Name: Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin fare embriyolarından tek hücreli RNA dizilimi yöntemiyle gastrülasyon sürecindeki hücre kaderi kararlarını analiz etmeyi. Bu protokol mutant embriyolarda omik veri setleri oluşturmayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fox Chase Kanser Merkezi'ndeki Genomik Çekirdeği'ne ve dizileme deneyleri için teknik destek için Dr. Johnathan Whetstine laboratuvar üyeleri Zach Gray, Madison Honer ve Benjamin Ferman'a teşekkür ederiz. Dr. Estaras'ın laboratuvar üyelerine ve tek hücreli çalışmaların ilk analizine katkıda bulunan bir rotasyon yüksek lisans öğrencisi olan Alex Morris'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri tarafından finanse edilmektedir R01HD106969 ve Conchi Estaras'a R56HL163146. Ek olarak, Elizabeth Abraham, T32 eğitim hibesi 5T32HL091804-12 tarafından desteklendi.

Tek Hücreli Dizileme için Gastrolama Fare Embriyosunun İzolasyonu ve Genotiplemesi

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu yazıda, gastrulasyon yapan fare embriyolarından yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları elde etmek için, erken gelişimde hücre kaderi spesifikasyon mekanizmaları üzerine çalışmaları kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış sağlam bir boru hattı sunulmaktadır. Bu yöntem, cinsiyet veya somatik genler gibi genotipler gerektiren embriyoların analizini optimize ederek gastrulasyon alanındaki çok önemli bir boşluğu giderir. Genetik mutasyon fare modellerini kullanarak ve tüm fare embriyoları üzerinde yüksek çözünürlüklü tek hücreli dizileme kullanarak, bu boru hattı erken fare gastrulasının gen ekspresyon profillerinin anlaşılmasını daha da artırabilir. Bu yöntem, tek hücreli omikler için erken gelişimsel zaman noktalarında yüksek kaliteli hücreler ve çekirdekler elde etmek için bir Cre rekombinaz sistemi ile bir genetik mutasyon fare modelinin kullanılmasının fizibilitesini göstermektedir. Bu yöntem, örneklerin kütüphane hazırlığı ve sıralaması için gerekli kalite standartlarını karşılamadığı çok sayıda denemeyle gelişti. Açıklanan metodoloji, üç kritik adımın optimizasyonu yoluyla E8'den daha genç embriyolardan yeterli hücre/çekirdek üretir: (1) embriyo sayısını artırmak için senkronize zamanlanmış gebelikler, (2) donmayı/çözülmeyi önlemek için aynı gün genotipleme ve (3) ölmekte olan hücrelerin dizilenmesini önlemek için hücre/çekirdek canlılığının değerlendirilmesi. Bu protokol, tek hücreli RNASeq ile başarılı sonuçlar verir, ancak bu protokolde elde edilen hücre veya çekirdek süspansiyonları, smart-seq, drop-seq ve cel-seq16 gibi hücre canlılığının sınırlayıcı faktör olduğu diğer dizileme platformlarında işlenebilir.
E7 embriyosunda, hücre sayısı suş ve mutant genotipe bağlı olarak değişebilir. Tipik olarak, bir E7 embriyosu yüzlerce ila birkaç bin hücre arasında değişebilir ve istenen genotipe sahip embriyoların elde edilmesi zordur, kriterleri karşılayan hamile baraj başına sadece 1 veya 2 embriyo vardır. Bu protokol, tek hücreli analiz için E7 embriyosu başına yaklaşık 300 canlı hücrenin yakalanmasına izin verir. Farklı günlerde hamile barajlardan embriyoları dondurarak embriyo havuzu boyutunu artırma girişimleri başarısız oldu, çünkü kriyoprezervasyon ajanlarının eklenmesiyle bile çözüldükten sonra hücre canlılığı ciddi şekilde tehlikeye girdi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, gebe barajların üreme stratejisi ve senkronizasyonu optimize edildi. Çoklu izolasyon şansını artırmak için, daha büyük çöp boyutlarına sahip olma olasılıkları daha yüksek olduğundan, izolasyon için üremeden önce 1-2 kez doğum yapmış dişi farelerin kullanılması önerilir. Dişinin kızgınlık döngüsünün izlenmesi çok önemlidir; Çiftleşmenin proöstrus ve östrus aşamalarında meydana gelme olasılığı daha yüksektir. Üreme zorlukları ortaya çıkarsa, dört gün sonra üreme ortaklarının değiştirilmesi, fiş üretilmemesi durumunda da yardımcı olacaktır.
