Name: Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını split-lusiferaz yeniden birleştirme testiyle nicel olarak ölçme yöntemini. Bu protokol, HEK293T hücrelerinde hücre içi organel iletişimini ve nörodejenerasyon araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Yüksek Verimli Ekranlar için ER-Mitokondri Kontaklarını Ölçmek İçin Basit Bir Test

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,7 mL SafeSeal Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka TC İşlem Görmüş</td><td>ABD Bilimsel</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet Uçları OneTip</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L pipet uçları OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 & L Eğimli uçlar OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polipropilen Konik Boru</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Flipper Mikrotüp Rafları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka TC Işlenmiş&nbsp;</td><td>ABD Bilimsel</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm TC İşlenmiş Tabak</td><td>ABD Bilimsel</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 & L İpuçları OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5910&nbsp; Ri - Soğutmalı Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit, susuz vb; % 99,9</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>DMSO'da çözün; -70 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>EnduRen Canlı Hücre Substratı</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Alikotları -70 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; L pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; L pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 & mikro; L pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12 kanallı</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; L pipet</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgeler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; İnkübatör, 184 L, Cilalı Paslanmaz</td><td>Çelik ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>El çetele sayacı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemasitometre - Neubauer Parlak Çizgi, Çift Sayma Odası</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Tamponu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Mini santrifüj</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>50ml Konik, 15ml Konik ve Mikrosantrifüj Tüpleri İçin Çok Tüplü Raf</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfeksiyon Sınıfı Lineer Polietilenimin Hidroklorür (MW 40.000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhosin hidroklorür</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>DMSO'da çözün; -70 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX çok modlu mikroplaka okuyucu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vortex ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>seviye 8</td></tr><tr><td>VWR Vakum Aspirasyon Sistemi</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>DMSO'da çözün; -70 ° C'de saklayın; Ç</td></tr></tbody></table>

canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını Ölçmek için split-luciferase yeniden birleştirme testi

