Name: Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin, çok hücreli sferoid üretim yöntemlerini FLIM mikroskobu ile hücre metabolizması ve oksijen dağılımı analizi için nasıl kullanacağınızı. Bu teknik, 3D canlı hücre görüntülemede metabolik biyobelirteçleri incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ghent Üniversitesi'nin Özel Araştırma Fonu (BOF) hibeleri ile desteklenmiştir (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Flanders Araştırma Vakfı (FWO, I001922N) ve Avrupa Birliği, fliMAGIN3D-DN Ufuk Avrupa-MSCA-DN No. 101073507.

FLIM Tabanlı Metabolik ve Hipoksi Analizi için Çok Hücreli Spheroid Oluşumu

Açıklanacak bir şey yok.

Çok hücreli sferoidler, tümör ve kök hücre niş mikro çevreleri, ilaç keşfi ve biyofabrikasyon için 'doku yapı taşlarının' geliştirilmesi çalışmalarında tercih edilen bir yöntem haline gelmektedir. Sferoidlerin heterojen iç mimarisi, besin gradyanları ve oksijenasyon, nispeten basitleştirilmiş ve erişilebilir bir ortamda in vivo doku ve tümörlerinkini taklit edebilir. Daha fazla metodolojik şeffaflığa 26,28 ve standardizasyona71 ihtiyaç duyulduğunda, bu protokollerin araştırmacıların canlı kantitatif floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu deneyleri için en iyi sferoid oluşum yöntemini seçmelerine yardımcı olması beklenmektedir. Sunulan yöntemler, hücre boyama nanopartikül sensörlerinden ve boyama hücre ölümü ile kolayca birleştirilebilen içsel hücresel otofloresanstan yararlanır.
En kritik adımlar sferoid oluşum protokolündedir; Bu nedenle, yüksek verimli agaroz bazlı yöntem için, agaroz kalıplarının kültür ortamı için yeterince dengelenmesi esastır. Yetersiz dengeleme süresi, kalan PBS'deki besin maddelerinin seyreltilmesine yol açacak ve küresel heterojenlik için ek faktörler getirecektir 21,26,72,73. Yeni yapılmış agaroz kalıbı ayrıca hava kabarcıkları, mikro çatlaklar ve diğer kusurların varlığı açısından görsel olarak kontrol edilmelidir.
Görüntüleme için verimli olmasına rağmen, nanopartikül süspansiyonu kendi kendine agregasyon gösterebilir ve düşük bağlanma oluşturma yöntemlerinde düzensiz şekilli sferoidlerin oluşumuna neden olabilir. Bu genellikle kültür ortamına serum ilavesiyle veya sferoid oluşumundan önce tek katmanlı hücre kültürünün önceden boyanmasıyla hafifletilebilir. Sıklıkla, sferoid kompaktizasyonu sırasında, az miktarda nanopartikül ilavesi (örneğin, ilk boyama konsantrasyonunun% 10'u) da sferoidlerin çoğalan bölgesinin boyanmasına yardımcı olabilir. Son olarak, tüm şekillendirme yöntemlerinde "tozsuz" steril pipet uçlarının kullanılması önemlidir.
Aydınlatmanın hücre canlılığı üzerindeki potansiyel etkisi, görüntüleme deneyleri sırasında her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Bu nedenle, her bir canlı görüntüleme deneyini olumsuz etkileyen risk faktörlerini bilmek önemlidir. Genel olarak, fotohasar birkaç mekanizmayı içerir: (1) yüksek yerel sıcaklık artışı, (2) mekanik stres ve (3) fotokimyasal stres (oksidatif ve serbest radikal reaksiyonu)74. Görüntüleme modalitesine bağlı olarak (örneğin, tek fotonlu konfokal ve çoklu foton görüntüleme, sürekli ve darbeli aydınlatma modları, dedektörlerin hassasiyeti ve uyarma ayarı mümkünse farklı dalga boylarında ışık kaynağının gücü), hücre ve doku tipi (örneğin, verimli ışık emici pigmentlerin veya diğer otofloresan moleküllerinin doku tipine bağlı birikimi, 3D ve 2D organizasyon, büyüme ve görüntüleme ortamı bileşimi), floresan probun kökeni (örneğin, ışığa duyarlılaştırıcı özellikler) risk faktörlerinin farklı kombinasyonu görüntüleme sırasında fototoksisiteye neden olabilir. Ek olarak, aydınlatmadan sonra hücre ölümünde herhangi bir artış gözlenmese bile, ışık gücüne bağlı mitokondri ve metabolizma üzerindeki erken ölüm öncesi etkiler, deney analizi ve yorumlamasına potansiyel olarak müdahale edebilir55.