Bu yöntemin bir sınırlaması olduğuna dikkat etmek önemlidir: gözlemlenen fişlere dayanır ve bir tıkaç gözlense bile, hamileliği garanti etmez, sadece cinsel aktiviteyi gösterir. Bu nedenle, bir günde gözlenen tıkaç sayısının arttırılması, bir günde birden fazla gebe dam ve daha pozitif genotiplere sahip olma olasılığını artıracaktır. Bu protokol, gastrulasyon sırasında E7 ile E7.75 arasında değişen embriyonik aşamaların bir kavram kanıtı olarak kullanılmasının fizibilitesini göstermiştir. Ancak bu boru hattı E6.5'ten E8 embriyolara kadar uygulanabilir. E6.5 embriyoları için, istenen genotipe sahip en az 7 embriyonun havuzlanacak şekilde senkronize gebelik sayısının artırılması önerilir. Bunun yerine, E8 embriyoları için, her embriyoyu ayırmak için kullanılan tripsin miktarını 20 μL yerine ~ 40 μL'ye yükseltin. Amaç, bölmeye devam etmeden önce μl başına 700-1200 hücre konsantrasyon aralığında bir hücre/çekirdek süspansiyonu elde etmektir.
Tek hücreli dizilemenin başarısı için iyi hücre canlılığına sahip olmak çok önemlidir. Üreticiler tarafından sağlanan mikroakışkan çip tasarımında, tek hücreler, bilinen barkodlu jel boncukları içeren bir çip içinde jel boncuklara (GEM'ler) bölünür11. Bununla birlikte, bu işlemin dikkate değer bir sınırlaması, hem yüksek kaliteli hem de düşük kaliteli tek hücrelerin bölünebilmesidir. Yeterli sayıda canlı hücre (yani 1000 hücre / μL) ile bile, süspansiyonun canlılığı düşükse (yani, 1000 hücre canlı ve 1000 hücre ölü, bu da %50 canlılık ile sonuçlanır), sıralama deneyi muhtemelen başarısız olacaktır. En iyi sonuçlar için, yaklaşık% 90'lık bir canlılığın hedeflenmesi önerilir. Hücre canlılığı yaklaşık% 60 -% 89 arasındaysa, deneyin canlılığını artırmak için özel önlemler alınabilir. Bununla birlikte, hücre canlılığı %60'tan azsa, deneye devam edilmemesi şiddetle tavsiye edilir. Bunun nedeni, ölmekte olan hücrelerin bölme jelinde 'yakalanması' ve müteakip kütüphane hazırlığı ve kalite kontrollerinin gözle görülür bir sorun olmadan geçmesidir. Bununla birlikte, gerçek dizileme deneyi tamamen başarısız olabilir, çünkü sıralama okumalarının çoğu mitokondriyal, ribozomal veya apoptoz genlerini haritalayacak ve bu da başlangıçtan itibaren zayıf hücre canlılığının belirtilerini gösterecektir. Bu yazıda sunulan veriler, yüksek kaliteli hücrelere sahip gastrulasyon yapan fare embriyolarının tek hücreli dizilimi için bir boru hattını göstermektedir. Bu metodoloji, geliştirme sırasında birçok farklı genetik mutasyon fare modelinin anlaşılması için uygulanabilir.

Gastrulasyon, normal gelişim için gerekli olan temel bir süreçtir. Bu hızlı ve dinamik süreç, pluripotent hücreler, organların nasıl oluştuğunu tanımlayan soya özgü öncülere geçtiğinde meydana gelir. Yıllar boyunca, gastrulasyon uzun zamandır büyük ölçüde homojen üç popülasyonun oluşumu olarak tanımlandı: mezoderm, ektoderm ve endoderm. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü teknolojiler ve ortaya çıkan sayıda embriyonik kök hücre modeli 1,2, erken germ katmanları arasında benzeri görülmemiş bir heterojenliği ortaya çıkarmaktadır 3,4. Bu, gastrulanın farklı hücre popülasyonlarını düzenleyen mekanizmalar hakkında ortaya çıkarılacak çok daha fazla şey olduğunu göstermektedir. Fare embriyonik gelişimi, gastrulasyon sırasında erken hücre kaderi kararlarını incelemek için en iyi modellerden biri olmuştur 3,5. Farelerde gastrulasyon hızlıdır, çünkü tüm gastrulasyon süreci embriyonik gün E6.5'ten E85'e kadar 48 saat içinde gerçekleşir.
