Name: İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Öğrenin, fare embriyoları ve endometriyal hücre hatları kullanılarak in vitro embriyo implantasyon modeli kurmayı. Yüksek östrojenin implantasyonu olumsuz etkilediğini, progesteronun ise bu etkileri hafiflettiğini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışmalarımız Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82171603), Şanghay Belediye Sağlık Komisyonu Vakfı (202140341), Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (23JC1403803) ve NHC ve Shanghai Key Labs, SIBPT İnovasyon Teşvik Programı (RC2023-02) tarafından desteklenmiştir.

Fare işleme ve deneysel çalışmalar, Şanghay Biyomedikal ve Farmasötik Teknolojiler Enstitüsü Hayvan Komitesi tarafından onaylanan protokoller altında gerçekleştirildi. Güvenlik Prosedürlerini Sağlayın: Kimyasalları veya biyolojik malzemeleri kullanırken daima uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın.
1. Fare embriyolarının elde edilmesi
NOT: Bu bölümde fare embriyolarının elde edilme süreci açıklanmaktadır. Yetişkin dişi fareler (6-8 haftalık, hibrit C57BL / 6 ve DBA / 2), 20-25 ° C'de ve% 40-60 nemde 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık standart çevre koşulları altında tutuldu.
<ol><li>Dişi farelere intraperitoneal olarak 10 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) enjekte edin ve daha sonra 42-48 saat aralıklarla 10 IU insan koryonik gonadotropin (HCG) enjekte edin.</li>
	<li>Her dişi fareyi benzer yaştaki bir erkekle eşleştirin ve ertesi sabah vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin. NOT: Vajinal tıkaç, meni vajinal açıklıkta katılaştıktan sonra oluşan açık sarı bir fitil yumrudur.</li>
	<li>Dişi fareleri CO2 inhalasyonu ile vajinal tıkaçlarla ötenazi yapın.</li>
	<li>Karnı açın ve kadın cinsel organını bulun; yumurta kanalı, yumurtalık ve yağ yastıkçıklarını forseps ile gerin; yumurta kanalını ve yumurtalığı makasla kesin; ve sonra yumurta kanalını ve uterusu kesin (Şekil 1).</li>
	<li>Elde edilen yumurta kanalını M2 ortamı ile önceden doldurulmuş 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın. NOT: M2 ortamı bir inkübatörde (37 °C, %5 CO2) 30 dakika önceden ısıtılmalıdır.</li>
	<li>Kümülüs-zigot kompleksini serbest bırakmak veya sıkıştırmak için yumurta kanalının genişlemiş ampullasını 25 G'lik bir iğne ile delin (Şekil 2).</li>
	<li>Kümülüs-zigot kompleksini 0.5 mg / mL hyaluronidaz içeren M2 çözeltisine aktarmak için forseps kullanın ve kümülüs hücreleri ayrışana kadar birkaç dakika inkübe edin (Şekil 3).</li>
	<li>Zigotları bir yumurta transfer pipeti kullanarak toplayın ve kalıntı hyaluronidaz, kümülüs hücreleri ve safsızlıkları gidermek için 2 mg / mL BSA içeren M4 ortamında yıkayın.</li>
</ol>2. Fare embriyosunun in vitro kültürü
