li>Yüz maskesine bağlı NRB devresine giden iki yönlü vanayı açın ve indüksiyon kutusuna giden gaz akışını kapatın.</li>
	<li>Hayvanı çıkarın ve NRB devresinin yüz maskesine yerleştirin.</li>
	<li>İzofluran konsantrasyon ayarını, uyaranlara reaksiyonla belirlendiği gibi% 1.5 -% 1.75'e düşürün (örneğin, ayak parmağını kıstırma veya pençe sıkma).</li>
	<li>Farenin solunumunu ve mukoza zarı rengini her zaman sürekli olarak izleyin (mümkünse). Hayvanın nefes alması zorlaşırsa veya mukoza zarı rengi pembe değilse, anestezik konsantrasyonu azaltın.</li>
	<li>Tüm prosedür boyunca hayvanı sıcak tutun. Alt pedin altına yerleştirilmiş ve doğrudan farenin altına yerleştirilmiş bir kağıt havluya sarılmış bir el ısıtıcısı kullanın.</li>
	<li>İşlem tamamlandıktan sonra oksijeni ve buharlaştırıcıyı kapatın.</li>
</ol>3. Hayvanın enjeksiyonu
<ol><li>Sağ elini kullanıyorsanız, farenin sağ gözünü enjekte edin ve fareyi, burnu sağ ele bakacak şekilde sol tarafına yerleştirin. Sol elini kullanıyorsanız, farenin sol gözünü enjekte edin ve fareyi, burnu sol ele bakacak şekilde sağ tarafına yerleştirin.</li>
	<li>Enjekte edilecek olan göz küresine bir veya iki damla oftalmik anestezik uygulayın. Ardından, steril bir emici gazlı bez kullanarak fazla oftalmik anestezik solüsyonu çıkarın. Farenin göz küresini yuvadan kısmen dışarı çıkarmak için parmak uçlarınızla cilde, sırta ve ventral göze hafif bir baskı uygulayın (Şekil 2A,B). NOT: Gözü dışarı çıkarırken çevredeki servikal damarlara aşırı basınç uygulamamaya dikkat edin, çünkü bu kan akışını ve enjeksiyonu engelleyecektir. Ek olarak, trakeaya baskı uygulamak farenin nefes almasını engelleyebilir. Farenin prosedür boyunca nefes alabildiğinden emin olun.</li>
	<li>İğneyi yaklaşık 30°'lik bir açıyla eğim aşağı pozisyonda tutun ve medial kantusun içine yerleştirin (Şekil 2C). NOT: Retrobulbar sinüse ulaşmak için iğne yerleşiminin derinliği, hayvanın boyutuna bağlı olarak değişecektir. Enjeksiyon sırasında iğnenin eğim aşağı pozisyonda olması oküler hasar riskini azaltır. İğneyi çok derine yerleştirmemeye ve göz yuvasını delmemeye dikkat edin. Enjeksiyon bir dakikadan az sürmelidir.</li>
	<li>Enjeksiyonu iletmek için şırınga pistonuna yavaş ve yumuşak bir şekilde basınç uygulayın. Bu, ekstravazasyon olasılığını azaltacaktır.</li>
	<li>İğneyi yavaş ve düzgün bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Anesteziden kurtulmayı sağlamak için yüz maskesini fareden çıkarın.</li>
</ol>4. Enjeksiyon sonrası
<ol><li>İşlem tamamlandıktan sonra oksijeni ve buharlaştırıcıyı kapatın.</li>
	<li>Artık kanama meydana gelirse kanı çıkarmak için steril gazlı bez kullanın.</li>
	<li>Anesteziden iyileşme sırasında hipotermiyi önlemek için farenin sıcak bir alanda (yaklaşık 37 °C), ancak aşırı sıcak olmadığından emin olun.</li>
	<li>Fareyi kafese ve rafa geri koymadan önce tamamen iyileşene kadar fareyi izolasyonda gözlemleyin. NOT: Kurtarma sırasında fareyi izole etmek, kafes ilişkilerinin kurtarma sırasında sedasyonlu fareye zarar vermesini önler.</li>
</ol>