Tek hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, vahşi tip fare embriyonik gelişiminin ayrıntılı haritalanmasını sağlayarak, gastrulasyon 3,4,6,7,8 sırasında embriyoların hücresel ve moleküler manzaralarına kapsamlı bir genel bakış sağlamıştır. Bununla birlikte, bu aşamalarda mutant embriyoların analizi daha az yaygındır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır 9,10. Kıt literatür, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların manipülasyonu ve tek hücreli hazırlanması ile ilgili teknik zorlukları yansıtmaktadır. Dinamik gastrulasyon sürecini yakalamak, özellikle mutant embriyoları anlamak için hızlı doğası nedeniyle zorluklar doğurabilir. Gebeliklerin zamanlaması ve senkronizasyonu çok önemlidir, çünkü zamanlanmış gebelikler arasındaki küçük farklılıklar bile mutant genden kaynaklanan gelişimsel bir fenotip olarak yanlış yorumlanabilir. Bu, mutant gen gastrulasyon sürecini etkilediğinde özellikle önemli hale gelir13,14. Bu çalışmada, vajinal tıkaçların (yani, çiftleşmeden sonra dişinin vajinasında oluşan pıhtılaşmış seminal sıvı kütlesi) görselleştirilmesi yoluyla senkronize gebelikler elde etmek için kılavuzlar oluşturulmuştur. Ek olarak, E6.5'ten E8'e kadar mutant gastrulasyon yapan embriyolardan sağlam tek hücreli veriler elde etmek için bir strateji tasarlanmıştır. Bu strateji, gebelik başına istenen genotipe sahip düşük embriyo sayısı ve embriyoların veya hücrelerin dondurulması-çözülmesinin neden olduğu canlılıktaki azalma ile ilişkili kısıtlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır.
Bu makale, vajinal tıkaçlar yoluyla zamanlanmış gebeliklerin oluşturulmasından tek hücrelerin/çekirdeklerin son dizilimine kadar optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu yöntem, istenen genotipe sahip daha fazla sayıda embriyo elde etmek için senkronize gebelik sayısının nasıl artırılacağını, hücrelerin canlılığını artırmak için hücre/çekirdek izolasyonlarını ve aynı gün genotipleme protokolünü açıklar. Bu el yazması aynı zamanda farklı gastrulasyon zaman noktalarında embriyo izolasyonu sürecini de açıklamaktadır. Metodoloji, dizileme için nihai canlı embriyo hücrelerinin/çekirdeklerinin sayısını artırmaya yardımcı olur ve yüksek kaliteli dizileme verileri sağlar. Bu nedenle, bu yöntem, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların tek hücreli çalışmaları için kapıları açacaktır.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri kabı</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 & mikro; L Reach Bariyer Ucu</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 & L Reach Bariyer Ucu</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 & L Reach Bariyer Ucu</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 & mikro; m Ters Çevrilebilir Süzgeç, küçük</td><td>Kök Hücre</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri kabı</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>8 şeritli PCR tüpleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Kuru Banyo</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Soğutmalı</td><td>Mikrosantrifüj Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Krom Kontrol Cihazı</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Krom Sonraki GEM Tek Hücreli 3 'Reaktif Kitleri v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Kontes Hücre Toplama Odası Slaytları</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reaktifler</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR yumurta sarısı kesesi</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tüpü 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco'nun Eagle's Medium'un Modifikasyonu (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS</td><td>GenClone'u</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 İnce Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Görüntüleme Sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reaktifleri (100 Döngü) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 1000 Stereo Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Optik