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Spesifik GTPazları inhibe ettiği bilinen üç bileşiğin eklenmesi üzerine ER-mitokondri temaslarının seviyesini ölçmek için yukarıda açıklanan protokolü kullandık. CDC42, RHO ve RAC, aktive edildiğinde aktin polimerizasyonunu28 destekleyen ve sırasıyla ZCL278, Rhosin ve Ehop-016 tarafından inhibe edilenGTPazlardır 24. Split-Rluc ile transfekte edilen HEK293T hücreler DMSO (kontrol), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) veya Ehop-016 (25 μM) ile muamele edildi ve 1 saat, 2 saat ve 5 saat inkübe edildi. Bir plaka okuyucu kullanarak, tanımlanmış zaman noktalarında split-Rluc aktivitesini ölçtük (Şekil 2).
Rhosin (RHO GTPaz inhibitörü) ile tedavi edilen hücreler, tedavinin 1 saat, 2 saat ve 5 saatinde kontrol DMSO ile tedavi edilen hücrelere kıyasla lusiferaz aktivitesinde önemli bir değişiklik göstermedi (p &gt; 0.9999, p = 0.6956, p &gt; 0.9999) (Şekil 2). Bu sonuçlar, Rhosin'in ER-mitokondri temaslarını etkilemediğini göstermektedir, bu da iki organel arasındaki temasların düzenlenmesinde RHO GTPase aktivitesinin hiçbir katılımı olmadığını düşündürmektedir.
Buna karşılık, RAC GTPaz inhibitörü Ehop-016, tedavinin 1 saat, 2 saat ve 5 saatinde DMSO'dan önemli ölçüde daha düşük lusiferaz aktivitesi gösterdi (p = 0.0106, p = 0.0009, p = 0.0024) (Şekil 2). Bu veriler, hücrede normal ER-mitokondri etkileşimini sürdürmek için RAC GTPaz aktivitesinin gerekli olduğunu göstermektedir.
Son olarak, CDC42 inhibitörü ZCL278, lusiferaz aktivitesinde en ciddi değişiklikleri gösterdi (Şekil 2). ZCL278 ile tedavi edilen hücreler, kontrol DMSO'ya kıyasla lusiferaz aktivitesinde önemli bir azalma gösterdi ve her üç zaman noktasında da en düşük p değerlerine sahipti ve boyunca 0.0001'&lt; bir p değerini korudu. Verilerimiz, CDC42 GTPaz aktivitesi ZCL278 tarafından bloke edildiğinde, bölünmüş lusiferazın her bir yarısını ayrı ayrı kodlayan iki vektörle birlikte transfekte edilmiş hücrelerde gerçekleştirilen orijinal split-Rluc testini kullanan önceki raporumuzla tutarlı olarak, ER-mitokondri eşleşmesinin güçlü bir inhibisyonunu göstermektedir24.
ZCL278 ile çarpıcı sonuçlar göz önüne alındığında, özellikle diğer GTPase inhibitörleri ile karşılaştırıldığında, ZCL278 aktivitesi, bir DMSO kontrolüne karşı çeşitli konsantrasyonlarda [0.5 μM, 5 μM, 50 μM] daha fazla test edildi. Tedaviden 1 saat, 2 saat ve 5 saat sonra ölçülen lusiferaz aktiviteleri doza bağlı bir yanıt gösterdi; 0.5 μM ZCL278, lusiferaz aktivitesi üzerinde en zayıf etkiye neden olurken, 5 μM daha güçlü ve 50 μM, sulandırılmış enzim aktivitesinde en güçlü azalmayı gösterdi (Şekil 3). Birlikte, sonuçlarımız ZCL278'in split-Rluc aktivitesini doza bağlı bir şekilde aşağı regüle ettiğini ve zaman ilerledikçe, daha yüksek ZCL278 konsantrasyonlarının (CDC42 inhibitörü), daha düşük konsantrasyonlara kıyasla kontrol DMSO'suna göre hala önemli bir değişiklik gösterdiğini göstermektedir.
Split-Rluc testimizi doğrulamanın bir yolu olarak, yakınlık ligasyon testi (PLA), transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve mitokondriyal kalsiyum alımı izleme gibi iyi bilinen bağımsız testler yapılabilir (Şekil 4 ve veriler gösterilmemiştir)24. ER-mitokondri temas promotörleri için ekranımızda tanımlanan bileşiklerden biri olan bir β2 adrenerjik reseptör agonisti olan izoproterenol (Şekil 4A), izoproterenol tedavisi üzerine split-Rluc'un lusiferaz aktivitesinin, PLA sinyal yoğunluğunun yanı sıra mitokondriyal kalsiyum alımındaki değişikliklerle gösterildiği gibi gelişmiş ER-mitokondri temasları nedeniyle arttığını doğrulamak için kullanıldı (Şekil 4B-E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> Şekil 1: split-Rluc yeniden birleştirme testi. (A) Split-R Luc testinin şematik gösterimi. Mitokondri ve endoplazmik retikulum arasında zar teması olmadığında, Mito-R lucN ve RlucC-ER etkileşime giremez ve bu nedenle Rluc8 aktivitesi yoktur. Bununla birlikte, ER ve mitokondri zarlarının temas ettiği Mito-R lucN ve RlucC-ER arasındaki etkileşim, substratın lüminesansa dönüştürülmesiyle tespit edilen tam enzimatik aktivite ile sonuçlanır. (B) Split-Rluc DNA yapısının şematik haritası (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) HEK293T hücrelerde split-Rluc testi için