NOT: Bu bölüm, fare embriyolarının zigotlardan blastosistlere kadar in vitro kültürleme sürecini detaylandırmaktadır. Sıcaklık ve gaz dengesini sağlamak için KSOM kültürü mikro damlaları 24 saat önceden hazırlanmalıdır.
<ol><li>35 mm'lik bir Petri kabının dibinde, her biri 20 μL hacme sahip 12 mikro damlacık KSOM ortamı hazırlayın. Mikro damlacıkları 3-5 mL mineral yağ ile örtün (Şekil 4) ve Petri kaplarını dengeleme için %5 CO2 ile 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Fare embriyolarını kapsamlı yıkama için bir transfer pipeti kullanarak M2 ortamından KSOM ortamına aktarın. NOT: Bu adım, 37 °C ısıtma aşamasına sahip bir stereomikroskop gerektirir. Kuluçka makinesinin dışındaki embriyo işleme süresini en aza indirin.</li>
	<li>Yıkanmış embriyoları hazırlanan KSOM mikro damlacıklarına yerleştirin ve 4 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Yeterli beslenmeyi sağlamak için, 20 μL mikro damla başına 5-10 embriyo kültürleyin.</li>
	<li>Avantajlı blastokistleri büyüklüklerine (100-130 μm), iç hücre kütlesine (iç hücre kütlesi hepsi sıkıştırılmış birçok hücreden oluşur), trofoblast hücrelerinin sayısına (trofektodermis birbirine bağlı ve birlikte paketlenmiş birçok hücreden oluşur) ve genişleme derecesine (blastocoel embriyonun %80-100'ünü kaplar) göre seçin.</li>
</ol>3. Endometrial hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Bir biyogüvenlik kabininin içinde, bir pipet kullanarak 1 mL %2 jelatini aspire edin ve 12 oyuklu bir kültür plakasına dağıtın. Alt kısmın jelatin ile tamamen kaplanmasını sağlamak için plakayı yavaşça döndürün. Plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca yerleştirin. Daha sonra fazla jelatini aspire edin ve plakanın tabanının tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Kaplama işlemi tamamlandıktan sonra, insan endometriyal adenokarsinom hücrelerini (Ishikawa) DMEM/F12 (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız), 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 100 μg/mL streptomisin ve 100 IU/mL penisilin ile kültürleyin, bunları jelatin kaplı 12 oyuklu plakalara (2 × 105hücre/oyuk) tohumlayın ve 24 saat inkübe edin.</li>
</ol>4. Embriyo bağlantısı
<ol><li>Ko-kültür için önceki adımda hazırlanan Ishikawa hücrelerini içeren 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 5-15 taze blastosisti nazikçe yerleştirin (Şekil 5).</li>
	<li>48 saatlik inkübasyondan sonra, bağlanma durumlarını değerlendirmek için embriyoları mikroskop altında gözlemleyin. Embriyo tutunmasını gözlemlemek için, plakayı üç kez hızlı bir şekilde hareket ettirin. Bağlanmamış embriyolar, Ishikawa hücrelerinin yüzeyi üzerinde yüzer veya yuvarlanma hareketi sergileyecektir.</li>
	<li>Denklem (1) kullanarak embriyo implantasyon oranını hesaplayın; İmplantasyon etkisini temsil etmek için embriyo yapışma oranını kullanın. Embriyo İmplantasyon Oranı = (Bağlı Embriyo / Toplam İmplante Edilen Embriyo Sayısı) × %100 (1)</li>
</ol>