Retrobulbar Enjeksiyon Tekniği Kullanılarak Farelerde Etkili Sistemik Dağıtım

<ol><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Samelson-Jones, B. J., George, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia.</a> Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+for+methylmalonic+acidemia+using+the+novel+adeno-associated+viral+vector+44.9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+aav9+gene+therapy+improves+the+lifespan+of+mice+with+niemann-pick+disease%2C+type+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1.</a> Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).</li>
<li>Venturoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+advantage+of+corrected+hepatocytes+in+a+juvenile+model+of+methylmalonic+acidemia+following+liver+directed+adeno-associated+viral+mediated+nuclease-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing.</a> Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).</li>
<li>Ilyinskii, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immtor+nanoparticles+enhance+aav+transgene+expression+after+initial+and+repeat+dosing+in+a+mouse+model+of+methylmalonic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).</li>
<li>Davidson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+systemic+aav+gene+therapy+with+a+neurotrophic+capsid+in+niemann-pick+disease+type+c1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice.</a> Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040(2021).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+using+an+aav44.9+vector+rescues+a+neonatal+lethal+mouse+model+of+propionic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).</li>
<li>Rocha-Ferreira, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+rodent+model+of+retroorbital+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A neonatal rodent model of retroorbital vein injection.</a> J Vis Exp. (204), e65386(2024).</li>
<li>Bohnert, B. N., Artunc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nephrotic+syndrome+in+mice+by+retrobulbar+injection+of+doxorubicin+and+prevention+of+volume+retention+by+sustained+release+aprotinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin.</a> J Vis Exp. (135), e57642(2018).</li>
<li>Bohnert, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+sinus+injection+of+doxorubicin+is+more+efficient+than+lateral+tail+vein+injection+at+inducing+experimental+nephrotic+syndrome+in+mice%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study.</a> Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).</li>
<li>Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).</li>
<li>Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+response+to+restraint+stress+by+salivary+corticosterone+levels+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice.</a> J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).</li>
<li>Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+routes+of+antibody+administration+in+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies.</a> Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aav+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
</ol>

Yazarların bu yayınla ilgili ifşa edecekleri hiçbir şey yoktur.

Retrobulbar enjeksiyonu, küçük moleküller, proteinler ve genomik tedaviler sağlamak için güvenilir bir yöntem olsa da, güvenilir ve tekrarlanabilir sistemik iletimin elde edilmesini sağlamak için tekniğin bir boya ile uygulanması gereklidir. Deneylerde bu dağıtım yolunu kullanmadan önce farelerde retrobulbar enjeksiyonları uygulamak için bir boya kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Tutarlı sistemik iletimi sağlamak için boyalar fare dokularında görsel olarak kontrol edilebilir.
Retrobulbar enjeksiyon tekniğinin gösteriminde, işlemden önce fareleri uyuşturmak için izofluran gazı kullanıldı. İşlemden önce diğer anestezi formları kullanılabilir, ancak enjeksiyon tamamlanmadan farenin sedasyondan kurtulmamasını sağlamak önemlidir. Neyse ki, gerçek enjeksiyon genellikle bir dakikadan az sürer ve farenin tamamen uyuşturulması gereken süre kısadır. Enjeksiyon sırasında fare tamamen yatıştırılmalı ve enjeksiyondan önce fare bilinçlenirse anestezi yeniden uygulanmalıdır. Anestezi kullanımıyla ilişkili riskler olduğundan, farenin sedasyon altında kalma süresi en aza indirilmelidir. Metilmalonik ve propiyonik asidemiyi olan küçük hasta fareleri yatıştırmak için izofluran kullanırken sorun yaşamadık. Bununla birlikte, bazı fare modelleri sedasyona ve belirli anesteziye karşı daha hassas olabilir. Bu potansiyel sorun, bir çalışmada sedasyon kullanmaya çalışmadan önce göz önünde bulundurulmalıdır. Son olarak, sedasyonun retrobulbar enjeksiyonu ile birlikte kullanılması, sedasyonun yaygın olarak kullanılmadığı TVI'ye kıyasla, farenin enjeksiyon işlemi sırasında sergilediği belirgin sıkıntıyı büyük ölçüde azaltır.
Enjeksiyon sonrası ile ilgili herhangi bir sorun gözlemlemedik, ancak enfeksiyon herhangi bir enjeksiyonda potansiyel bir risktir. Enfeksiyon olasılığını azaltmak için, saflaştırılmış AAV'yi seyreltmek için steril tek kullanımlık tek kullanımlık bir şırınga ve steril PBS kullanılır. Hayvan tesisimizdeki tüm fareler, potansiyel sağlık sorunlarının belirtileri açısından günlük olarak kontrol edilir ve gerektiğinde herhangi bir sağlık sorununu ele almak için veteriner bakımı alır.
Retrobulbar sinüs enjeksiyonunun alternatifi ve genç ve yetişkin farelere daha yaygın olarak kullanılan sistemik uygulama yöntemi TVI'dir. TVI ve retrobulbar sinüs enjeksiyonu, küçük moleküller ve antikorlar durumunda benzer bir biyolojik dağılıma neden olur ve ekstrapolasyon yoluyla, viral vektörler için de aynısı beklenir15,16. Bununla birlikte, literatürde gen tedavisi vektörlerinin TVI ve retrobulbar sinüs enjeksiyonu ile sistemik iletimini karşılaştıran hiçbir örnek bulunamamıştır. Kanımızca, retrobulbar sinüs enjeksiyonlarının büyüme fenotipi azalmış ve/veya erken ölümcüllüğü olan farelerde uygulanması daha kolaydır.
TVI'nin genellikle insanlarda sistemik doğuma daha benzer olduğu düşünülür, ancak insanlarda retrobulbar sinüse sahip olmasına rağmen kuyruğu yoktur. Bir açıdan, retrobulbar sinüs enjeksiyonu, enjekte edilen maddenin üst venöz sisteme, bir enjekte edicinin periferik olarak yerleştirilmiş bir merkezi kateter (PICC Hattı) veya kola yerleştirilen intravenöz bir kateter ile bir insana verilmiş gibi girdiği insan sistemik doğumuna benzer. Tersine, enjekte edici, kuyruk ven enjeksiyonundan sonra bir farenin alt venöz sistemine girer. Ne yazık ki, bu yöntemlerin hiçbiri insanlarda sistemik doğum için kullanılan yöntem(ler)i tam olarak kopyalamaz, ancak her ikisi de farelerde etkili sistemik doğum yöntemleridir.