Tüp 8x Şerit (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Optik Tüp Kapağı 8x Şerit (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, HS24 Mikrosantrifüj, 24 x 1.5/2.0 mL rotorlu, 1 Santrifüj/Birim</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kantifikasyon Test Kitleri</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Standart Desen Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Teyp İstasyonu Yükleme ipuçları</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke %0.4</td> <td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Triple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı IKA MS3, 96 oyuklu numune plakası adaptörü</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table> ile

mutant bütün fare embriyolarının tek hücreli rna dizilimi: epiblasttan gastrulasyonun sonuna kadar

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Son on yılda, tek hücreli yaklaşımlar, örnekler içindeki gen ekspresyon dinamiklerini, hücre heterojenliğini ve hücre durumlarını incelemek için altın standart haline geldi. Tek hücreli ilerlemelerden önce, erken gelişim sırasında dinamik hücresel manzarayı ve hızlı hücre geçişlerini yakalamanın fizibilitesi sınırlıydı. Bu yazıda, embriyonik gün E6.5'ten E8'e kadar olan fare embriyoları üzerinde, gastrulasyonun başlangıcına ve tamamlanmasına karşılık gelen tek hücre ve çekirdek analizi yapmak için sağlam bir boru hattı tasarlanmıştır. Gastrulasyon, gelişim sırasında üç germinal tabakayı oluşturan temel bir süreçtir: organogenez için gerekli olan mezoderm, ektoderm ve endoderm. Yabani tip perigastrulan embriyolara uygulanan tek hücreli omikler hakkında kapsamlı literatür mevcuttur. Bununla birlikte, mutant embriyoların tek hücreli analizi hala azdır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır. Bu kısmen genotipleme ihtiyacı, zamanlanmış gebelikler, gebelik başına istenen genotiplere sahip embriyo sayısı ve bu aşamalarda embriyo başına hücre sayısı ile ilişkili teknik kısıtlamalardan kaynaklanmaktadır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmış bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yöntem, istenen genotiplerle daha yüksek senkronize gebelik şansı elde etmek için üreme ve zamanlanmış gebelik kılavuzları oluşturur. Embriyo izolasyon sürecindeki optimizasyon adımları, aynı gün genotipleme protokolü (3 saat) ile birleştiğinde, mikro damlacık bazlı tek hücrenin aynı gün gerçekleştirilmesine izin vererek, hücrelerin yüksek canlılığını ve sağlam sonuçları garanti eder. Bu yöntem ayrıca embriyolardan optimal çekirdek izolasyonları için kılavuzları içerir. Böylece, bu yaklaşımlar gastrulasyon aşamasındaki mutant embriyoların tek hücreli yaklaşımlarının uygulanabilirliğini arttırmaktadır. Bu yöntemin, mutasyonların gastrulanın hücresel manzarasını nasıl şekillendirdiğinin analizini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Bu yazıda tasarlanan metodoloji, özellikle E6.5'ten E8'e kadar tek hücreli omikler için embriyo örneklerinin hazırlanmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu sağlam boru hattı beş ana adımdan oluşur: senkronize zamanlanmış gebelikler, embriyo izolasyonları, aynı gün genotipleme, hücre ayrışması ve hücre canlılığının değerlendirilmesi (Şekil 1A). Sunulan veriler E7'den E7.5'e kadar olan zaman noktalarına odaklanırken, prosedürde küçük değişikliklerle (protokol boyunca notlara atıfta bulunulan) E8'e (Şekil 1B) kadar olan embriyolara uygulanabilir. Senkronize zamanlı gebelikler, iki dişi farenin bir erkek fare ile bir kafese yerleştirilmesiyle elde edildi. Vajinal tıkaçlar her sabah saat 10:00'dan önce kontrol edildi ve bir tıkaç gözlenirse, o gün öğlene kadar E0.5 olarak kabul edildi (Şekil 2A). Bu çalışmada, tıkaçlar için en uygun koşullar, kızgınlık veya proöstrus aşamasındaki bir dişi farenin, önceki üreme sırasında birkaç tıkaç başarıyla yerleştirme geçmişi olan bir erkekle eşleştirilmesini gerektirmiştir (Şekil 2B). Embriyo izolasyonları için sadece belirgin tıkaçlar düşünüldü (Şekil 2C).