Ishikawa Hücreleri ile İn Vitro Ko-Kültür Modelinde Embriyo Adezyonun Değerlendirilmesi

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

Yazarların beyan etmeleri gereken herhangi bir mali veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Embriyo implantasyonu için önerilen in vitro modelin basitliği ve hızlılığı, erken evre ilaç taraması ve diğer araştırma uygulamaları için dikkate değer avantajlar sunmaktadır. Basit protokol, Ishikawa hücre hatlarının yüksek verimli doğası ile birleştiğinde, özellikle ilaç keşfinin erken aşamalarında büyük ölçekli ekranlar için ideal bir aday haline getirir. Liang13, TAGLN2 yıkımının trofoblast hücrelerinin istila kabiliyetini azalttığını buldu. Green14, İnsülin benzeri büyüme faktörünün, fare embriyo-Ishikawa hücre sistemine dayalı olarak fare blastosistinin yapışma yetkinliğini geliştirdiğini gösterdi. Model sadece ilaç adaylarının hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda embriyo implantasyonunda rol oynayan sitokinler ve transkripsiyon faktörleri gibi diğer moleküllerin incelenmesini de kolaylaştırır15,16. Embriyo implantasyonunun üreme biyolojisindeki önemli etkileri göz önüne alındığında, bu model, altta yatan mekanizmaları anlamamızı ilerletmek ve yeni terapötikler geliştirmek için umut vaat etmektedir.
Mevcut in vitro model, embriyo implantasyonunu incelemek için değerli bir araç sağlarken, sınırlamalarını kabul etmek önemlidir. Bir 2D kültür sistemi olarak, hücre-hücre etkileşimlerini ve sinyal yollarını önemli ölçüde etkileyebilen 3D in vivo ortamın17 karmaşıklığından yoksundur. Bu nedenle, model, çeşitli moleküllerin embriyo adezyonu üzerindeki etkilerine dair ilk bilgileri sağlayabilirken, in vivo çalışmaların yerini almaktan ziyade bir tarama aracı olarak görülmelidir. Gelecekteki yönelimler, endometriyum18'in karmaşık mikro ortamını daha iyi özetleyen, ilaç tepkilerinin ve moleküler mekanizmaların daha doğru tahminlerini sağlayan fizyolojik olarak daha ilgili 3D kültür sistemlerinin geliştirilmesini içerebilir. Ek olarak, fizyolojik alaka düzeyini ve tahmin yeteneklerini daha da geliştirmek için bu modelin mikroakışkanlar ve çip üzerinde organ sistemleri19,20 gibi diğer ileri teknolojilerle entegrasyonunu araştırmak faydalı olacaktır.
Yardımcı üreme tedavisi sürecinde süperovülasyon, yumurtalıklardaki yumurta üretimini arttırmayı ve böylece hamilelik şansını artırmayı amaçlar. Bununla birlikte, bu prosedür östrojen seviyelerinde normal fizyolojik eşiği aşan belirgin bir artışa neden olabilir. Kadın üremesinde hayati bir hormon olan östrojen, endometriyal proliferasyonu teşvik etmekten ve embriyo implantasyonu için elverişli bir ortam yaratmaktan sorumludur. Ek olarak, progesteron da dahil olmak üzere diğer üreme hormonlarının dengesini düzenler. Bir in vitro model kullanarak, bulgularımız östrojen konsantrasyonundaki bir artışın başlangıçta embriyo implantasyon oranlarını arttırırken, fizyolojik aralığın ötesindeki aşırı yüksek seviyelerin bu süreci önemli ölçüde engellediğini ortaya koymaktadır. Özellikle, progesteron takviyesi bu inhibitör etkiye etkili bir şekilde karşı koyabilir. Bu gözlemler, süperovulasyon sırasında anormal derecede yüksek östrojen seviyelerinin, donmuş embriyo transferlerine kıyasla taze embriyo transferleri ile ilişkili klinik olarak gözlenen daha düşük implantasyon oranlarına katkıda bulunan bir faktör olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, transplantasyon sonrası progesteron takviyesi, embriyo implantasyon başarı oranlarını arttırmada umut vaat etmektedir.
Embriyo implantasyonu tespiti için basit, uygun maliyetli ve güvenilir bir yaklaşım oluşturduk. Fare embriyoları, in vitro kültür yoluyla blastosist aşamasına ulaştıktan sonra, Ishikawa hücreleri ile birlikte kültürlendi. Bu deney düzeneği, embriyo implantasyonunun erken aşamalarında sitokinler, ilaçlar ve transkripsiyon faktörleri gibi çeşitli moleküllerin rolünün ve işlevinin incelenmesine izin verir. Ishikawa hücreleri gibi yerleşik hücre hatları, insan veya fare embriyoları ile eşleştirildiğinde fizyolojik olarak en ilgili model sistemleri sağlayamasa da, uyarlanabilirlikleri ve yüksek verim yetenekleri, onları erken aşama büyük ölçekli ilaç taraması için ideal kılar. Kurduğumuz 2D in vitro kültür modelleri daha fazla optimizasyon gerektirse de, ideal endometriyal modelleme için bir temel oluştururlar.