Deneysel sonuçlar üzerindeki fototoksik etkiyi dışlamak için, araştırmacı, bozulmamış kontrole kıyasla hücre canlılığının ve hücre morfolojisindeki değişikliklerin genel olarak izlenmesini veya aydınlatmadan sonra hücre ölüm hızının artışını tahmin etmek için hücre ölüm problarını kullanmalıdır. Metabolik deneyler yapılırsa, ölçülen metabolik parametreler üzerindeki görüntüleme etkisini tahmin etmek ve en aza indirmek için pilot deneylerde görüntüleme parametrelerinin optimizasyonu buna göre yapılmalıdır. Oksijene duyarlı problar söz konusu olduğunda, ışık aşırı dozu, 'foto kaynaklı O2 tüketimi' etkisi53,75 nedeniyle O2'ye duyarlı boya fosforesans ömrü ve yoğunluğunda ani bir artış (O2 duyarlı boyaya referansın yoğunluk oranındaki karşılık gelen değişiklikler) ile kolayca izlenebilir. Bu, örneğin aşağıdaki yayınlanmış protokol25 kullanılarak farklı ışık gücü parametrelerine sahip hızlandırılmış deneylerin kinetik eğri analizi ile kolayca yapılabilir. Darbeli aydınlatmanın 'savunmasında' (örneğin, TCSPC-F(P)LIM mikroskobunda kullanılan), son çalışmalar, kararlı durum aydınlatma ölçümlerine 76,77 kıyasla ROS üretimi ve prob fotoağartma üzerindeki minimum etkisini göstermiştirve TCSPC-FLIM'in geleneksel yoğunluğa dayalı görüntüleme yaklaşımına karşı ek avantajına işaret etmektedir.
Sunulan sferoid oluşturma yöntemlerinin temel sınırlılığı, doğrudan ve uzun süreli izleme uygulamalarında yatmaktadır. Agaroz kalıpları, kalın agaroz tabakası nedeniyle uzun bir çalışma mesafesi objektifi (veya ek dik mikroskop veya floresan stereo mikroskobu) gerektirir ve 5D Küresel plakanın malzemesi kırmızı floresan kanallardaki (O2 probu) ölçümlerle etkileşime girebilir. Yüksek verimli yöntemlerle üretilen küresel boyut, mikro kuyu çapı ile sınırlıdır ve ortamın tükenmesini ve asitlenmesini önlemek için sık sık ortam değişimi gerektirir. Tüm bu sınırlamalarla birlikte, yüksek verim gerektiren deneyler (örneğin, 3D biyo-baskı uygulamaları için) ve "orta verimli" temel çalışmalar için düşük bağlanma yöntemleri gerektiren deneyler için 3D Petri Kaplarını (MicroTissue) öneriyoruz.
Oransal oksijenasyon izleme ve geleneksel canlı hücre floresan boya bazlı mikroskopi deneyleri, yakın kızılötesi (NIR) duyarlı bir kamera, ışık yayan diyot (LED) tabanlı uyarma ve uygun objektif25 ile donatılmışsa, yaygın olarak bulunan ters çevrilmiş mikroskoplarda ekonomiktir. Daha uygun optik kesitleme ve FLIM için, kullanıma hazır ticari konfokal mikroskop sistemleri (burada açıklandığı gibi) önerilir. NAD(P)H otofloresansını tespit etmek için daha maliyetli iki fotonlu FLIM mikroskobu gerektiren bir yöntem de tanımlamış olsak da, ideal olarak beyaz ışık lazeri ve hibrit veya SPAD dedektörleri ile donatılmış, konfokal FLIM sistemleri için uyumlu ve kullanışlı birçok farklı yaklaşım vardır. Bunlar, hücre metabolizmasının, FRET-FLIM biyosensör proteinlerinin, görüntüleme hücresi ve doku mekaniğinin, spesifik hücre ve doku tiplerinin otofloresansının ve FLIM-FRET31 aracılığıyla görselleştirilen reseptör-ilaç etkileşimlerinin değerlendirilmesini içerir.