Genetik hastalıkların murin modelleri, küçük moleküllü, genetik ve hücre tedavilerinin etkinliğini göstermek için yaygın olarak kullanılmaktadır1. Farelerde, insanlara sistemik doğumu çoğaltmak için en yaygın kullanılan yöntem, damarın erişebilecek kadar büyük olmasını sağlamak için tipik olarak yetişkin farelerde yaklaşık 6-8 haftalıkken gerçekleştirilen kuyruk damarı enjeksiyonudur (TVI). TVI, gen terapisi için insan klinik denemelerini destekleyen hemofili gibi genetik hastalıkların çok sayıda klinik öncesi prensip kanıtı çalışmasında başarıyla kullanılmıştır2. Bununla birlikte, genetik hastalığın birçok murin modeli, yetişkin bir farenin yaşına veya boyutuna ulaşmalarını engelleyen büyüme ve/veya erken ölümcüllük fenotiplerine sahiptir (Şekil 1). Bu tür fareleri TVI ile tedavi etmek, ölümcüllük yaşına ve / veya hayvanların ulaşabileceği maksimum boyuta bağlı olarak imkansız olmasa da son derece zor olabilir.
Buna karşılık, bir terapötik ajanın retrobulbar (sıklıkla ve yanlış olarak retro-orbital olarak adlandırılır) sinüs enjeksiyonu ile sistemik olarak verilmesi, yaş veya boyut3'ten bağımsız olarak farelerde oldukça kolay bir şekilde yapılabilir. Adeno-ilişkili virüsün (AAV) retrobulbar enjeksiyonları, metilmalonik asidemi (MMA) ve Niemann-Pick tip C hastalığı 4,5,6,7,8 gibi genetik hastalığın genç büyüme geriliği murin modellerinde başarıyla kullanılmıştır. (Bu prosedür aynı zamanda yenidoğanlara 3,4,9,10 enjekte etmek için de kullanılabilir; ancak, bu teknik bu protokolde veya beraberindeki videoda ayrıntılı olarak açıklanmamıştır.) Doksorubisin gibi yüksek derecede toksik maddeler bile retrobulbar enjeksiyonu11,12 ile güvenli bir şekilde verilebilir. TVI'den farklı olarak, retrobulbar sinüs enjeksiyonları sırasında fareler uyuşturulur, bu da prosedürü fare üzerinde daha az stresli hale getirir ve fareyi fiziksel olarak kısıtlamak zorunda olmayan operatör için daha kolay hale getirir13,14. Ek bir endişe, TVI'nin kuyruk damarını genişletmek için sıklıkla bir ısı lambası kullanmasıdır, bu da genç farelerde potansiyel olarak dehidrasyona neden olabilir ve ısıya bağlı strese daha şüpheli olan genetik hastalığın murin modellerinde sorunlu olabilir. TVI kullanırken ortaya çıkabilecek bir diğer sorun, kuyruk damarının yüksek pigmentli farelerde görüntülenmesinin özellikle zor olabilmesidir. Bununla birlikte, TVI gibi, retrobulbar sinüs enjeksiyonları da geniş bir sistemik biyodağılımile sonuçlanır 15,16.