Başarılı bir gebeliğin ilk adımı olan embriyo implantasyonu, biyolojik temelini anlamak ve kısırlığın zorluklarını ele almak için çok önemlidir. Bununla birlikte, etik kısıtlamalar, insan klinik embriyo örneklerinin toplanmasında önemli sınırlamalar getirmekte ve hamileliğin erken döneminde insan embriyoları ile endometriyum arasındaki karmaşık etkileşimlere ilişkin araştırmaları engellemektedir1. Bu karmaşık mekanizmaların derinlemesine anlaşılması, temel biyolojik araştırmaları, ilaç keşfini ve üreme sağlığını ilerletmek için hayati önem taşır.
Önceki in vitro modeller, tek katmanlı insan endometriyal epitel hücrelerinin (RL95-2)2 BeWo, JAr veya Jeg-33 koryokarsinom hücreleri gibi embriyonik ikamelerle birlikte kültürlendiği adezyon modellerini kullandı. Bununla birlikte, 70-100 μm arasında değişen sferoidlerin boyutunun seçimi, daha büyük veya daha küçük hücre agregatları deneyin doğruluğunu tehlikeye atabileceğinden çok önemliydi. Özellikle, her preparattaki sferoidlerin sadece% 25'i uygunboyut 4 standardını karşıladı ve blastosistlerin fizyolojik koşullarına kıyasla önemli farklılıklar vardı.
Ayrıca, endometriyum ve blastosist için üç boyutlu (3D) kültür sistemleri fizyolojik olarak daha ilgili bir ortam sunar5, ancak yüksek teknik uzmanlık, yavaş hücre büyümesi, yüksek kaynak ve bakım maliyetleri, standardizasyon zorluğu ve düşük tekrarlanabilirlikgerektirir 6.
Bu protokolde, çoğu laboratuvarda geliştirilebilecek ve kullanılabilecek uygun maliyetli ve hızlı bir in vitro embriyo implantasyon modeli sunuyoruz. Bu yöntemin genel amacı, kontrollü bir ortamda embriyolar ve endometriyum arasındaki etkileşimleri incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir platform sağlamaktır. Bu model, in vitro embriyo implantasyonunun temel olaylarını simüle ederek, hayvan modelleri ile klinik ortamlar arasındaki boşluğu doldurmayı ve daha kesin ve hedefli araştırmaları mümkün kılmayı amaçlamaktadır.
Embriyonik ikamelerle karşılaştırıldığında, fare blastosistlerinin kullanımı, in vivo embriyo implantasyon sürecinin fizyolojik olarak daha ilgili bir temsilini sunar7. Ek olarak, insan endometriyal adenokarsinomundan türetilen Ishikawa hücre hattı, glandüler epitel ve uterus lümen epitel1'in karışık özelliklerine sahiptir, bu da normal endometriyumda bulunanlara benzer enzimleri, yapısal proteinleri ve fonksiyonel steroid reseptörlerini eksprese etmesini sağlar, böylece embriyo implantasyonu için fizyolojik olarak ilgili bir substrat sağlar. Ko-kültür sisteminin basitliği ve hızlılığı, yüksek verimli tarama ve uyuşturucu testi yapılmasını mümkün kılar 8,9,10. Bu yöntem, sağlam ve tekrarlanabilir bir platform sağlayarak, embriyo implantasyonu ve bunun insan sağlığı üzerindeki etkisi hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için bir fırsat sunar.

<table><tbody><tr><td>17-β-estradiol</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>En güçlü memeli östrojenik hormonu</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>Bakteriyolojik Petri Kapları 35 x 10 mm stil, sıkı kapaklı, kristal dereceli saf polistiren, steril</td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td>ESCO</td><td>sınıfı <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/66873/66873eq01.jpg" style="margin: auto; ">BSC</td><td>Aseptik işlemler, kültür yemekleri yapma, reaktifleri alikot etme vb</td></tr><tr><td>. CO2 İnkübatör</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>Embriyo kültürü</td></tr><tr><td>Kültür plakası</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x), sıvı 1:1, L-glutamin ve 15 mM HEPES tamponu içerir</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, Avustralya Menşeli</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>Tip B, toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>Sterilizasyon reaktifi, intraperitoneal enjeksiyon, 50 IU / mL</td></tr><tr><td>Hyaluronidaz </td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>Reaktif sınıfı, toz ve nbsp;</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), Toz, Fenol Kırmızısı olmadan, 5 x 10 mL</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutamin-200 mM (100x), sıvı</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Orta (1x), Sıvı, Fenol Kırmızısı Mineral</td></tr><tr><td>yağ ile </td><td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>Mineral yağ, çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında buharlaşma ve çapraz kontaminasyonu kontrol etmek için bir örtü tabakası olarak kullanıma uygundur</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, sıvı</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10.000 Birim penisilin (baz) ve 10.000 birim streptomisin (baz), %0.85 tuzlu su PMSG içinde penisilin G (sodyum tuzu) ve streptomisin sülfat kullanarak</td></tr><tr><td></td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>Sterilizasyon reaktifi, intraperitoneal enjeksiyon, 50 IU / mL</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>Adet döngüsünün ikinci yarısında korpus luteum tarafından salgılanan steroid hormonu</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Sodyum piruvat, glikoza ek olarak bir karbon kaynağı olarak hücre kültürü ortamına yaygın olarak eklenir</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Embriyo toplama ve embriyo gelişiminin gözlemlenmesi</td></tr></tbody></table>