Satıcı tarafından sağlanan FLIM edinme ve analiz yazılımı, IRF'yi veya görüntüleri aşağı akış açık kaynak analiziyle uyumlu bir formatta dışa aktarmak her zaman mümkün olmadığından, deneyin başarısını etkileyebilir. İşlem sonrası, FLIM analiz iş akışının önemli bir parçasıdır ve hala evrensel olarak standartlaştırılmamış veya kabul edilmemiştir. Eğri uydurma, fazör yaklaşımına kıyasla daha fazla sayıda foton ve daha fazla hesaplama gücü gerektirir. FLIMfit45 (global ve piksel piksel uydurma) ve Flimview78 , eğri uydurma analizi için kullanılan açık yazılımlar arasında yer alırken, fazör analizi için PAM79, FLUTE64 ve AlliGator80 kullanılır. FLIMJ46 , her iki yaklaşımla da çalışan kullanışlı bir ImageJ eklentisidir. Toplamda, bu seçenekler işlem sonrası rutini iyileştirmeye ve daha hızlı, daha çok yönlü ve kullanıcı dostu hale getirmeye yardımcı olur.

Çok hücreli sferoidler, hücrelerin kendi kendine toplanmasıyla elde edilen ve küresel bir şekil sergileyen bir grup 3B doku modelini temsil eder. Hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimini in vitro olarak taklit etmek ve çok sayıda kanser ve kök hücre türevi yapı içinde 3B bir bağlamı yeniden üretmek için yaygın olarak kullanılırlar. Hücre bağlanmasını azaltmak ve agregasyonu teşvik etmek için çeşitli teknikler kullanılır. Bunlar, yüzey gerilimine1 dayanan asılı-damla yöntemini; ultra düşük bağlantı plakaları, mikro kalıplar ve mikro kuyular gibi hücre bağlanma itme yöntemleri 2,3; akustik dalga tabanlı yaklaşım4; akış kaynaklı toplama yöntemleri (eğirme şişeleri, biyoreaktör ve mikroakışkan cihazlar)5; manyetik parçacık destekli oluşum6 ve toplamayı teşvik eden sentetik ve ECM bazlı matrislerin ve iskelelerin kullanımı 7,8,9.
Kanser araştırmaları, geliştirilmesi ve yeni ilaç tedavilerinin doğrulanmasında, sferoidler, besinlerin, atık ürünlerin ve O2'nin mekansal difüzyonla sınırlı gradyanlarını özetleme yetenekleri nedeniyle çekici bir modeldir ve genellikle katı tümörler için tipik olan nekrotik bir çekirdek oluşumuna yol açar10,11. Bu daha güvenilir ve sofistike in vitro modeller, hayvan araştırmalarının 3R ilkesine (değiştirme, azaltma ve iyileştirme) göre hayvan modellerinin (Gıda ve İlaç İdaresi [FDA] Modernizasyon Yasası 2.012) kapsamlı kullanımına duyulan ihtiyacı sorgulamaktadır. Kansere ek olarak, sferoidler uygulamalarını kök hücre araştırmalarında bulurlar. Örneğin, pluripotent kök hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nöral öncü hücreler13 veya yumurtalık granüloza hücreleri13,14 gibi doğrudan hastalardan elde edilmesi zor olan özel hücre tiplerine farklılaşması için kullanılabilen embriyoid cisimler (EB) oluşturma kapasitesine sahiptir. Ayrıca, bir EB oluşumu genellikle nöral15, retinal16, kardiyak17, karaciğer18, mide19 ve bağırsak organoidleri20 gibi daha karmaşık organoid modellerin geliştirilmesinde ilk adımdır. Deneyler için uygun bir sferoid oluşturma yöntemi seçerken boyut, tekrarlanabilirlik, verim ve aşağı akış uygulamaları gibi faktörler göz önünde bulundurulmalıdır.