Gelişimsel zamanlama, Şekil 2A'daki zaman çizelgesine göre tahmin edilmiştir. E7.5 için embriyo diseksiyonu, tıkaç tespit edildiği günü takip eden 7. günde saat 12'de başladı. Şekil 3 , E7.5'te başarılı bir embriyo izolasyonunu örneklemektedir. Gebe damına ötenazi uygulandıktan sonra uterus boynuzu diseke edildi, yaprak döken şişlik tek tek kesilerek embriyo ortaya çıkarıldı ve yumurta sarısı kesesi genotipleme için izole edildi (Şekil 3).
Aynı gün genotipleme, Şekil 4A'daki adımlar izlenerek embriyo izolasyonundan sonraki 3 saat içinde gerçekleştirildi. Embriyolar, bütünlüklerini korumak için genotipleme işlemi sırasında buz üzerinde tutuldu. Embriyo başına canlı hücre sayısını azaltacağı için embriyoları dondurmayın. Şekil 4B,C, viseral yumurta sarısı kesesini, parietal endodermal keseyi ve ilişkili maternal kanı ile ektoplasental koniyi göstermektedir. Genotipleme için viseral yolk kesesi kullanıldı (Şekil 4C). Yumurta sarısı kesesi sindirildikten sonra PCR karışımı hazırlandı ve PCR reaksiyonu çalıştırıldı. Elde edilen PCR ürünü daha sonra bir agaroz jeli üzerinde ayrıldı. Şekil 4D, LoxP ve vahşi tip aleller (sırasıyla 597 bp ve 498 bp) ve Cre aleli (650 bp) için beklenen parça boyutlarını göstermektedir. Şekil 4E'de, Cre ve LoxP (flox) alellerini taşıyan üreme çiftlerinden elde edilen 6 embriyodan yolk kesesi genotiplemesinin bir örneği sunulmuştur. Jeller, analiz edilen 6 embriyoda Cre ve LoxP alellerinin PCR ürünlerini göstermektedir. 2 ve 5 numaralı embriyolar 2 flox aleli ve 1 cre aleli taşır; bu nedenle, koşullu KO embriyoları olarak kabul edilirler (Şekil 4E, kırmızı noktalar). Embriyo 1 ve 3'ün 2 flox aleli vardır ancak Cre için negatiftir; Bu nedenle, flox kontrolleri olarak kabul edilirler. Embriyo 4, 2 flox aleline ve Cre aleli için soluk bir banda sahiptir, bu da "belirsiz" bir genotiple sonuçlanır. Bu embriyo daha fazla işlenmedi (alternatif olarak, deneyci, genotiplemeyi tekrarlamayı veya Cre eksprese eden hücreleri kullanarak koşullu KO'nun ikincil bir doğrulamasını gerçekleştirmeyi düşünebilir). Bu deneyde kullanılan Cre sürücüsünün viseral yolk kesesi15'te ifade edilmediğine dikkat etmek önemlidir; bu nedenle, LoxP alelleri, Cre-negatif olanlara kıyasla Cre-pozitif embriyoların jeli üzerinde kaymış görünmez.
Başarılı bir tek hücreli deney için hücre sayısı ve iyi canlılık gereklidir. Düşük hücre canlılığına, yüksek oranda ölü hücreye, topaklanmaya veya önemli kalıntılara sahip süspansiyonlar, daha sonraki işlemler için uygun değildir. En uygun koşullar, mikrolitre başına 700-1200 canlı hücre ve% &gt;90 canlılıktır. Şekil 5A , hem iyi hem de optimal olmayan hücre canlılığını gösteren bir panel sunmaktadır. Aynı kriterler, Şekil 5B'de gösterildiği gibi çekirdek izolasyonu için de uygulanabilir. Bununla birlikte, tripan mavisinin değerlendirilmesinin hücrelerden ve çekirdeklerden farklı olduğuna dikkat etmek çok önemlidir: canlı hücreler tripan mavisi içermezken, canlı çekirdekler içerir. Hücreler/çekirdek süspansiyonu optimalse (%&gt;90 canlılık), üreticinin prosedürlerini11 izleyerek mikroakışkan bir çip kullanarak tek hücreli bölmeye devam edin. Şekil 5C'de<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Öğrenin fare embriyolarından tek hücreli RNA dizilimi yöntemiyle gastrülasyon sürecindeki hücre kaderi kararlarını analiz etmeyi. Bu protokol mutant embriyolarda omik veri setleri oluşturmayı kolaylaştırır.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Daha fazla video keşfet