İn vitro embriyo İmplantasyon modelinin kurulması

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Embriyo implantasyonu, başarılı bir gebeliğin kurulmasında ilk adımdır. Embriyo implantasyonu için bir in vitro model, temel biyolojik araştırma, ilaç geliştirme ve tarama için kritik öneme sahiptir. Bu makale, embriyo implantasyonu için basit, hızlı ve oldukça verimli bir in vitro model sunmaktadır. Bu protokolde ilk olarak fare blastokisti edinimi ve insan endometriyal adenokarsinom hücrelerinin (Ishikawa) implantasyon için hazırlığı tanıtıldı, ardından fare embriyoları ve Ishikawa hücreleri için ko-kültür yöntemi uygulandı. Son olarak, bu modele dayalı olarak değişen 17-β-estradiol (E2) ve progesteron (P4) konsantrasyonlarının embriyo adezyon oranları üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir çalışma yaptık. Bulgularımız, yüksekE2 konsantrasyonlarının embriyo adezyonunu önemli ölçüde azalttığını, progesteron ilavesinin ise adezyon oranını geri getirebileceğini ortaya koydu. Bu model, implantasyonu ve endometriyal alıcılığı kontrol eden sitokinler, ilaçlar ve transkripsiyon faktörleri gibi adezyon sürecinde yer alan molekülleri değerlendirmek ve taramak için basit ve hızlı bir platform sunar.

Yardımcı üreme teknikleri sürecinde, kontrollü yumurtalık hiperstimülasyonu (COH) çok önemli bir adımdır ve hastalarda östrojen seviyelerinin doğal döngülere kıyasla 10-20 kattan fazla önemli ölçüde artmasına neden olur11. Bu bağlamda, yüksek serum östrojen konsantrasyonlarının taze embriyo transferi sırasında embriyo implantasyonunu etkileyip etkilemediğini sorduk. Bu embriyo implantasyon modeline dayanarak,çeşitli E2 ve P4 konsantrasyonlarının embriyo implantasyon oranları üzerindeki etkilerini inceledik12. Açlık tedavisinden sonra, Ishikawa hücreleri E2 (0, 0.1, 1, 10 ve 100 nM) veya E2 ve P4 (0-0, 100-0, 100-10 ve 100-100 nM) kombinasyonu ile 48 saat boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra jelatin kaplı 12 oyuklu plakalara aktarıldı ve her oyuğa 5-15 blastosist eklendi. Her grup 3 kez tekrarlandı ve implantasyon oranları 48 saat sonra belirlendi.
Sonuçlar, E2'nin (10 nM) fizyolojik konsantrasyonlarının, 0 nM E2'ye kıyasla embriyo implantasyon oranlarını artırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, ultra yüksekE2 konsantrasyonları (100 nM) embriyo implantasyon oranlarını önemli ölçüde azaltmıştır. P4 ilavesi, doza bağlı olarak, ultra yüksekE2'nin implantasyon üzerindeki olumsuz etkilerini hafifletmiştir (Şekil 6). Bu in vitro modele dayanarak, fizyolojik olmayan ultra yüksek östrojen konsantrasyonlarının embriyo implantasyonu üzerindeki olumsuz etkilerini gösteriyoruz ve bu modelin bilimsel araştırmalarda uygulanmasını daha da tanıtıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg"> Resim 1: Fare yumurta kanalının eksizyonu. Yumurta kanalını, yumurtalığı ve yağ yastıkçıklarını forseps ile gerin ve önce yumurta kanalını ve yumurtalığı makasla kesin ve ardından yumurta kanalını rahimden çıkarın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg"> Resim 2: Zigot alımı. Fallop tüpünün genişleme ampullası, kümülüs-zigot kompleksini serbest bırakmak için forseps ile delinir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg"> Şekil 3: Hyaluronidaz sindirimi ile çıplak zigotların izolasyonu. Forseps kullanarak, kümülüs-zigot kompleksini 0.5 mg / mL hyaluronidaz içeren M2 çözeltisine dikkatlice aktarın ve kümülüs hücreleri zigotlardan ayrılana kadar birkaç dakika bekletin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg"> Şekil 4: Fare embriyosunun in vitro kültürü. Her biri 20 μL hacme sahip 12 mikro damlacık KSOM ortamı hazırlayın. Mikro damlacıkları 3-5 mL mineral yağ ile örtün. Fare embriyolarını iyice yıkamak için M2 ortamından KSOM mikro damlacıklarının üst yarısına aktarın, yıkanmış embriyoları alt yarıya yerleştirin ve 4 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg"> Şekil 5: Embriyo implantasyonu. Ko-kültür için Ishikawa hücreleri içeren 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yavaşça 5-15 taze blastosist yerleştirin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, plakayı hızlı bir şekilde 3x hareket ettirin. Bağlanmamış embriyolar, Ishikawa hücrelerinin yüzeyi üzerinde yüzer veya yuvarlanma hareketi sergileyecektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg"> Şekil 6: Ultra yüksek konsantrasyonlu östrojenin embriyonun implantasyon oranı üzerindeki etkisi. Yıldız işareti, istatistiksel olarak anlamlı bir farkı gösterir, P &lt; 0.05. Kısaltmalar: E2 = estradiol; P4 = progesteron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, embriyo implantasyon sürecini etkileyen ilgili molekülleri değerlendirmek için in vitro model olarak basit ve verimli embriyo implantasyonu oluşturmak için metodolojileri açıklar.