<table><tbody><tr><td>AAV8-CAG-eGFP</td><td>Univ. Penn. Vektör Çekirdeği</td><td>AAV</td><td>muhabirleri ve alternatif AAV muhabirleri için özel sipariş alternatif kaynakları mevcuttur</td></tr><tr><td>Bariyer (Filtre) Uçları, 20 &mu; Enjeksiyon</td><td>hacmini ve konsantrasyonunu azaltmak için AAV'yi seyreltmek için</td>L boy <td>ThermoFisher</td><td>AM12645</td></tr><tr><td>Bariyer (Filtre) Uçları, 100 &; L boyutu (steril)</td> <td>ThermoFisher</td><td>AM12648</td>, <td>AAV'yi seyrelterek enjeksiyon hacmini ve konsantrasyonunu azaltır</td></tr><tr><td>Dual Prodedure Circuit&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>921400</td><td>alternatif anestezi yöntemi kullanılabilir</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipet</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>enjeksiyon hacmini ve konsantrasyonunu azaltmak için AAV'yi seyreltmek için</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic&nbsp; Enjeksiyon</td><td>hacmini ve konsantrasyonunu azaltmak için AAV'yi seyreltmek için</td>P100 pipet <td>Gilson</td><td>F123615</td></tr><tr><td>El ısıtıcıları (HOTHANDS)</td>Anestezi <td>uygulanırken fareyi sıcak tutmak için</td> <td>ULINE</td><td>S-1497B</td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları, 31 G,&nbsp; 8 mm uzunluk, 3/10 mL kapasite</td><td>Videoda kullanılan Becton Dickson</td><td>328438</td><td>; enjeksiyon başına bir şırınga</td></tr><tr><td>İzofluran (Fluriso)</td><td>VETONE</td><td>502017</td><td>alternatif anestezi kullanılabilir</td></tr><tr><td>Medline Protection Plus Tek Kullanımlık Alt Pedler</td><td>ThermoFisher</td><td>23-666-062</td>, <td>fareyi enjeksiyon sırasında yerleştirmek için</td></tr><tr><td>Oak Ridge Flebotomi Şeffaf Kapaklı Keskin Uçlu Konteyner</td><td>ThermoFisher</td><td>22-730-434</td><td>iğne imhası için</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>AAV'yi istenen konsantrasyon ve hacimde seyreltmek için</td></tr><tr><td>Yaylı Kapaklı Düşük Tutma Mikrosantrifüj Tüpleri (steril)</td><td>ThermoFisher</td><td>3451</td>, <td>enjeksiyon hacmini ve konentrasyonu azaltmak için AAV'yi seyreltmek için</td></tr><tr><td>Steril gazlı bez sünger 4"x"4</td><td>Covidien</td><td>3033</td><td></td></tr><tr><td>Trekain Hidroklorür Oftalmik (%0,5)</td><td>Ocenanside Pharmaceuticals</td><td>AK102D5DS</td><td>lokal&nbsp; anestezik</td></tr><tr><td>27.0 G (veya daha küçük) olan tüberkülin şırıngası</td> Herhangi <td></td><td>Videoda</td><td>kullanılan insülin şırıngasına bir alternatif</td></tr><tr><td>VetEquip' Masa üstü ve mobil Laboratuvar Hayvanları Anestezi Sistemi için Kullanım Kılavuzu ve Kullanım Kılavuzu.</td><td>VetEquip</td><td>chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf</td><td>kullanım kılavuzu ve kılavuzuna bağlantı</td></tr></tbody></table>

retrobulbar sinüs enjeksiyonu ile doğum sonrası, juvenil ve runted yetişkin fareler için sistemik tedavi