iş akışı şeması. Kısaltmalar: Mito = mitokondri; ER = endoplazmik retikulum; IRES, iç ribozomal giriş bölgesi; rb_glob pA, tavşan beta-globin poli adenilasyon sinyali; T2A, Thosea asigna virüsünden kendi kendine parçalanan bir peptit 2A dizisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> Şekil 2: GTPaz inhibitörleri ile tedavi edilen hücrelerdeki ER-Mito temas seviyelerine karşılık gelen split-R luc aktiviteleri. (AC) DMSO (kontrol), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] veya ZCL278 [50 μM] tedavisinden (her grup için n = 12) sonra (A) 1 saat, (B) 2 saat veya (C) 5 saat sonra sulandırılmış lusiferaz aktiviteleri. Tüm veriler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak ve çoklu karşılaştırmalar yapılarak analiz edilmiştir. P değerleri p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****) olarak rapor edildi. Hata çubukları± standart ölçüm hatasını gösterir. Kısaltmalar: Mito = mitokondri; ER = endoplazmik retikulum; RLU = bağıl ışık birimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> Şekil 3: ZCL278 ile tedavi edilen hücrelerde ER-Mito kontaklarının seviyelerini ölçen split-R luc aktiviteleri. (A-C) DMSO'dan (kontrol) veya [0.5 μM], [5 μM] veya [50 μM] konsantrasyonda ZCL278'den (A) 1 saat, (B) 2 saat veya (C) 5 saat sonra sulandırılmış lusiferaz aktiviteleri (her grup için n = 12). Tüm veriler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak ve çoklu karşılaştırmalar yapılarak analiz edilmiştir. P değerleri p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****) olarak rapor edildi. Hata çubukları± standart ölçüm hatasını gösterir. Kısaltmalar: Mito = mitokondri; ER = endoplazmik retikulum; RLU = bağıl ışık birimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> Şekil 4: split-Rluc testinin doğrulanması. (A) ER-mitokondri temas destekleyicileri için bir bileşik ekranda tanımlanan izoproterenol dahil olmak üzere 11 ilaçla HEK293T hücrelerinin işlenmesinden sonra split-Rluc aktivitesinin nicelleştirilmesine bir örnek. (B) DMSO veya izoproterenol (1 μM) ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde yakınlık ligasyonu testine bir örnek. PLA sinyali (kırmızı), ER ve Mito arasında yakın bir temas olduğunu gösterir. Sec61-GFP (yeşil): ER'yi etiketlemek için; DAPI (mavi): çekirdek. (C) A'da PLA sinyalinin nicelleştirilmesi (n = her biri 77-97 hücreli 4 deney; Mann-Whitney testi). (D) Histamine (100 μM) yanıt olarak mitokondriyal kalsiyum alımı. Mito-R-GECO1 floresan yoğunluk değişimi (ortalama birden fazla HeLa hücresi üzerinden alınmıştır) DMSO veya izoproterenol ile tedavi edilen hücrelerde her 2.5 saniyede bir çizilmiştir. Ok, histamin ilavesini gösterir. (E) Sol: A'da maksimum mitokondriyal kalsiyum alımının zirvesi. Eşleşmemiş iki kuyruklu t-testi (n = 10, DMOS; 14, Isoproterenol). Sağ: Mitokondriyal kalsiyum alım hızı ( A'da olduğu gibi; 7,5 ila 12,5 s). Mann-Whitney testi (n = 12, DMSO; 11, Isoproterenol). Bu rakam Lim ve ark.24'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RLU = bağıl ışık birimi; PLA = yakınlık ligasyon testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: ER-mitokondri kontakları için mevcut tekniklerin özeti. Her yöntem için avantajların ve sınırlamaların listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry'nin DNA dizisini (PDF ve GBK formatları) içeren zip dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry haritası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Bu video, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için bölünmüş lusiferaz tamamlama testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen proteinler, lusiferaz enziminin küçük ve büyük parçalarına etiketlenir. Proteinler etkileşime girdiğinde, büyük ve küçük fragmanlar, belirli bir substratın varlığında ölçülebilen parlak ışıldama açığa çıkaran aktif bir enzim kompleksi oluşturmak üzere birleşir.

Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

Öğrenin, canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını split-lusiferaz yeniden birleştirme testiyle nicel olarak ölçme yöntemini. Bu protokol, HEK293T hücrelerinde hücre içi organel iletişimini ve nörodejenerasyon araştırmalarını kolaylaştırır.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Daha fazla video keşfet