3B kültürün artan karmaşıklığı, 2B kültüre kıyasla daha yüksek değişkenliğe yol açabilir. Besin bileşimi21, ortam buharlaşması22, viskozite23, pH kontrolü24, sferoid oluşum yöntemi ve hatta kültürdeki süre 25,26 gibi faktörler, değişen morfoloji, boyut, canlılık ve farklı kemorezistanslı sferoidlerin elde edilmesine neden olabilir27,28. Son araştırmalar, küresel oksijen gradyanlarının her zaman statik olmadığını ve küresel heterojenliği etkileyen oluşum yöntemi, küresel boyut ve hücre dışı viskoziteden etkilendiğini göstermiştir29. Sferoidlerde tekrarlanabilirliği ve veri erişilebilirliğini iyileştirmek için, MISpheroID bilgi tabanıgeliştirilmiştir 26 ve tekrarlanabilir bir sonuç için minimum bilgi olarak hücre hattını, kültür ortamını, oluşum yöntemini ve sferoid boyutunu belirler. Bu nedenle, kuyu boyutu (maksimum sferoid boyutunun bir tahmini verilen), kullanılan sarf malzemeleri, hazırlama süresi ve sferoidleri mikroskopi kaplarına taşımadan izleme olasılığı dahil olmak üzere çoklu yüksek verimli (SphericalPlate 5D, laboratuvar yapımı mikro kalıplar ve Mikrodoku kalıpları) ve düşük bağlanma yöntemleri (yani, Biofloat ve Lipidure kaplı 96 kuyulu plakalar, hem iskelesiz hem de iskele tabanlı) arasında ayrıntılı bir karşılaştırma yapılmıştır (Şekil 1 ve Tablo 1). İkincisi, uzun vadeli çalışmalara olanak tanırken, yüksek verimli yöntemlerle üretilen sferoidler genellikle son nokta deneyleriyle sonuçlanır. 5DspheriPlate'in ızgaraları dışındaki tüm yöntemler istenmeyen otofloresan getirmez, bu nedenle mikroskopide doğrudan kullanımlarını sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Şekil 1: Sferoid oluşum yöntemleri açıklanmıştır. Plakaya patentli mikro kuyuları entegre eden SphericalPlate 5D gibi yüksek verimli yöntemler, laboratuvarda üretilen mikro kalıplar ve MicroTissue kalıpları, agarozda (mavi) birden fazla mikro kuyu yapmak için damgalar kullanır. Lipidure (Amsbio) ve Biofloat (Sarstedt) gibi düşük bağlantılı plakalar, hücre yüzeyi yapışmasını engelleyen ve hücrenin kendi kendine toplanmasını destekleyen yapışmayan bir kaplama kullanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D Küresel Plaka</td>
			<td>Kendi ürettiği mikro kalıplar</td>
			<td>Mikro doku</td>
			<td>Düşük bağlanma yöntemleri</td>
		</tr><tr><td>Sferoid/kuyu sayısı</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Çap kuyusu</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 Milimetre</td>
		</tr><tr><td>Kültür hacmi</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Diğer sarf malzemeleri</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL% 3 agaroz</td>
			<td>500 μL% 2 agaroz</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Hazırlanma zamanı</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>2 saat + 3 gün medya adaptasyonu</td>
			<td>0,5 saat + 15 dk medya adaptasyonu</td>
			<td>10–30 dk + 1 saat kurutma</td>
		</tr><tr><td>Izleme</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Hayır**</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr><tr><td>Otofloresan</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Hayır</td>