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

Kuyruk ven enjeksiyonları erişkin farelerde sistemik bir doğum yolu olarak sıklıkla kullanılırken, retrobulbar enjeksiyonlar daha az sınırlama ile sistemik doğum için alternatif bir yöntemdir. İlk olarak, kuyruk damarı enjeksiyonları (TVI'ler), kuyruk damarının boyutunun erişim için uygun olduğu yetişkin farelerle sınırlıdır. Yetişkin fareleri tedavi etmekle sınırlı olmak, yetişkinliğe kadar hayatta kalamayan fare modelleriyle uğraşırken sorunlu olabilir. İkincisi, TVI'ler, farelerin hiçbir zaman yetişkin vahşi tip farelerin boyutuna ulaşmadığı büyüme geriliği fenotiplerine sahip fare modelleri için uygun değildir. Bu nedenle, retrobulbar enjeksiyonlar hem genç hem de küçük yetişkin fareleri tedavi etmek için başarıyla kullanılabilir. Son olarak, retrobulbar enjeksiyonlar anestezi altında gerçekleştirilir, bu da fareler üzerinde genellikle anestezi olmadan gerçekleştirilen TVI'lere göre daha az streslidir. Bu makale, küçük ve genç farelere sistemik uygulama için kullanılabilecek retrobulbar enjeksiyonlar için bir protokol ve ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Retrobulbar sinüs enjeksiyonu, küçük molekülleri, antikorları ve adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak iletmek için başarıyla kullanılmıştır4,5,9,15,16. Şekil 3'te, PBS (araç) ile tedavi edilen bir farenin karaciğeri ve AAV8 ile tedavi edilen bir fare karaciğeri, bir retrobulbar enjeksiyonu takiben AAV enjeksiyonu ve ekspresyonunun bir örneği olarak gösterilmiştir. AAV8, doğal olarak oluşan birçok AAV vektörü gibi, karaciğer trofiktir. Bu nedenle, sistemik dozu 5 ×10 12vg / kg17 alan bir farede önemli karaciğer transdüksiyonu beklenmektedir. Şekil 3'te görülen ve AAV transgeni tarafından eksprese edilen metilmalonil-CoA mutaz (MMUT) RNA'sını eksprese eden çok sayıda hepatosit, başarılı bir retroorbital enjeksiyonu gösterir.
<img alt="Propiyonik asidemi ve vahşi tip fare karşılaştırması, ağırlık farkı, 4 hafta, araştırma sonucu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: Propiyonik asidemisi olan büyüme geriliği olan bir fare. Bu, genetik hastalığın fare modellerinde ortaya çıkabilecek aşırı büyüme geriliğine bir örnektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Fare gözü enjeksiyon işlemi; Diyagram, laboratuvar deneyinde oküler enjeksiyon kurulumunu göstermektedir." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: Retrobulbar sinüs enjeksiyonunun görüntüleri ve diyagramı. (A) Göz küresini dışarı çıkarmak için kürk üzerine parmak yerleşiminin görüntüsü (beyaz okla gösterilir). (B) İğne yerleştirme ve enjeksiyondan önce kürk üzerine aşağı doğru basınç uygulandıktan sonra göz küresi (beyaz okla gösterilir) çıkıntısının görüntüsü. (C) İğne eğim oryantasyonu (göz küresine göre aşağı eğim), iğne açısı (30°) ve retrobulbar sinüs iğnesi yerleştirme diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Mikroskop görüntüsü, hücresel yapı analizi; immünohistokimya; protein ekspresyon tespiti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: AAV8 ile retrobulbar sinüs enjeksiyonu sonrası RNA in situ hibridizasyonu. (A) 10x araçla tedavi edilen karaciğer, (B) 10x AAV8 ile tedavi edilen karaciğer, (C) 20x araçla tedavi edilen karaciğer ve (D) MMUT RNA için boyanmış 20x AAV8 ile tedavi edilen karaciğerin görüntüleri. Metilmalonik asidemili fareler, 1 aylıkken 5 ×10 12 vg / kg AAV8-LPS-MMUT dozu veya bir araç kontrolü (PBS) ile tedavi edildi. Tedaviden 1 ay sonra karaciğer dokusu toplandı. MMUT (Türkçe ) RNA kahverengi lekeli (siyah oklar pozitif boyama alanlarını gösterir). Karaciğer hematoksilen ile boyanmış. Ölçek çubukları = 100 μm görüntüler için 10x, 20x görüntüler için 50 μm (B). Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; LPS = Karaciğere özgü promotör; MMUT = metilmalonil-CoA mutaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu makale, doğum sonrası, juvenil ve koşmuş yetişkin fareler için toplam hacmi 150 μL'ye kadar retrobulbar sinüs enjeksiyonu için bir protokol ve eşlik eden bir video sağlar. Bu prosedür, kuyruk damarı enjeksiyonunun mümkün olmadığı durumlarda küçük farelerin (15 g) enjeksiyonu için özellikle uygundur.