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

establishment-of-an-embryo-implantation-model-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir in ovo model oluşturmak için kanser hücrelerinin bir tavuk koryoallantoik zarına implantasyonunu açıklıyoruz. Model, jinekolojik kanserin ilerlemesini incelemek için yumurtalık kanseri hücrelerini başarıyla aşılar.

Tavuk Korioallantoik Membran Tabanlı Kanser Modellemesi: Kanser Hücresi Tümörigenezi ve Metastazı Çalışmak İçin Bir In Ovo Model

Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

Destekli üreme teknikleri (ARTs) sonuçları geliştirmek ve ilişkili riskleri azaltmak için sürekli değerlendirme içindedir. Bu yazıda, tavşanların insan üreme açısından ideal bir hayvan modeli olarak kullanımına izin veren, verimli bir ağoprezervasyon protokolüyle minimal invaziv bir embriyo transfer prosedürü açıklanmaktadır.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Preimplantasyon Genetik testlerini verimli bir şekilde yürütmek için blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gereklidir. Zona pellucida ve 7-8 troectoderm hücrelerinin alma gün 5-7 Post-döllenme sıralı açılışı gerektiren bir yaklaşım, hem gerekli manipülasyonlar sayısını ve alt optimum çevresel koşullara embriyonun maruz kalma sınırlar.

İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.

Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro döllenme ve ardından blastosist evresine kadar embriyo kültürü prosedürlerini açıklar.

Fare Oositleri In Vitro Olgunlaşma, Döllenme ve Preimplantasyon Embriyolarının Kültürü

Christopher CW Hughes in vitro anjiyogenez çalışmak için onun kültür sistemi yardımcı programı açıklanır. O dalı, uygun lümen formu ve anastomozlarında tabi kültür damarların endotel hücreleri oluşturmak için kritik bir, henüz tanımlanmamış, çözünür faktörü salgılayan fibroblastlar önemini açıklar.

Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Öğrenin, fare embriyoları ve endometriyal hücre hatları kullanılarak in vitro embriyo implantasyon modeli kurmayı. Yüksek östrojenin implantasyonu olumsuz etkilediğini, progesteronun ise bu etkileri hafiflettiğini keşfedin.

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

Daha fazla video keşfet