		</tr><tr><td>Yeniden</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Hayır**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Masraf</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Kaplama ve Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Ticari 96 kuyulu plaka</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Bazı hücre hatları, kompakt sferoidler oluşturmak için ECM (yani %2-%5 Matrigel) ilavesine ihtiyaç duyar.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**Kaplama tükenene kadar tekrar kullanılabilir. Bununla birlikte, her plaka az miktarda ortam tüketir ve zamanla toz birikebilir. Filtre sterilizasyonuna düzenli olarak ihtiyaç duyulur.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Çoklu sferoid oluşturma yöntemlerinin karşılaştırılması29. "İzleme": bir mikroskopi çanağına aktarmaya gerek kalmadan sferoidi izleme yeteneği. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: &gt;500€
Floresan mikroskobu, hücre ölümü, canlılık, proliferasyon, metabolizma, viskozite ve hatta mekanik özellikler dahil olmak üzere sferoidler içindeki temel biyolojik yönlerin doğrudan izlenmesini sağlar30. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), (mikro) ortamlarında 31,32,33,34 floresan prob etkileşimlerini incelemek için ek bir nicel boyut sağlar ve farklı emisyon ömürlerine göre örtüşen emisyon spektrumlarının çözülmesine izin verir 35,36 ve içsel hücresel otofloresansa dayalı hücre metabolizmasının araştırılması. Bu nedenle, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NAD (P) H), flavin mononükleotid (FMN), flavin adenin dinükleotid (FAD), protoporfirin IX ve diğerleri gibi yaygın hücresel otofloresan bileşikler bir ve iki foton FLIM ile ölçülebilir ve glikoz katabolizması, oksidatif fosforilasyon (OxPhos) ve hücre redoks durumuna genel bir bakış sağlar. NAD(P)H serbest sitoplazmik veya proteine bağlı mitokondriyal formlardabulunur 37,38. Benzer şekilde, FAD'ın oksitlenmiş hali, serbest formun daha uzun bir ömrüne sahip floresandır. NAD(P)H ve FAD mikroskopileri genellikle numune fotohasarını önlemeyi amaçlayan iki foton uyarılmış FLIM'i içerir39. Sıklıkla, 'optik metabolik görüntüleme' FLIM, sferoid veya organoid metabolizması, oksijenasyon, proliferasyon ve hücre canlılığının daha eksiksiz bir resmini sağlamak için boya bazlı problar, genetik olarak kodlanmış biyosensörler, fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) ve oransal yoğunluğa dayalı ölçümlerin kullanımıyla birleştirilebilir 29,30,31. Ek olarak, FLIM, bir ilacın hedef alanı 33,40,41 ile bağlanmasını araştırmak için alıcı ile yakın temas halindeyken donör floroforun ömür boyu değişimini ölçmek için Förster rezonans enerji transferi (FRET) yöntemi ile de birleştirilebilir.
Elde edilen FLIM görüntüleri, kullanım ömrünü piksel piksel hesaplamak için tipik olarak analiz edilir. Şu anda, floresan ömrünü elde etmek için kullanılan en az 3 yaygın strateji vardır: yarı kantitatif 'hızlı FLIM'42 (bazen 'tau sense'43,44 olarak anılır), bir, iki veya üç üstel uydurma kullanarak bozunma eğrisi uydurma ve fazör dönüşümü ve fazör grafiği analizi ile 'uydurmasız' yaklaşım. Satıcıya bağlı olarak, ölçülen FLIM verilerini işlemek için sağlanan (LAS X, Symphotime, SPCImage, vb.) veya açık kaynaklı yazılım (örneğin, FLIMfit45, FLIMJ46 veya diğerleri47) kullanılabilir. Tipik olarak, satıcı tarafından sağlanan yazılım, ön veri analizi için yararlıdır, açık kaynaklı çözümler, örneğin fazör grafikleri ve 3D görselleştirme kullanarak daha doğru çalışmalar sağlayabilir.