Retrobulbar Sinüs Enjeksiyonu ile Doğum Sonrası, Juvenil ve Runted Yetişkin Fareler için Sistemik Tedavi

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

systemic-treatment-for-postnatal-juvenile-runted-adult-mice

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Pediatrik hastalığın hayvan modelleri erken başlangıçlı ve agresif hastalığın ilerlemesini yaşayabilirsiniz. Klinik genç fare modelleri ile ilgili tedavi teslimat teknik olarak zor olabilir. Bu protokol, yaşamın ilk iki doğum sonrası gün içinde yeni doğmuş fareler için invazif olmayan bir damar içi enjeksiyon yöntemi tarif etmektedir.

Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar

Burada, viral partiküllerin veya floresan mikroboncukların yenidoğan fare beynine intraserebroventriküler ve intravasküler enjeksiyonu için basit bir yöntemi açıklıyoruz. Virüs ve nanopartiküllerin lokalizasyon paterni, mikroskobik değerlendirme veya in situ hibridizasyon ile tespit edilebilir.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

Subretinal enjeksiyonlar, proteinler ve viral vektörler gibi büyük terapötik ajanları fotoreseptörlere ve retina pigment epiteline iletmek için en yaygın tekniktir. Farelerde, minimum ikincil hasar ve hızlı iyileşme süreleri ile subretinal boşluğu başarılı bir şekilde hedefleyen alternatif bir yöntem burada açıklanmaktadır.

Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi<i&gt; yoluyla</i&gt; Bir transkleral Posterior Yaklaşım

Burada, 129S1/SvImJ farelerde deneysel Nefrotik sendromda indüksiyon doksorubisin hızlı retrobulbar enjeksiyonu ile açıklayın. Ayrıca Nefrotik fareler sürekli yayın granül içeren aprotinin idrar serin proteaz aktivitesi inhibe ve sodyum saklama önlemek için tedavi ediyoruz.

Doksorubisin Retrobulbar enjeksiyon ve Önleme Birimi kalıcılık tarafından sürekli yayın Aprotinin farelerde Nefrotik sendromda indüksiyon

Bu protokol, doğum sonrası yaşlarda yenidoğan sıçanlarda hücrelerin alt popülasyonlarına somatomotor kortekse anterograd kemogenetik modifiye edici ve servikal omuriliğe retrograd taşınabilir bir Cre rekombinaz enjekte ederek gen terapileri uygulamak için yeni bir yöntem göstermektedir.

Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi

Bu protokol, yenidoğan dönemi boyunca sıçanlarda ve farelerde kullanılabilecek tekrarlanabilir bir venöz uygulama yolunu göstermeyi amaçlamaktadır. Bu prosedür, öncelikle intravenöz uygulama kullanarak yenidoğan bakım ünitelerinde ilaç uygulamasını yansıtmak isteyen klinik öncesi kemirgen çalışmaları için önemlidir.

Retroorbital Ven Enjeksiyonunun Yenidoğan Kemirgen Modeli

Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi

Drosophila oogenezi, mitokondriyal proliferasyon ve kalıtım çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor. Bu el yazması, Drosophila yetişkin yumurtalıklarındaki replikasyon yapan mitokondriyal DNA'yı (mtDNA) 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketlemek için kullanılan ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır, bu da daha önce tartışmalı olan mitokondriyal kalıtımla ilişkili mekanizmaların ortaya çıkarılmasını kolaylaştırmaktadır.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Öğrenin, retrobulbar sinüs enjeksiyonu yöntemiyle gen tedavisi araştırmalarında küçük ve juvenil fareler için sistemik tedavi protokolü nasıl uygulanır. Bu teknik, metabolik bozuklukların tedavisinde yeni terapilerin geliştirilmesine olanak tanır.

Retrobulbar Sinüs Enjeksiyonu ile Doğum Sonrası, Juvenil ve Runted Yetişkin Fareler için Sistemik Tedavi

Daha fazla video keşfet