Sferoidleri incelemek için bir yöntem olarak FLIM'in kullanışlılığına ve çekiciliğine rağmen, çok az deneysel protokol mevcuttur ve FLIM'i içeren başarılı canlı multiparametrik mikroskopi deneyleri için en uygun oluşum yönteminin seçiminde genel bir bilgi eksikliği vardır. Burada, yaygın olarak kullanılan sferoid oluşum protokollerinin ayrıntılı bir karşılaştırması, yakın zamanda doğrulanmış ve karakterize edilmiş uzak kırmızı ve yakın kızılötesi (NIR) oksijen algılayıcı nanosensör (MMIR1) ile morfolojilerine, canlılıklarına ve oksijenasyonlarına dayalı olarak sunulmaktadır. Katyonik nanoparçacık, referans O2 duyarsız aza-BODIPY (uyarma 650 nm, emisyon 675 nm) ve NIR O2 duyarlı metaloporfirin, PtTPTBPF (uyarma 620 nm, emisyon 760 nm) olmak üzere iki raportör boya ile emprenye edilir. MMIR1, hücresel toksisite oluşturmadan ve kararlı sinyallere, uzun süreli izlemeye ve çoğullamaya izin vermeden geleneksel bir floresan mikroskobu (oransal analiz kullanılarak) veya fosforesans ömür mikroskobu (PLIM) üzerinde oksijen gradyanlarının gerçek zamanlı analizini sağlar25,29. Boyalar veya nanosensörler ile boyama ihtiyacına, sferoid verimine veya hücre tipine bağlı olarak en uygun oluşum protokolü seçilebilir. Sferoidlerin canlılığı ve oksijenasyonu ile ilgili çalışmalar, kanser ve kök hücre kaynaklı sferoidler ile ilgili olduğundan, sunulan protokoller ayrıca bu modellerle NAD(P)H-FLIM ve FAD-FLIM örneklerini ve beklenen tipik sonuçlarını da içermektedir. Sunulan görüntüleme ve analiz boru hatları, en popüler zamanla ilişkili tek foton sayma tabanlı FLIM mikroskopi platformlarını hedeflemektedir.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipetler</td><td>VWR</td><td>612-3700'den</td> de <td>temin edilebilir Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>12 kuyulu hücre kültürü plakaları, steril</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning ve diğer şirketlerden de temin edilebilir.</td></tr><tr><td>12 Kuyu Haznesi sürgüsü, çıkarılabilir</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific ve diğerlerinden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>3D Petri Kabı mikro kalıplar</td><td>Mikrodoku</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu hücre kültürü plakaları, steril</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Küresel oluşumu için ticari olarak mevcut kaplamalı 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>Calcein Green-</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Seyreltme içinde uygulayın 1:1000</td></tr><tr><td>CellSens Dimension yazılımı</td><td>Olympus</td><td>versiyon 3</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plasentasından elde edilen kolajen, tip IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>0.07 mg/mL Kollajen ve 0.03 mg/mL Poli-D-lizin kaplı mikroskopi kaplarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Konfokal FLIM Mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Beyaz ışık lazerli Falcon ters mikroskop, HyD X dedektörleri, iklim / T kontrol odası (OkoLab), 25x/0,95 W objektif</td></tr><tr><td>D (+) - Glikoz</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Görüntüleme ortamının hazırlanması için 1:100 1 M stok çözeltisi hazırlayın (nihai konsantrasyon 10 mM)</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), fenol kırmızısı-, glikoz, piruvat ve glutamin içermez</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Görüntüleme ortamının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Ayrıca Sigma'dan da temin edilebilir. Kullanmadan önce ısıyla etkisiz hale getirilmesi gerekir.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Görüntüleme ortamının hazırlanması için seyreltme 1/100 (nihai konsantrasyon 10 mM)</td></tr><tr><td>İnsan kolon kanseri hücreleri HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>sürüm 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>sürüm 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Ayrıca Sigma'dan da temin edilebilir. 1:100 oranında seyreltilerek uygulayın.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, 1 mM Sodyum Piruvat ve 10 mM HEPES VWR</td><td></td><td>392-0420</td><td>eklenmesi gerekir HCT116 hücreleri için standart büyüme ortamı</td></tr><tr><td>mikro desenli 3D baskılı PDMS pulları</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mikrosistem Teknolojisi Merkezi tarafından sağlanmıştır, Profesör Dr. Jan Vanfleteren, Ghent Üniversitesi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer couting odası</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>O2 probları: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tam karakterizasyon, doğrulama ve bazı uygulamalar şu adreste bulunabilir: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>PBS tableti 500 mL damıtılmış suda çözün.</td></tr><tr><td>Kalem Strep :P enisilin (10.000 U/mL) / streptomisin (10.000 &mu; g/mL) 100x çözüm</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Ayrıca Sigma'dan da temin edilebilir. 1:100 oranında seyreltilerek uygulayın.</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>0.07 mg / mL Kollajen ve 0.03 mg / mL Poli-D-lizin kaplı mikroskopi kaplarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Hücre ölümü boyama, 1 ve mikro kullanın; 1 saat inkübasyonda g / mL</td></tr><tr><td>PVDF şırınga filtresi 0.22 ve mikro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Görüntüleme ortamının hazırlanması için seyreltme 1/100 (nihai konsantrasyon 1mM)</td></tr><tr><td>SphericalPlate 5D 24 kuyulu</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>steril petrik</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>Doku kültürü şişesi (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>Doku kültürü şişesi (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, VWR ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>U-dipli 96 kuyulu plaka</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Benzer ürünler Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one ve diğer şirketlerden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Agaroz düşük erime noktası (A-9414, Sigma), rutin kullanım için Agaroz (A-9539, Sigma) gibi diğer Agaroz türleri</td></tr><tr>, <td>Geniş alan floresan ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Ters floresan mikroskobu IX81, motorlu Z ekseni kontrollü, CoolLED pE4000 (16 kanal, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS kamera, cam ısıtma plakası Okolab, CellSens Dimension v.3 yazılımı ve hava hedefleri 4x/0.13 UPlanFLN ve 40x/0.6 LUCPlanFLN. (İsteğe bağlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için) 60x/1.0 LUMPLFLN su</td></tr></tbody></table>

Çok hücreli sferoidlerin Üretimi ve Çok parametreli canlı hücre floresan Ömür boyu görüntüleme mikroskobu (flim)

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Çok hücreli tümör sferoidleri, tümör mikroçevresini yeniden üretmek, ilaç tedavilerini test etmek ve optimize etmek ve biyo ve nanosensörleri 3D bağlamda kullanmak için popüler bir 3D doku mikroagregat modelidir. Üretim kolaylığı, öngörülebilir boyutları, büyümeleri ve gözlemlenen besin ve metabolit gradyanları, 3B niş benzeri hücre mikro ortamını özetlemek için önemlidir. Bununla birlikte, sferoid heterojenliği ve üretim yöntemlerinin değişkenliği, genel hücre metabolizmasını, canlılığını ve ilaç yanıtını etkileyebilir. Bu, kök ve kanser hücresi biyolojisinde in vitro 3D doku modellerinde olduğu gibi boyut, değişkenlik, biyofabrikasyon ihtiyaçları ve kullanım gereksinimleri göz önüne alındığında en uygun metodolojiyi seçmeyi zorlaştırır. Özellikle, sferoid üretimi, optik metabolik görüntüleme, floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), nanosensörlerle küresel hipoksinin izlenmesi veya canlılık gibi kantitatif canlı mikroskoplarla uyumluluklarını etkileyebilir. Burada, canlı geniş alan, konfokal ve iki fotonlu mikroskoplarla uyumluluklarını vurgulayan bir dizi geleneksel sferoid oluşum protokolü sunulmaktadır. Çoğullanmış otofloresan FLIM ile ve çeşitli kanser türleri ve kök hücre sferoidleri kullanılarak analiz hattına yönelik takip görüntülemesi de sunulmaktadır.

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.

3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Öğrenin, çok hücreli sferoid üretim yöntemlerini FLIM mikroskobu ile hücre metabolizması ve oksijen dağılımı analizi için nasıl kullanacağınızı. Bu teknik, 3D canlı hücre görüntülemede metabolik biyobelirteçleri incelemeye olanak tanır.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Daha fazla video keşfet